Comprehensive Analysis of the Prognosis andDrug Sensitivity of Differentiation-Related lncRNAs in Papillary Thyroid Cancer?
分化相關(guān)的lncRNAs在乳頭狀甲狀腺癌中的預(yù)后和藥物敏感性的綜合分析。
發(fā)表期刊：Cancers (Basel)
發(fā)表日期：2022 Mar 7
影響因子：6+
doi: 10.3390/cancers14051353?
一、研究背景
????????甲狀腺癌（TC）的發(fā)病率近年來一直在增加烘豹，乳頭狀TC（PTC）是最常見的組織學(xué)類型瓜贾，起源于濾泡細(xì)胞，占病例的85%携悯。盡管絕大多數(shù)PTC患者通過合理的治療如放射性碘（RAI）治療預(yù)后良好祭芦，仍有大約10-20%的PTC患者在隨訪期間出現(xiàn)復(fù)發(fā)并轉(zhuǎn)移。在這些患者中去分化是導(dǎo)致PTC轉(zhuǎn)化為低分化或間變性TC（ATC）的主要原因憔鬼。然而PTC去分化的潛在機(jī)制尚不清楚龟劲，目前的工作旨在識別一個(gè)有用的標(biāo)志以指示去分化，并進(jìn)一步探討其在預(yù)后和化療藥物敏感性中的作用轴或。
????????最近越來越多的研究表明昌跌，遺傳和表觀遺傳畸變、癌癥干細(xì)胞照雁、miRNA蚕愤、免疫代謝網(wǎng)絡(luò)和自噬在PTC脫分化和RAI抗性中起著關(guān)鍵作用。長非編碼RNA（Long noncoding RNAs囊榜，lncRNA）被定義為一系列大于200個(gè)核苷酸的轉(zhuǎn)錄物审胸，被認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后和翻譯調(diào)節(jié)各個(gè)層面的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子卸勺。它們廣泛參與TC患者的致癌作用砂沛、染色質(zhì)動(dòng)力學(xué)、與mRNA和蛋白質(zhì)的相互作用曙求、分化和胚胎發(fā)育碍庵。值得注意的是有研究證明，lncRNA可以有效調(diào)節(jié)NF-κB和PI3K-AKT信號通路悟狱，從而影響腫瘤發(fā)生静浴。一些研究顯示lncRNA是PTCs惡性甲狀腺結(jié)節(jié)診斷、預(yù)后預(yù)測和治療反應(yīng)的潛在有用生物標(biāo)志物挤渐。
二苹享、材料和方法
1.數(shù)據(jù)來源
(1)TCGA：從UCSC Xena下載甲狀腺癌RNA測序（RNA-seq）數(shù)據(jù)（FPKM值）共492個(gè)TC樣本和58個(gè)正常樣本。
(2)GEO數(shù)據(jù)庫下載微陣列數(shù)據(jù)集GSE33630浴麻。由11個(gè)ATC得问、49個(gè)PTC和45個(gè)正常樣本組成。該數(shù)據(jù)集基于GPL570(HG-U133_Plus_2)Affymetrix人類基因組U133 Plus 2.0陣列软免。
(3)2020年3月至2020年6月在湘雅醫(yī)院甲狀腺外科接受甲狀腺切除術(shù)的患者中收集了20個(gè)配對PTC樣本和相鄰的正常組織宫纬。
2.實(shí)驗(yàn)流程
三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1.DR-lncRNA調(diào)節(jié)因子的功能和相互作用
根據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)膏萧，共有16種與分化相關(guān)的調(diào)節(jié)因子漓骚，包括NKX2-1蝌衔、DUOX1-2、pAX8蝌蹂、SLC5A5噩斟、SLC5A8、SLC26A4叉信、FOXE1亩冬、TG、TSHR硼身、THRA硅急、THRB、DIO1-2佳遂、GLIS3和TPO营袜。 PPI網(wǎng)絡(luò)顯示TSHR是一個(gè)中心基因，可以與其他15個(gè)基因相互作用 (圖1A)丑罪，但Pearson相關(guān)分析顯示TSHR與其他基因的相關(guān)性較弱荚板。有趣的是，DOUX1和DOUX2具有最強(qiáng)的正相關(guān)(圖1B)吩屹。
