骨肉瘤（Osteosarcoma, OS）是一種高侵襲性骨腫瘤，主要影響兒童和青少年怀泊。這種惡性腫瘤與不良臨床結(jié)果相關(guān)国旷，尤其是肺轉(zhuǎn)移。由于其罕見性和生物學(xué)異質(zhì)性，對其分子基礎(chǔ)研究有限路翻，阻礙了有效療法的發(fā)展狈癞。WW結(jié)構(gòu)域氧化還原酶（WW domain-containing oxidoreductase，WWOX）是一種在人骨肉瘤中經(jīng)常發(fā)生變化的基因帚桩，使用Osterix1-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠雙敲除Wwox和Trp53（DKO）已被證明可加速骨肉瘤發(fā)展亿驾。

2024年1月5日，以色列耶路撒冷希伯來大學(xué)醫(yī)學(xué)院Rami I. Aqeilan團隊在《cell death & disease》雜志發(fā)表題為“WWOX promotes osteosarcoma development via upregulation of Myc”的研究論文账嚎。本研究通過構(gòu)建一個可追蹤的骨肉瘤小鼠模型莫瞬，研究了WWOX基因在骨肉瘤發(fā)展中的作用，尤其是Myc基因及其靶基因MCM7的調(diào)控機制郭蕉。研究結(jié)果表明疼邀，BM MSC可能是骨肉瘤的起源細(xì)胞，且Myc和其靶基因可能是骨肉瘤發(fā)生的早期分子事件召锈，這為骨肉瘤的早期診斷和治療提供了新的視角旁振。

標(biāo)題：WWOX promotes osteosarcoma development via upregulation of Myc（WWOX基因通過上調(diào)Myc促進(jìn)骨肉瘤發(fā)展）

時間：2024-1-5

期刊：cell death & disease

影響因子：IF 9

技術(shù)平臺：ChIP-seq、RNA-seq等

研究摘要

本研究構(gòu)建了一個可追蹤的骨肉瘤小鼠模型涨岁，該模型通過單敲除Trp53（SKO）或雙敲除Wwox/Trp53（DKO）并表達(dá)tdTomato報告基因拐袜。通過追蹤不同時間點的Tomato表達(dá)，研究者在非骨肉瘤攜帶小鼠骨髓（bone marrow）間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells ,MSC) （young BM梢薪，年輕BM）中檢測到早期的tdTomato陽性細(xì)胞蹬铺。分析結(jié)果表明雙敲除年輕BM細(xì)胞（DKO yBM）在體外和體內(nèi)均表現(xiàn)出致瘤特性，這些雙敲除年輕BM細(xì)胞的分子和細(xì)胞表征揭示了其與骨肉瘤腫瘤細(xì)胞的相似性秉撇。與單基因敲除年輕BM細(xì)胞相比甜攀，雙基因敲除年輕BM細(xì)胞中觀察到Myc及其靶基因上調(diào)的轉(zhuǎn)錄組變化。Myc的染色質(zhì)免疫沉淀測序（ChIP-seq）分析揭示了Myc在雙敲除年輕BM細(xì)胞中對Myc靶基因的富集增加琐馆，而Myc靶基因在雙敲除的年輕BM細(xì)胞中上調(diào)规阀。雙敲除年輕BM細(xì)胞中WWOX的恢復(fù)降低了Myc蛋白水平。相對于單敲除年輕BM細(xì)胞瘦麸，MCM7（Myc的一個已知靶基因）在雙敲除年輕BM中上調(diào)谁撼。使用辛伐他汀（simvastatin）抑制MCM7表達(dá)導(dǎo)致雙敲除young BM細(xì)胞的增殖和腫瘤細(xì)胞生長減少滋饲。研究結(jié)果揭示了BM間充質(zhì)干細(xì)胞（BM MSCs）是研究骨肉瘤和Myc及其靶標(biāo)作為WWOX效應(yīng)器和骨肉瘤發(fā)生過程中早期分子事件彤敛。

