材料：
動(dòng)物：SPF級(jí)6周雌性的Balb/c小鼠；小鼠乳腺癌細(xì)胞系4T1或者M(jìn)DA-MB-231細(xì)胞童社，293T細(xì)胞
試劑：RPMI 1640(Biological Industries公司);0.25% Trypsin求厕、胎牛血清、青霉素-鏈霉素溶液和Opti-MEM(Gibco公司); VivoGloTM Luciferin和D-luciferin(Promega公司);蘇木精染料和伊紅染料(ZSGB-BIO公司);轉(zhuǎn)染試劑呀癣，Lipofectamine2000(Invitrogen公司);Polybrene 助感染試劑(Sigma-Aldrich公司)美浦。
方法：
- 細(xì)胞培養(yǎng)：
4T1細(xì)胞系在含有10%胎牛血清和100 U/mL青霉素-鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)十艾。培養(yǎng)溫度為37 ℃,氣體環(huán)境為5% CO2/95%空氣抵代，濕度為飽和。對(duì)于細(xì)胞傳代荤牍，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化細(xì)胞，并以1∶3的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)庆冕。 - 慢病毒包裝和穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的構(gòu)建：
為了實(shí)時(shí)觀察體內(nèi)的轉(zhuǎn)移情況康吵，本研究構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)luciferase的細(xì)胞系。轉(zhuǎn)染前1 d將293T細(xì)胞鋪入6孔板內(nèi)访递，待細(xì)胞匯合度達(dá)到70%左右時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染晦嵌。
將luciferase表達(dá)質(zhì)粒和pLP1、pLP2和pLP/VSVG慢病毒穿梭質(zhì)粒和輔助包裝原件載體質(zhì)粒按照分子質(zhì)量計(jì)算DNA用量惭载，總計(jì)2 μg DNA。將2 μg DNA稀釋于100 μL Opti-MEM培養(yǎng)基中混勻后靜置5 min, 同時(shí)將2 μL Lipo2000轉(zhuǎn)染試劑置于100 μL Opti-MEM培養(yǎng)基中混勻后靜置5 min响巢。再將200 μL轉(zhuǎn)染工作液加入培養(yǎng)液中混勻后置于37 ℃,5% CO2培養(yǎng)，4～6 h后換液踪古。半量體積的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h, 熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率,收集上清, 3 000 r/min離心15 min, 取上清含长，6孔板感染4T1細(xì)胞. 在不含雙抗的完全培養(yǎng)基中伏穆，每孔加入1 mL病毒原液并添加2 μg/mL的助感染試劑polybrene, 6 h后換液拘泞。感染病毒后的細(xì)胞增殖匯合達(dá)到80%時(shí)，更換為新鮮的含嘌呤霉素（ 2 μg/mL ）的培養(yǎng)基處理細(xì)胞枕扫。直至未感染的空白對(duì)照組細(xì)胞全部死亡后，更換完全培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)铡原⊥迪茫抗性基因進(jìn)行篩選燕刻，在轉(zhuǎn)染3-4天進(jìn)行加藥只泼，連續(xù)加藥2周得到穩(wěn)定的4T1-luc
3.自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移模型的建立
