單細(xì)胞scRNA-seq學(xué)習(xí)筆記3-數(shù)據(jù)預(yù)處理

課程學(xué)習(xí)生信技能樹單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組（基礎(chǔ)）
課程分析的示例文章來自：

2018年12月的NC文章：Spatially and functionally distinct subclasses of breast cancer-associated fibroblasts revealed by single cell RNA sequencing
附件在：https://static-content.springer.com/esm/art%3A10.1038%2Fs41467-018-07582-3/MediaObjects/41467_2018_7582_MOESM1_ESM.pdf

主要是搬運(yùn)劉小澤-單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)習(xí)筆記-2-文獻(xiàn)理解

利用Smart-seq2探索癌癥成纖維細(xì)胞CAFs的功能和空間異質(zhì)性

看一篇文章的時(shí)候瞄摊，里面會(huì)有很多詞語是陌生的绒瘦，這時(shí)就需要去了解背景知識(shí)

研究背景

傳統(tǒng)的腫瘤研究是單純以腫瘤細(xì)胞為中心沃疮，但是過去的幾十年中研究者對(duì)腫瘤微環(huán)境與惡性表征的聯(lián)系越來越重視缎岗。探索腫瘤細(xì)胞與微環(huán)境的相互作用為靶向治療提供了新方向虽抄。本文的目的是利用可以尋找更多基因的smart-seq2技術(shù)對(duì)小鼠乳腺癌CAFs的亞群進(jìn)行鑒定，展示了時(shí)空分布情況晓殊；還探究了人類與小鼠CAFs亞型一致性凤优，為未來靶向CAFs藥物研發(fā)或診斷標(biāo)志物篩選提供基礎(chǔ)。

名詞解釋

CAF（cancer-associated fibroblast）：
國(guó)際腫瘤學(xué)雜志 ：癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞是數(shù)量最豐富的基質(zhì)細(xì)胞题涨，在腫瘤微環(huán)境中通過細(xì)胞與細(xì)胞間相互接觸偎谁，并在各種可溶性因子的作用下，促進(jìn)上皮細(xì)胞及其他細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化纲堵。目前發(fā)現(xiàn)巡雨，它在許多癌癥（包括乳腺癌、胰腺癌席函、肝癌）的微環(huán)境中最常見铐望。

它是具有高度的異質(zhì)性的細(xì)胞群，不同的細(xì)胞亞群可能起源于不同的前體細(xì)胞，如固有成纖維細(xì)胞正蛙、腫瘤上皮細(xì)胞炕舵、腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞、骨髓來源細(xì)胞跟畅、其他間充質(zhì)細(xì)胞等。
它在腫瘤形成中的作用：

• 重塑纖維間質(zhì)中的細(xì)胞外基質(zhì)
• "草船借箭"=》細(xì)胞外基質(zhì)蛋白與非腫瘤細(xì)胞(如免疫細(xì)胞)的整合素受體結(jié)合溶推，將細(xì)胞外基質(zhì)蛋白募集到腫瘤細(xì)胞處徊件，發(fā)生相互作用，繼而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲
• 高密度細(xì)胞外基質(zhì)導(dǎo)致組織間隙液壓升高蒜危，阻礙藥物傳遞與吸收
• CAFs以細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的形式分泌致瘤信號(hào)虱痕，促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖辐赞、遷移
• CAFs分泌肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）部翘、白介素-6(Interleukin-6，IL-6)响委，促進(jìn)腫瘤對(duì)化療新思、酪氨酸激酶抑制劑產(chǎn)生抗藥性

關(guān)于它的綜述：The biology and function of fibroblasts in cancer.