?研究結(jié)果

（1）構(gòu)建可追蹤的骨肉瘤小鼠模型

圖1：可追蹤的骨肉瘤細(xì)胞小鼠模型 A.實驗骨肉瘤（OS）小鼠模型的示意圖。 B.Cre陰性（Cre-），Cre陽性（Cre+ WT）和雙敲除（DKo tom）小鼠的基因組PCR。左panel的標(biāo)簽表示引物對静浴，右panel的標(biāo)簽表示預(yù)期的條帶大小即横。 C.從（1）Cre陰性小鼠，（2）Cre+ WT小鼠阵翎，（3）DKO TOM小鼠提取的骨骼熒光顯微鏡圖像逢并。 D.來自Cre-之剧，Cre+ WT和DKO TOM小鼠的冷凍骨切片的免疫熒光圖像。紅色信號代表內(nèi)源性tdTomato砍聊，藍(lán)色信號代表核染色hoechst背稼。 E.2月齡（2m）的Cre-，Cre+ WT和DKO TOM小鼠BM細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析玻蝌。10.2±2.3表示與同齡Cre-小鼠相比蟹肘，Cre+ WT和DKO BM中tdTomato陽性細(xì)胞百分比。 F.在Cre+ WT和DKO BM細(xì)胞中俯树，免疫印跡分析對p53帘腹、WWOX、p21和tdTomato蛋白在未電離輻射暴露（0分鐘）及電離輻射暴露（IR-10Gy）（30分鐘和120?分鐘）的表達(dá)许饿。（相對于Cre+ WT的定量印跡分析）阳欲。 WT：野生型，DKO：雙敲除陋率，BF：bright field球化，RFP：紅色熒光蛋白（red fluorescent protein），BM：骨髓（bone marrow）瓦糟。

（2）OS小鼠的骨髓（BM）細(xì)胞具有致瘤性

圖2：OS小鼠的BM細(xì)胞具有致瘤性并表現(xiàn)出轉(zhuǎn)移性筒愚。 A.從Cre?小鼠收集的BM（Cre-Direct BM）、從DKO TOM小鼠收集的腫瘤（Direct-tumor）和成對BM細(xì)胞（Direct-BMT）進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析狸页，顯示tdTomato表達(dá)百分比（上panel锨能，代表性實驗。下panel芍耘，14只小鼠的tdTomato陽性細(xì)胞百分比的平均值）址遇。 B.與Cre+WT BM細(xì)胞相比，成對BMT和腫瘤細(xì)胞的集落形成試驗（代表性圖像左圖）（Giemsa染色和熒光顯微鏡圖像）斋竞，Cre+BM倔约、BMT和腫瘤細(xì)胞的集落數(shù)量的定量右圖（n=3）。 C.與對照上圖相比坝初，NOD/SCID小鼠脛內(nèi)（IT）注射BMT和腫瘤細(xì)胞后發(fā)生的OS腫瘤的代表性圖像浸剩，H＆E驗證OS中panel的組織學(xué)特征。組織學(xué)驗證顯示為成骨細(xì)胞型OS鳄袍，下panel為腫瘤發(fā)展的免疫熒光圖像绢要。紅色信號代表內(nèi)源性tdTomato，藍(lán)色信號代表核染色hoechst拗小。 D.條形圖表示IT注射對照BM細(xì)胞（對照）重罪、BMT和腫瘤細(xì)胞后出現(xiàn)OS的免疫低下小鼠的百分比。 E.傷口愈合實驗遷移。腫瘤和BMT細(xì)胞相對創(chuàng)傷密度時間圖（n=3）剿配。 F.創(chuàng)面愈合實驗搅幅。腫瘤和BMT細(xì)胞相對創(chuàng)傷密度的時間圖（n=3）。

圖3：BMT與腫瘤細(xì)胞的分子相似性 A.腫瘤細(xì)胞（n=3）呼胚、成對BM細(xì)胞（BMT）（n=3） 和對照BM細(xì)胞（n=4）的主成分分析（PCA）圖 茄唐。 B.腫瘤細(xì)胞（n=3）、成對BM細(xì)胞（BMT）（n=3）與對照組比較的Venn圖蝇更。BMT與腫瘤細(xì)胞之間的共有基因為164沪编。 C.熱圖顯示對照細(xì)胞和BMT/腫瘤細(xì)胞中差異表達(dá)基因。 D.通路富集分析簿寂。 E.對照組和BMT/腫瘤細(xì)胞差異表達(dá)基因的基因集富集分析（GSEA）漾抬。