將處于對(duì)數(shù)增殖期的小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1-luc用0.25% EDTA的胰蛋白酶消化，1 000 r/min離心5 min, 用生理鹽水或PBS重懸制備單細(xì)胞懸液,將細(xì)胞調(diào)整到1.5×107 /mL请唱。
首先確認(rèn)麻醉雌性小鼠對(duì)腳趾捏缺乏反應(yīng)弥咪，并將動(dòng)物的四肢貼在手術(shù)板上。使用無菌棉簽用洗必泰聚至、碘和 75% 乙醇對(duì)手術(shù)區(qū)域進(jìn)行消毒。并在前胸壁中間做一個(gè)五毫米的皮膚切口本橙。提起靠近切口的右側(cè)皮膚，并使用無菌顯微剪刀將皮膚與胸壁分離甚亭。翻開皮膚以暴露右側(cè)的第四對(duì)乳腺脂肪墊贷币，并使用配備 28.5 號(hào)針頭的 1 毫升胰島素注射器，小心地將 100 ul癌細(xì)胞【 1.5×106個(gè)細(xì)胞】懸浮液通過傷口注入脂肪墊.針頭停留五秒鐘役纹，讓凝膠狀癌細(xì)胞蛋白混合物凝固，拔出針頭暇唾，用無菌 5-0 不可吸收縫線關(guān)閉切口促脉。然后將動(dòng)物放在一個(gè)干凈的籠子里進(jìn)行監(jiān)測(cè)
每只Balb/C裸鼠于左前肢腋下【第四對(duì)乳腺脂肪墊】接種1.5×106個(gè)細(xì)胞【即100ul】策州。 - 實(shí)驗(yàn)性肺轉(zhuǎn)移模型的建立
每只SCID鼠經(jīng)尾靜脈注射1.5×106個(gè)細(xì)胞, 每周對(duì)小鼠的生活狀態(tài)進(jìn)行觀察
5.成瘤并進(jìn)行原位腫瘤切除術(shù)
每隔1 d對(duì)裸鼠的成瘤情況進(jìn)行觀察, 并測(cè)量裸鼠體質(zhì)量和瘤體的長徑和短徑瘸味。
癌細(xì)胞接種后8天【看成瘤情況】要進(jìn)行乳房切除術(shù)，固定小鼠硫戈，在癌細(xì)胞接種的手術(shù)疤痕左側(cè)兩毫米處做一個(gè)5毫米的皮膚切口。將切口向前肢根部延伸下硕，切除腫瘤，以及皮膚梭姓，包括手術(shù)疤痕，和與腫瘤接觸的病變嫩码，以及腋窩淋巴結(jié)。然后用無菌的5-0不可吸收縫合線將皮膚缺損處縫合成Y字形铸题。將動(dòng)物放回籠子里铡恕，并進(jìn)行監(jiān)測(cè)
6.小動(dòng)物活體成像檢測(cè)體內(nèi)轉(zhuǎn)移情況：
小動(dòng)物超聲/CT檢測(cè)肺轉(zhuǎn)移情況
熒光成像
使用PBS配制150 mg/mL的D-luciferin儲(chǔ)存液(10×工作液),-80 ℃保存。實(shí)驗(yàn)前探熔，使用PBS稀釋D-luci-ferin儲(chǔ)存液至1×工作液。將荷瘤小鼠放置于麻醉箱通入異氟烷麻醉烘挫。
腹腔注射D-luciferin工作液(10 μL/g),10 min后將小鼠放置于活體成像箱中進(jìn)行成像拍照诀艰，并且記錄數(shù)據(jù)。 - 摸索時(shí)間其垄，選擇B超/CT未檢測(cè)出但熒光成像存在時(shí)進(jìn)行肺部組織石蠟包埋和HE染色
將安樂死的小鼠手術(shù)取出肺組織后苛蒲，立即放入4%多聚甲醛溶液中固定2 d。流水漂洗組織塊后臂外，使用梯度濃度的乙醇溶液脫水組織，然后使用二甲苯進(jìn)行透明處理喇颁，浸蠟后將組織整理包埋于石蠟塊中。
對(duì)包埋材料進(jìn)行修整后无牵，固定在切片機(jī)上漾肮，4 μm組織切片，將切片于溫水中展片克懊，并用載玻片從一側(cè)撈片后放置于60℃的烤片機(jī)上烤干。
將石蠟包埋的切片浸入梯度濃度的乙醇中進(jìn)行脫蠟處理七蜘。復(fù)水后，依次用蘇木精染色橡卤，用鹽酸乙醇進(jìn)行分化扮念，用氨水漂洗返藍(lán)，脫水后再用0.5%伊紅乙醇溶液復(fù)染柜与。
在每張載玻片上滴一滴中性樹脂，并覆蓋蓋玻片嵌灰。制好的玻片在顯微鏡下觀察，對(duì)核質(zhì)深染的區(qū)域進(jìn)行拍照統(tǒng)計(jì)沽瞭。
