Identification of Angiogenesis-Related Prognostic Biomarkers Associated With Immune Cell Infiltration in Breast Cancer

識別與乳腺癌免疫細(xì)胞浸潤有關(guān)的血管生成相關(guān)的預(yù)后生物標(biāo)志物

發(fā)表期刊：Front Cell Dev Biol

發(fā)表日期：2022 May 6

影響因子：6.081

DOI:? 10.3389/fcell.2022.853324

一、研究背景

????????乳腺癌的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)不斷增加韭邓，并已成為婦女最常見的癌癥類型。血管生成是一個從原有血管形成新血管的復(fù)雜過程台妆。當(dāng)支持和反對血管生成的因素之間的平衡被破壞時沙廉，病理性的血管生成迅速發(fā)展拘荡，幫助癌細(xì)胞適應(yīng)細(xì)胞代謝以應(yīng)對其高增殖率，使腫瘤更具侵略性蓝仲。

????????血管生成調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生的機制非常復(fù)雜俱病，沒有得到充分的闡明。越來越多的證據(jù)表明袱结，血管生成可能通過與腫瘤免疫微環(huán)境（TIME）的相互作用參與癌癥的進展亮隙。免疫監(jiān)視系統(tǒng)在清除異常細(xì)胞和防止癌癥發(fā)展方面發(fā)揮著重要作用。

二垢夹、材料與方法

1溢吻、 數(shù)據(jù)來源

1）從TCGA數(shù)據(jù)庫獲取1049個原發(fā)性乳腺癌和111個鄰近正常組織樣本的RNA-Seq基因表達數(shù)據(jù)

2）從GEO數(shù)據(jù)庫下載了GSE7390數(shù)據(jù)集的198個原發(fā)性腫瘤樣本和GSE88770數(shù)據(jù)集的117個原發(fā)性腫瘤樣本的基因表達數(shù)據(jù)

3）ARG集從分子特征數(shù)據(jù)庫（MSigDB）中獲得

2、 分析流程

1）識別差異表達的ARG：用limma軟件包識別了TCGA-BRCA數(shù)據(jù)集中1049個乳腺癌組織和111個鄰近正常組織之間的差異表達基因（DEGs）果元，與從MSigDB數(shù)據(jù)庫下載的ARG取交集后促王，確定了差異表達的ARG并用于進一步分析

2）識別乳腺癌中關(guān)鍵的預(yù)后ARG：單變量Cox比例風(fēng)險回歸分析、多變量Cox回歸分析確定了乳腺癌中四個關(guān)鍵的預(yù)后ARG（TNFSF12而晒、TNNI3蝇狼、SCG2和COL4A3）

3)將TCGA隊列樣本隨機分為訓(xùn)練集和驗證集

4）風(fēng)險得分模型和nomogram的構(gòu)建：根據(jù)風(fēng)險評分的中值，將乳腺癌患者分為高風(fēng)險組和低風(fēng)險組倡怎；生存分析迅耘；使用多變量Cox回歸分析構(gòu)建了一個nomogram，供臨床使用

5）生物學(xué)功能分析：使用clusterProfiler R軟件包來分析高風(fēng)險組和低風(fēng)險組之間的GO和KEGG路徑富集程度监署；進行了基因集富集分析（GSEA）

6）預(yù)后特征與免疫細(xì)胞浸潤之間的相關(guān)性：CIBERSORT颤专、xCell和單樣本GSEA（ssGSEA）；計算了差異顯著的富集的免疫細(xì)胞類型和預(yù)后ARG之間的Pearson相關(guān)性

7）ceRNA網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建：確定低風(fēng)險組和高風(fēng)險組之間差異表達的miRNAs和lncRNAs钠乏；計算差異表達的miRNAs的表達與四個預(yù)后生物標(biāo)志物的表達之間的相關(guān)性栖秕，并選擇負(fù)相關(guān)的miRNA-mRNA對；使用miRanda數(shù)據(jù)庫來預(yù)測針對四個預(yù)后生物標(biāo)志物的miRNAs

三晓避、實驗結(jié)果

01 - 基于ARG的預(yù)后風(fēng)險評分模型的構(gòu)建和驗證

????????在腫瘤和相鄰的正常組織樣本之間共鑒定了4003個DEGs簇捍，包括1241個上調(diào)的基因和2762個下調(diào)的基因只壳。確定了18個差異表達的ARG，包括在腫瘤樣本中相對于鄰近正常組織樣本的3個上調(diào)和15個下調(diào)的ARG（圖1A）垦写。