（3）young BM（yBM）細(xì)胞表現(xiàn)出致瘤性

圖4：年輕BM（yBM）衍生細(xì)胞表現(xiàn)出致瘤和轉(zhuǎn)移能力 A.不同年齡的基因編輯BM細(xì)胞（DKO-BM）和野生型BM細(xì)胞（Cre+ WT BM）中tdTomato陽性細(xì)胞百分比的流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果（n = 3）。 B.年輕非腫瘤攜帶小鼠（yBM-DKO）的BM細(xì)胞常遂、Cre陰性小鼠（Cre-BM）和Cre陽性野生型小鼠（Cre+ WT BM）的BM細(xì)胞進(jìn)行集落形成實驗纳令。左panel展示Giemsa染色集落，右panel展示熒光顯微鏡下的集落圖像克胳。77.6 ± 11.6表示yBM-DKO中的集落數(shù)量平绩。 C.脛內(nèi)注射（IT）yBM細(xì)胞3-4個月后，免疫功能低下小鼠發(fā)展出OS腫瘤漠另。上panel展示H&E染色的腫瘤組織學(xué)驗證捏雌，顯示了纖維母細(xì)胞/成骨細(xì)胞型OS。下panel展示發(fā)展的腫瘤免疫熒光圖像笆搓。紅色信號代表內(nèi)源性tdTomato性湿，藍(lán)色信號代表核染色的Hoechst。 D.條形圖展示了在脛內(nèi)注射（IT）yBM满败、腫瘤和對照（Cre-BM）后肤频，免疫功能低下小鼠發(fā)展成OS的百分比。 E.在NOD/SCID小鼠中算墨，通過靜脈注射（IV）yBM細(xì)胞后宵荒，肺轉(zhuǎn)移的光鏡圖像、tdTomato免疫熒光圖像和H&E染色圖像净嘀。分別代表了肺轉(zhuǎn)移的可視化报咳。 F.條形圖展示在靜脈注射yBM細(xì)胞后，NOD/SCOD小鼠發(fā)展成肺轉(zhuǎn)移的百分比（收集1.5月齡和6月齡小鼠）挖藏。 ?

（4）導(dǎo)致骨肉瘤發(fā)生的早期分子變化

圖5：導(dǎo)致骨肉瘤發(fā)生的早期基因（yBM vs腫瘤細(xì)胞和yBM vs BMT細(xì)胞）暑刃。 A.腫瘤細(xì)胞（n=3）、yBM細(xì)胞（1.5月齡和4月齡）（n=6）和對照BM細(xì)胞（n=4)的主成分分析（PCA）膜眠。? B.腫瘤細(xì)胞（n=3）岩臣、yBM細(xì)胞（1.5月齡和4月齡）（n=6）和對照BM細(xì)胞（n=4)的維恩圖分析袁翁。yBM和腫瘤細(xì)胞之間的共有基因有303個。 C.yBM和腫瘤細(xì)胞之間差異表達(dá)基因的通路富集分析婿脸。 D.腫瘤細(xì)胞（n=3）、yBM細(xì)胞（1.5月齡和4月齡）（n=6）和對照BM細(xì)胞（n=4)的PCA圖柄驻。 E.腫瘤細(xì)胞（n=3）狐树、yBM細(xì)胞（1.5月齡和4月齡）（n=6）和對照BM細(xì)胞（n=4)的Venn圖。yBM和BMT細(xì)胞之間的共有基因有471個鸿脓。 F.yBM和BMT細(xì)胞之間差異表達(dá)基因的通路富集分析抑钟。 G.對照和yBM/腫瘤細(xì)胞之間差異表達(dá)基因的基因集富集分析（GSEA）。 H.對照和yBM/BMT細(xì)胞之間差異表達(dá)基因的基因集富集分析（GSEA）野哭。

（5）WWOX丟失導(dǎo)致yBM細(xì)胞中的Myc改變

圖6：WWOX表達(dá)與OS中的c-Myc呈負(fù)相關(guān)在塔。 A.左panel顯示單敲除（SKO）和雙敲除（DKO）yBM細(xì)胞的Venn圖分析（n=3） ，其中308個基因是yBM DKO的特有基因拨黔。右panel的條形圖表示與SKO yBM相比蛔溃，DKO特有的顯著通路（Myc靶標(biāo)）。 B.對照BM（NRM）篱蝇、SKO和DKO的yBM細(xì)胞差異表達(dá)基因的熱圖（n=3)贺待。 C.條形圖表示從對照BM、SKO和DKO-yBM細(xì)胞中的一些Myc靶基因的RNA-seq測序數(shù)據(jù)中的reads數(shù)零截。 D.DKO和SKO-yBM細(xì)胞中Myc靶基因的mRNA水平麸塞。 E.啟動子區(qū)域最高M(jìn)yc富集的前50個基因的歸一化表達(dá)（TPM）的彩色編碼熱圖。 F.啟動子區(qū)域Myc缺失的50個基因的歸一化表達(dá)（TPM）的彩色編碼熱圖涧衙。 G.SKO-yBM和DKO-yBM細(xì)胞的WWOX哪工、c-Myc和p53的免疫印跡。P：親本細(xì)胞系弧哎，OE：過表達(dá)雁比，PC：陽性對照，用nutlin（MDM2抑制劑）處理的HepG2細(xì)胞傻铣。展示了相對于SKO的WWOX和c-Myc蛋白水平的定量分析章贞。 H.箱形圖表示來自TCGA TARGET GTEx的人骨肉瘤樣品中WWOX和Myc表達(dá)之間的相關(guān)性。高WWOX樣本>第75百分位非洲，低WWOX<第25百分位鸭限，y軸代表Myc表達(dá)。PV：p值两踏。