????????分析492個(gè)TC樣本和58個(gè)正常樣本數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)跪另，PTC中大多數(shù)分化相關(guān)調(diào)節(jié)因子的表達(dá)顯著較低，包括PAX8煤搜，SLC5A5免绿，SLC5A8，SLC26A4擦盾，F(xiàn)OXE1嘲驾，TG，TSHR迹卢，THRA辽故，THRB，DIO1-2腐碱，GLIS3和TPO誊垢，只有NKX2-1在PTC組織中過表達(dá)(圖S1A)。使用Pearson相關(guān)分析篩選DR lncRNA共發(fā)現(xiàn)116個(gè)DR lncRNAs症见。其中5個(gè)DR lncRNAs被證實(shí)與總生存率相關(guān)并顯示出很強(qiáng)的預(yù)后價(jià)值喂走，包括CAS15、LNC00900筒饰、AC055720-2缴啡、DPH6-DT和TNRC6C-AS1壁晒，圖S1B顯示CAS15和TNRC6C-AS1與分化相關(guān)調(diào)節(jié)因子呈負(fù)相關(guān)瓷们，而其他三種lncRNAs則呈正相關(guān)(圖S1B)。所有DR lncRNAs在PTC中異常表達(dá)(圖S1C)。
2.風(fēng)險(xiǎn)評分與預(yù)后和腫瘤免疫微環(huán)境有關(guān)
????????構(gòu)建預(yù)后模型谬晕，根據(jù)以下公式計(jì)算每個(gè)PTC患者的風(fēng)險(xiǎn)分?jǐn)?shù)：風(fēng)險(xiǎn)分?jǐn)?shù)=(2.43×CAS15)+(?2.22×LNC00900)+(?0.87×AC055720.2) +(3.71×DPH6-DT)+(0.28×TNRC6C-AS1)碘裕。
????????所有PTC患者基于風(fēng)險(xiǎn)評分中值被分為高風(fēng)險(xiǎn)和低風(fēng)險(xiǎn)兩組。與高危亞組相比攒钳，低危組患者的生存時(shí)間更長(圖2A)帮孔。圖2B是患者生存狀態(tài)和風(fēng)險(xiǎn)評分的分布。熱圖顯示LNC00900不撑、AC055720.2和TNRC6CAS1表達(dá)水平在低風(fēng)險(xiǎn)組顯著上調(diào)(圖2C)文兢。風(fēng)險(xiǎn)得分的AUC為0.8742（圖2D），表明預(yù)測性能良好焕檬。
????????關(guān)于PTC的免疫微環(huán)境姆坚，CIBERSORT分析顯示：與低風(fēng)險(xiǎn)組相比，高風(fēng)險(xiǎn)組的嗜酸性粒細(xì)胞和活化的DC水平顯著較高实愚，而活化的肥大細(xì)胞（MC）兼呵、靜止的MC和巨噬細(xì)胞M2水平較低（圖S2A）。利用ssGSEA算法腊敲，發(fā)現(xiàn)低風(fēng)險(xiǎn)組中有大量的T卵泡輔助細(xì)胞击喂、漿細(xì)胞樣DC、未成熟DC和中央記憶CD8 T細(xì)胞（圖S2B）碰辅。此外懂昂，MCP計(jì)數(shù)器進(jìn)一步證實(shí)了免疫微環(huán)境與風(fēng)險(xiǎn)評分的關(guān)聯(lián)，并顯示低風(fēng)險(xiǎn)組的內(nèi)皮細(xì)胞乎赴、中性粒細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的豐度明顯較高（圖S2C）忍法。這些數(shù)據(jù)表明，風(fēng)險(xiǎn)評分模型可以預(yù)測預(yù)后榕吼，并與免疫細(xì)胞浸潤密切相關(guān)饿序。
3.GO和KEGG富集分析
使用Metascape進(jìn)行了GO和KEGG通路富集分析羹蚣。前九個(gè)GO術(shù)語是甲狀腺激素生成原探、甲狀腺激素代謝過程、激素代謝過程顽素、含膠原的細(xì)胞外基質(zhì)咽弦、頂端質(zhì)膜、基底外側(cè)質(zhì)膜胁出、糖胺聚糖結(jié)合型型、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性和肝素結(jié)合（圖3A-C）。KEGG分析表明全蝶，細(xì)胞粘附分子（CAM）闹蒜、ECM-受體相互作用寺枉、色氨酸代謝、糖胺聚糖生物合成和硫酸可拉坦與PTC的形成密切相關(guān)（圖3D）
4.藥物敏感性分析
作者采用了spearman相關(guān)分析绷落，以評估藥物敏感性和分化相關(guān)調(diào)節(jié)因子之間的相關(guān)性姥闪。圖4A顯示了統(tǒng)計(jì)差異最大的前8種藥物。結(jié)果顯示：高風(fēng)險(xiǎn)組相比砌烁，低風(fēng)險(xiǎn)組對苯達(dá)莫司汀和TAS-6417在針對分化相關(guān)調(diào)節(jié)因子方面更敏感（圖4B）筐喳。圖S4顯示了藥物的結(jié)構(gòu)，這些發(fā)現(xiàn)突出表明該模型可被視為潛在的化療敏感性預(yù)測因子函喉。