????????此后吕世，通過單變量Cox回歸分析探討了在BC中發(fā)現(xiàn)的18個ARG的預(yù)后價值。在這個階段的分析中梯投，不包括臨床病理因素（如等級命辖、淋巴結(jié)狀態(tài)和腫瘤大小等）。結(jié)果顯示分蓖，TNFSF12尔艇、TNNI3、SCG2和COL4A3與預(yù)后顯著相關(guān)么鹤，其中TNFSF12终娃、TNNI3和COL4A3起保護作用，SCG2起危險因素作用（圖1B）蒸甜。利用這四個基因進行多變量的Cox回歸分析棠耕，以獲得更穩(wěn)健的特征基因。TNFSF12柠新、TNNI3窍荧、SCG2和COL4A3仍與預(yù)后密切相關(guān)，并被確定為關(guān)鍵預(yù)后基因（圖1C）恨憎。此外蕊退，根據(jù)這四個基因特征構(gòu)建了一個診斷性的LR模型，發(fā)現(xiàn)LR模型在訓(xùn)練集（圖1D）和驗證集（圖1E）中對乳腺癌患者的分類都有良好的表現(xiàn)憔恳。

圖1 對乳腺癌患者具有預(yù)后和診斷價值的ARG的鑒定

????????根據(jù)TNFSF12瓤荔、TNNI3、SCG2和COL4A3的系數(shù)钥组，計算出各個患者的風(fēng)險分?jǐn)?shù)输硝。根據(jù)TCGA訓(xùn)練集中患者風(fēng)險評分的中位數(shù)，分為高風(fēng)險組和低風(fēng)險組（圖2A）程梦。在這兩組之間觀察到了5年總生存率的明顯差異（圖2B）腔丧。高危組和低危組的TNFSF12、TNNI3作烟、SCG2和COL4A3的表達和臨床特征顯示在熱圖中（圖2C）。ROC曲線顯示砾医，風(fēng)險評分模型被證明在預(yù)測BC患者的生存率方面具有明顯的力量拿撩。ROC曲線下的面積（AUC）在3年和5年的總生存期中分別為0.643和0.609（圖2D）。在GSE7390和GSE88770驗證集中也得到了一致的結(jié)果如蚜。

圖2 基于TCGA數(shù)據(jù)集的乳腺癌患者的四個ARG特征的風(fēng)險評分模型的開發(fā)

????????然后压恒，調(diào)查了風(fēng)險評分與臨床特征之間的關(guān)系影暴，包括年齡、分期探赫、雌激素受體（ER）型宙、孕激素受體（PR）和人表皮生長因子受體2（HER2）狀態(tài)。發(fā)現(xiàn)伦吠，晚期T階段和HER2陽性狀態(tài)的乳腺癌患者有較高的風(fēng)險得分（圖3A妆兑，B），而其他組的風(fēng)險得分沒有明顯差異毛仪。此外搁嗓，作者進一步研究這種基于ARG的評分模型是否能在不同的分子亞型中發(fā)揮作用，包括激素受體（HR）陽性/HER2陰性箱靴、HER2陽性和TNBC腺逛。結(jié)果顯示，在所有亞型中衡怀，低風(fēng)險患者的生存期明顯延長（圖3C-E）棍矛。

圖3 不同乳腺癌亞型的臨床病理特征與ARG風(fēng)險評分和總生存分析的關(guān)系

02 - nomogram的構(gòu)建和分析

????????此外，作者以上述臨床特征和風(fēng)險評分為因素進行多變量分析抛杨，構(gòu)建nomogram（圖4A）够委。進行ROC分析以評估模型的預(yù)后價值。模型的曲線下面積（AUC）在1年時為0.865蝶桶，3年時為0.818慨绳，5年時為0.820，7年時為0.767（圖4B）真竖。1年脐雪、3年、5年和7年的OS概率的校準(zhǔn)曲線顯示恢共，nomogram預(yù)測和實際觀察之間具有良好的一致性（圖4C-F）战秋，表明nomogram的臨床應(yīng)用。

圖4 預(yù)測乳腺癌患者總生存概率的nomogram

03 - 四個預(yù)后性ARG和DEGs在低風(fēng)險和高風(fēng)險組的生物功能分析

????????首先讨韭，對這四個預(yù)后性ARG進行了功能富集分析脂信。結(jié)果表明，COL4A3透硝、SCG2和TNFSF12參與了調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞增殖的途徑狰闪。TNNI3、SCG2和TNFSF12參與了血管形態(tài)發(fā)生濒生、血管發(fā)育埋泵、脈管發(fā)育和管子形態(tài)發(fā)生的途徑。此外，在低風(fēng)險組和高風(fēng)險組之間發(fā)現(xiàn)了57個DEGs丽声，包括9個上調(diào)的基因和48個下調(diào)的基因（圖5A）礁蔗。為了探索所強調(diào)的分子機制，對DEGs進行了GO分析和KEGG通路富集分析雁社。前20個GO術(shù)語和前20個KEGG途徑（圖5B）浴井，包括生物過程（圖5C）、細(xì)胞成分（圖5D）和分子功能（圖5E）霉撵，都顯示在柱狀圖中磺浙。此外，GSEA分析顯示喊巍，DEGs參與了許多免疫相關(guān)的生物過程屠缭，包括T細(xì)胞激活（圖6A）、免疫反應(yīng)的激活（圖6B）崭参、白細(xì)胞遷移（圖6C）和淋巴細(xì)胞激活的調(diào)節(jié)（圖6D）呵曹。