TME（Tumor Microenvironment）：腫瘤微環(huán)境，包括了腫瘤細(xì)胞赘风、基質(zhì)細(xì)胞(如成纖維細(xì)胞)夹囚、免疫細(xì)胞、細(xì)胞的分泌產(chǎn)物（如細(xì)胞因子和趨化因子）邀窃、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)荸哟、腫瘤和非腫瘤細(xì)胞代謝產(chǎn)物(如過氧化氫)、特定生理環(huán)境(供養(yǎng)瞬捕、ph條件鞍历、間質(zhì)壓)，腫瘤在TME中就像汽車與停車場(chǎng)的關(guān)系肪虎。

2018年cell文章Single-Cell Map of Diverse Immune Phenotypes in the Breast Tumor Microenvironment. 介紹了單細(xì)胞測(cè)序在研究乳腺癌微環(huán)境的應(yīng)用劣砍，分析了來自8個(gè)乳腺瘤以及匹配的正常乳腺組織，血液和淋巴結(jié)中的45,000個(gè)免疫細(xì)胞笋轨，做了一個(gè)乳腺癌腫瘤微環(huán)境免疫細(xì)胞圖譜秆剪。

ECM（extracellular matrix）：細(xì)胞外基質(zhì)。是由細(xì)胞合成爵政、分泌的生物大分子在細(xì)胞表面或細(xì)胞之間構(gòu)成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)仅讽，主要有4大類：膠原、非膠原糖蛋白钾挟、氨基聚糖與蛋白聚糖洁灵、彈性蛋白。腫瘤中，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的表達(dá)譜顯著區(qū)別于正常組織徽千。實(shí)體腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程伴隨結(jié)締組織的增生與纖維化苫费；腫瘤中細(xì)胞外基質(zhì)的動(dòng)態(tài)改變不僅體現(xiàn)在細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的表達(dá)水平與相對(duì)組成的改變，同時(shí)還表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)空間拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與剛性等物理學(xué)性質(zhì)的改變
參考：細(xì)胞外基質(zhì)與腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞

EMT（ epithelial-to-mesenchymal transition）：指的是上皮型細(xì)胞在特定生理?xiàng)l件下向間質(zhì)型細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變双抽。惡性腫瘤經(jīng)常伴隨轉(zhuǎn)移百框，這個(gè)過程是一個(gè)多因素、多階段的復(fù)雜過程牍汹。通常認(rèn)為EMT會(huì)導(dǎo)致上皮細(xì)胞的E-cadherin铐维、claudin、occludin等連接分子表達(dá)缺失, 破壞細(xì)胞極性慎菲；另外會(huì)促使使一些參與細(xì)胞外
基質(zhì)(主要包括膠原嫁蛇、層黏素和纖維結(jié)合素等)和基底膜降解和破壞的溶解酶如基質(zhì)金屬蛋白酶高表達(dá)，破壞腫瘤細(xì)胞侵襲的組織屏障露该。
參考：上皮–間質(zhì)轉(zhuǎn)化: 腫瘤轉(zhuǎn)移的重要調(diào)控機(jī)制

MMTV-PyMT mouse model： 自發(fā)型腫瘤模型小鼠=》遺傳育種保留下來的帶有自發(fā)型乳腺癌的動(dòng)物模型睬棚，與人類的發(fā)生相似，重復(fù)性公認(rèn)性較好

FACS strategy：即 流式細(xì)胞分選技術(shù)解幼。不得不看看單細(xì)胞分離技術(shù)的知識(shí)抑党，單細(xì)胞分離主要依據(jù)單細(xì)胞的表型與生物標(biāo)記物，來篩選完整的單個(gè)細(xì)胞撵摆，主要的分選方法有：有限稀釋法(Limiting Dilution)新荤、顯微操作(Micromanipulator)、激光顯微切割（LCM）台汇、流式細(xì)胞分選（FACS）苛骨、微流控技術(shù)（Microfluidics）。
FACS是比較常用的方法苟呐，它可以獲得隨機(jī)樣品痒芝，可以利用熒光標(biāo)記的抗體獲得細(xì)胞表面特異marker的細(xì)胞亞群，進(jìn)而探究細(xì)胞亞群牵素。允許將細(xì)胞分選到96或384孔板中進(jìn)行后續(xù)的單細(xì)胞測(cè)序严衬，但是FACS需要較大的細(xì)胞量，并且會(huì)出現(xiàn)一孔多個(gè)或一孔沒有細(xì)胞的現(xiàn)象笆呆；
另外请琳，顯微操作可以在特定位置對(duì)少量細(xì)胞進(jìn)行獲取，但是它耗費(fèi)人力赠幕，高通量受限俄精；微流控可以對(duì)整個(gè)分選過程進(jìn)行監(jiān)測(cè)，但是依賴固定的微流控芯片