（6）DKO-yBM細(xì)胞中MCM7上調(diào)有助于其致瘤性

圖7：MCM7上調(diào)促進(jìn)腫瘤進(jìn)展 A.從1.5月齡败京、2.5月齡和4月齡的非腫瘤攜帶小鼠收集中的Cre+WT BM（對照）、DKO-yBM中MCM7的mRNA水平（n?=?3). ****p值?<?0.0001. B.Cre+WT BM（對照）梦染、DKO-yBM赡麦、BMT和腫瘤細(xì)胞中MCM7和c-Myc的免疫印跡（數(shù)字表示生物重復(fù)）朴皆。上圖顯示相對于Cre+WT BM細(xì)胞（對照）的MCM7蛋白水平的定量。下圖顯示SVA（μM）處理24小時后Cre+WT BM（對照）泛粹、DKO-yBM遂铡、BMT和腫瘤細(xì)胞（數(shù)字表示生物重復(fù)）中MCM7和c-Myc蛋白水平的定量。 C.SVA（μM）處理24小時后Cre+WT BM（對照）晶姊、DKO-yBM扒接、BMT和腫瘤細(xì)胞的MTT增殖實驗，圖表顯示各組細(xì)胞活力相對于未處理細(xì)胞的倍數(shù)變化们衙。 D.SVA（μM）處理24小時后Cre+WT BM（對照）钾怔、DKO-yBM、BMT和腫瘤細(xì)胞（數(shù)字表示生物重復(fù)）的克隆形成實驗?圖表顯示了各組細(xì)胞存活率相對于未處理細(xì)胞的倍數(shù)變化蒙挑。 E.SVA（μM）處理24小時后SKO和DKO-yBM細(xì)胞（每組兩個生物重復(fù)序列）的MTT增殖實驗宗侦，圖表顯示各組細(xì)胞活力相對于未處理細(xì)胞的倍數(shù)變化。 F.在NOD/SCID小鼠中忆蚀，通過脛內(nèi)注射（IT）yBM細(xì)胞后矾利，比較了對照組（未處理）和SVA（60 mg/kg）處理組腫瘤的平均大小（cm3）和重量（g）蜓谋。（*p<0.05梦皮，**p<0.01)。 G.對照組（vehicle）和SVA處理組腫瘤的H&E染色顯示OS成骨細(xì)胞/成纖維細(xì)胞特征桃焕，對照組和SVA處理的腫瘤的MCM7的IHC染色（左圖）剑肯，與對照組相比（右圖），MCM7陽性染色的細(xì)胞核的定量（**p<0.001)观堂。

研究結(jié)論

本研究強調(diào)了WWOX和p53作為腫瘤抑制基因在骨肉瘤（OS）發(fā)展中的重要性让网，Osx1陽性祖細(xì)胞中WWOX和p53的聯(lián)合缺失（雙敲除）導(dǎo)致了細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和生長優(yōu)勢。這種優(yōu)勢至少部分由Myc過表達(dá)介導(dǎo)师痕，可能發(fā)生在OS細(xì)胞增殖和存活的早期階段溃睹。僅p53敲除不足以驅(qū)動觀察到早期分子變化，WWOX沉默和Myc過表達(dá)可能是預(yù)防和治療OS患者的的潛在靶點胰坟，為研究OS轉(zhuǎn)化因篇、進(jìn)展和干預(yù)的分子機制提供了細(xì)胞和遺傳平臺。

?參考文獻(xiàn)：

AkkawiR, Hidmi O, Yehya AH, Monin J, Diment J, Drier Y, Stein GS, Aqeilan RI. WWOXpromotes osteosarcoma development via upregulation of Myc. Cell Death Dis. 2024Jan 5;15(1):13. pii: 10.1038/s41419-023-06378-8. doi:10.1038/s41419-023-06378-8. PubMed PMID: 38182577.