5.DR-lncRNAs預(yù)后諾模圖的構(gòu)建
單變量分析顯示PTC患者的風(fēng)險(xiǎn)評分避归、M1期、T4期管呵、TNM III-IV期和年齡與總體生存率（OS）顯著相關(guān)槐脏。進(jìn)一步的多變量分析顯示，風(fēng)險(xiǎn)評分和年齡是獨(dú)立的預(yù)后因素撇寞。隨后顿天，構(gòu)建了OS預(yù)測的綜合諾模圖（圖5A）。3年期和5年期OS的AUC分別為0.966和0.967（圖5B）蔑担。此外綜合諾模圖模型在預(yù)測3年和5年的OS方面表現(xiàn)出色（圖5C）牌废。DCA曲線顯示，綜合諾模圖可以更好地預(yù)測OS啤握，并且比年齡或風(fēng)險(xiǎn)評分具有更有利的臨床適用性（圖5D）鸟缕。
6.DR-lncRNA表達(dá)的驗(yàn)證
為了驗(yàn)證DR lncRNAs的表達(dá)水平，作者選擇GSE33630數(shù)據(jù)庫在TC和正常組織之間進(jìn)行差異分析排抬。結(jié)果表明懂从，與ATC和正常組織相比，PTC組織中LNC00900蹲蒲、AC055720-2和TNRC6C-AS1表達(dá)上調(diào)番甩。隨著分化程度的增加，DPH6-DT的表達(dá)水平顯著上調(diào)届搁，然而CASC15的表達(dá)水平則與分化程度呈負(fù)相關(guān)（圖6A）缘薛，ATC患者的風(fēng)險(xiǎn)評分最高（圖6B）。TNRC6C-AS1和CAS15的表達(dá)顯著高于正常組織和細(xì)胞系（p<0.001）卡睦，而DPH6-DT在TC組織（圖S6A）和細(xì)胞系（圖S6B）中的表達(dá)顯著低于正常組織和細(xì)胞系宴胧。圖S6C顯示，只有DPH6-DT與分化水平相關(guān)表锻。TNRC6C-AS1和CASC15已經(jīng)在PTC中進(jìn)行了研究恕齐，因此，作者選擇DPH6-DT進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)瞬逊。
7.DPH6-DT的下調(diào)通過激活PI3K-AKT信號通路促進(jìn)細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移
為了探索DPH6-DT在TC中的生物學(xué)功能显歧，作者通過轉(zhuǎn)染三種siRNA將DPH6-DT敲除补胚。其中，DPH6-DT-siRNA3有效地抑制了DPH6-DT的表達(dá)（圖7A）追迟。CCK-8分析表明，沉默DPH6-DT可顯著提高細(xì)胞活力（圖7B）骚腥，EdU分析表明敦间，DPH-6DT缺乏可顯著增加IHH-4和KTC-1細(xì)胞中PTC細(xì)胞的增殖（圖7C）。同樣束铭，當(dāng)DPH6-DT沉默時(shí)廓块，入侵和遷移增強(qiáng)（圖7D）。此外契沫，作者還探究了PTC中DPH6-DT-敲除的潛在機(jī)制變化带猴。Western blot分析顯示，缺失DPH6-DT可增加IHH-4和KTC-1細(xì)胞中AKT懈万、p-AKT和PI3K的表達(dá)水平拴清。然而，在ERK和p-ERK中沒有觀察到差異会通。此外口予，DPH6-DT下調(diào)還增加了上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程中波形蛋白和N-鈣粘蛋白的表達(dá)。這些數(shù)據(jù)表明涕侈，DPH6-DT的敲除導(dǎo)致PTC中PI3K/AKT信號通路的激活沪停。
四、結(jié)論
????????本研究系統(tǒng)地描述了DR-lncRNAs調(diào)節(jié)因子的表達(dá)模式裳涛、腫瘤免疫微環(huán)境木张、藥物敏感性和預(yù)后價(jià)值，揭示了其在PTC患者預(yù)后和免疫細(xì)胞浸潤中起著至關(guān)重要的作用端三，并且是藥物化學(xué)敏感性的預(yù)測因子舷礼。研究表明，與正常組織相比郊闯，TC組織中DPH6-DT的表達(dá)顯著降低且轨，分化相關(guān)調(diào)節(jié)因子的大部分表達(dá)也顯著降低。同時(shí)虚婿，作者證了DPH6-DT的表達(dá)水平與TC分化程度顯著相關(guān)旋奢。更重要的是證實(shí)DPH6-DT可以被視為一種新的信號，通過激活PI3K-AKT信號通路來指導(dǎo)分化和促進(jìn)TC發(fā)展然痊，這為APT和RAI難治性TC患者的早期診斷和治療提供了重要的依據(jù)至朗，以改善其不良的臨床預(yù)后。