Smart-seq2： 提到單細(xì)胞不得不說這個(gè)技術(shù)榕堰，目前它和10X是最主流的建庫技術(shù)竖慧。它的重點(diǎn)是"測(cè)的少，但測(cè)得長(zhǎng)“。它以單個(gè)細(xì)胞或10pg的RNA為模板圾旨，將Oligo(dT) VN Primer作為逆轉(zhuǎn)錄引物踱讨，利用逆轉(zhuǎn)錄酶的模板轉(zhuǎn)換（Template-switching）活性，在cDNA的3’端添加一段接頭序列砍的，通過該接頭序列進(jìn)行后續(xù)PCR擴(kuò)增痹筛，可以獲得全長(zhǎng)cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物。它對(duì)RNA質(zhì)量要求高廓鞠，RNA降解對(duì)引起5’端信息丟失

結(jié)果

揭示小鼠乳腺癌CAFs亞群

采用負(fù)向篩選的FACS去除上皮細(xì)胞味混、免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞诫惭，從MMTV-PyMT轉(zhuǎn)基因小鼠腫瘤組織樣本中分選出EpCAM?/CD45?/CD31?/NG2?細(xì)胞類群（共構(gòu)建了2個(gè)384孔板細(xì)胞=768個(gè)CAFs文庫）

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然后smart-seq2測(cè)序，加入ERCC spike-in蔓挖，結(jié)果有52個(gè)質(zhì)量不合格夕土，然后去掉了細(xì)胞中平均表達(dá)量小于1的基因，得到了10835個(gè)內(nèi)源基因和53個(gè)spike-in去做下游分析瘟判。平均每個(gè)細(xì)胞得到4600個(gè)差異基因怨绣，然后進(jìn)行降維，利用DBSCAN進(jìn)行t-SNE分析拷获，鑒定了4個(gè)細(xì)胞亞群

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得到亞群然后進(jìn)行功能分析

利用ROTS（reproducibility-optimized test statistic）方法將每個(gè)群體和其他的混合群體對(duì)比尋找差異基因篮撑，1-4號(hào)亞群分別得到522，1999匆瓜，590赢笨，859個(gè)顯著差異表達(dá)基因(significantly differentially expressed，SDE驮吱，認(rèn)為FDR<0.001)茧妒，然后將每個(gè)亞群的前18個(gè)SDEs聚類畫熱圖。

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另外為了檢測(cè)ROTS的準(zhǔn)確性左冬，又用SCDE桐筏、edgeR、DESeq2拇砰、Wilcoxon rank-sum test方法分析梅忌，得到了類似的SDEs(見附表4)

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然后利用每個(gè)群體的前150SDEs進(jìn)行GO分析，4個(gè)CAFs亞群命名為：vCAFs（血管發(fā)育和生成）除破、eCAFs（細(xì)胞外基質(zhì)）牧氮、cCAFs（細(xì)胞周期）和dCAFs（組織發(fā)育）

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細(xì)胞亞群在腫瘤中的時(shí)空分布

目的是確定4種CAFs的來源和分布，繪制了SDE的小提琴圖瑰枫，并結(jié)合免疫熒光蹋笼、免疫組化等標(biāo)記了亞群的marker基因：vCAFs=》Desmin、NID-2、CD31剖毯；mCAFs=》PDGFRα圾笨；dCAFs=》SCRG1、EPCAM

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推測(cè)分布：

• vCAFs起源于血管周細(xì)胞逊谋，隨后向腫瘤基質(zhì)區(qū)域侵襲擂达；
• mCAFs來源于組織常駐成纖維細(xì)胞；
• cCAFs為vCAFs的增殖狀態(tài)胶滋；
• dCAFs來源于腫瘤細(xì)胞板鬓，并發(fā)生了EMT轉(zhuǎn)化。

后來還將小鼠CAFs與TGCA中乳腺癌的bulk 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析

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TCGA中的基因與vCAFs究恤、mCAFs的SDE相關(guān)性更高