圖5 低風(fēng)險組和高風(fēng)險組之間DEGs的功能注釋

圖6 GSEA分析在低風(fēng)險和高風(fēng)險組中富集的生物過程

04 - 免疫細(xì)胞浸潤和預(yù)后生物標(biāo)志物之間的相關(guān)性

????????作者探討了免疫細(xì)胞與乳腺癌中四個預(yù)后生物標(biāo)志物之間的相關(guān)性。為了獲得更全面的結(jié)果何暮，使用不同的方法來評估低風(fēng)險和高風(fēng)險組的免疫細(xì)胞浸潤奄喂。如CIBERSORT，記憶B細(xì)胞海洼、CD8 T細(xì)胞跨新、濾泡輔助T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T（Tregs）細(xì)胞和單核細(xì)胞在低風(fēng)險組中明顯升高坏逢，而靜止記憶CD4 T細(xì)胞域帐、M2巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的浸潤在高風(fēng)險組中明顯升高（圖7A）。TNFSF12與記憶B細(xì)胞是整、單核細(xì)胞肖揣、M2巨噬細(xì)胞和CD8 T細(xì)胞明顯正相關(guān)。TNNI3與靜止的記憶性CD4 T細(xì)胞呈明顯的負(fù)相關(guān)浮入。SCG2與靜止記憶CD4 T細(xì)胞和M2巨噬細(xì)胞明顯正相關(guān)龙优，與濾泡輔助T細(xì)胞明顯負(fù)相關(guān)。COL4A3與濾泡輔助T細(xì)胞事秀、CD8 T細(xì)胞和記憶B細(xì)胞明顯正相關(guān)彤断，與中性粒細(xì)胞和M2巨噬細(xì)胞明顯負(fù)相關(guān)（圖7B）。至于xCell和ssGSEA分析易迹，發(fā)現(xiàn)12種和15種免疫細(xì)胞類型分別在低風(fēng)險組和高風(fēng)險組之間有明顯的差異分布（圖7C,E）宰衙。同時，預(yù)后生物標(biāo)志物和差異分布的免疫細(xì)胞之間的關(guān)系顯示在熱圖中（圖7D睹欲，F(xiàn)）供炼。

圖7

05 - 構(gòu)建基于預(yù)后生物標(biāo)志物的ceRNA網(wǎng)絡(luò)

????????最后，根據(jù)四個預(yù)后生物標(biāo)志物構(gòu)建了一個ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在低風(fēng)險組和高風(fēng)險組之間確定了158個不同表達的miRNAs（圖8A）劲蜻。然后，計算差異表達的miRNAs的表達與四個預(yù)后生物標(biāo)志物的表達之間的相關(guān)性考余，共得到294個負(fù)相關(guān)的miRNA-mRNA對先嬉。通過miRanda與預(yù)測的miRNA-mRNA對重疊后，共確定了111個miRNA-mRNA對供進一步使用楚堤。同時疫蔓，在低風(fēng)險組和高風(fēng)險組之間確定了3,718個差異表達的lncRNAs（圖8B）。3,454個lncRNAs的表達與至少一個預(yù)后生物標(biāo)志物呈正相關(guān)身冬，并得到713個負(fù)相關(guān)的lncRNA-miRNA對衅胀。通過miRanda與預(yù)測的lncRNA-miRNA對重疊后，共確定了518個lncRNA-miRNA對供進一步使用酥筝。然后滚躯，使用Cytoscape軟件，通過過濾掉節(jié)點的度數(shù)<5嘿歌，構(gòu)建并可視化ceRNA網(wǎng)絡(luò)（圖8C）掸掏。

圖8 基于四個預(yù)后生物標(biāo)志物的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

四、結(jié)論

????????綜上所述宙帝，本研究旨在探討ARG的預(yù)后價值及其與乳腺癌患者免疫細(xì)胞浸潤的聯(lián)系丧凤。作者確定了乳腺癌中四個預(yù)后性的ARG生物標(biāo)志物，并建立了一個準(zhǔn)確的風(fēng)險模型和nomogram來預(yù)測乳腺癌患者的生存步脓。此外愿待，還發(fā)現(xiàn)免疫細(xì)胞浸潤可能作為血管生成和乳腺癌之間的紐帶。