背景介紹
?????? 結(jié)腸是大腸的一部分，主要功能是吸收水分和電解質(zhì)虑椎，將食物殘?jiān)纬杉S便震鹉。結(jié)腸組織學(xué)結(jié)構(gòu)包括黏膜、黏膜下層捆姜，肌層和外膜传趾。黏膜表面光滑無絨毛，上皮為單層柱狀泥技，由吸收細(xì)胞和杯狀細(xì)胞組成浆兰；黏膜下層則是結(jié)締組織，含成群脂肪細(xì)胞珊豹；肌層由內(nèi)環(huán)形和外縱行兩層平滑肌組成簸呈，可形成結(jié)腸袋；外膜為漿膜或者是纖維膜店茶。
?????? 在本實(shí)驗(yàn)中使用到的TrypLE? Express 是一種非動(dòng)物源性重組酶蜕便，用于各種粘附狀態(tài)下的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，包括 CHO贩幻、HEK293轿腺、A529两嘴、角質(zhì)形成細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞。TrypLE? Express 裂解賴氨酸和精氨酸 C-末端上的肽鍵吃溅，可直接替代胰蛋白酶溶诞，特異性高，細(xì)胞損害小决侈。
實(shí)驗(yàn)儀器及耗材
轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基(500 mL)
DMEM(高葡萄糖)500mL+青霉素/鏈霉素5mL+HEPES 5mL(1M)
HPGA (500 mL)
HBSS 500 mL +青霉素/鏈霉素5 mL+HEPES 5mL(1M)
洗滌培養(yǎng)基(50 mL)
HPGA + 1mM EDTA + 1mM DTT
螯合培養(yǎng)基(50 mL)
HPGA + 1mM EDTA
實(shí)驗(yàn)步驟
1.10mL預(yù)冷洗滌培養(yǎng)基清洗得到的組織螺垢，重復(fù)3次。
2.清洗后的組織轉(zhuǎn)移到37℃預(yù)熱的螯合培養(yǎng)基（5mL）中孵育20分鐘赖歌，每10分鐘晃動(dòng)一下組織枉圃。
3.去上清，將組織轉(zhuǎn)移到5mL預(yù)熱的螯合培養(yǎng)基中庐冯，37℃孵育10分鐘孽亲。
4.震蕩2次，每次5秒展父。
5.解離組織自然沉淀返劲，取上清，剩下的組織再加入5mL預(yù)熱的螯合培養(yǎng)基栖茉，37℃孵育篮绿。
6.收集到的上清液如果有隱窩存在，則4℃吕漂，300g離心4分鐘亲配。
7.使用2mL轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基重懸隱窩，冰上保存惶凝。
8.重復(fù)步驟3到步驟7吼虎，盡可能收集隱窩，重復(fù)至多4次苍鲜。
9.隱窩懸濁液思灰，4℃，400g離心4分鐘混滔。
10.用3mL預(yù)熱的TrypLE Express（含50μg/mL 脫氧核糖核酸酶I）重懸洒疚。
11.37℃孵育45分鐘，搖動(dòng)或者晃動(dòng)都可遍坟。
12.用含5%血清的3mL轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基終止拳亿。
13.用70μm細(xì)胞過濾器(用血清潤洗)過濾到50mL離心管中晴股，用5mL轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基+5%血清沖洗細(xì)胞過濾器愿伴。
14.除去過濾器，用含5% 血清的15mL轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基清洗电湘。
15.300g離心4分鐘隔节。
16.去除上清鹅经。用10mL洗滌培養(yǎng)基清洗沉淀。
17.300g離心5分鐘怎诫。
18.非常小心地取出上清（不要碰到沉淀顆粒）瘾晃，直到剩下1mL。重懸沉淀幻妓。
19.用40μm細(xì)胞過濾器(用血清潤洗)過濾蹦误，用5mL PBS + 0.04% BSA沖洗。
20.300g離心5分鐘肉津，去上清至小于1mL强胰，重懸沉淀后用PBS +0.04% BSA補(bǔ)到1mL。
21.通過細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測細(xì)胞活性大于等于85%妹沙，背景干凈偶洋，結(jié)團(tuán)率小于5%，細(xì)胞量大于等于5萬距糖；可用于后續(xù)單細(xì)胞測序建庫實(shí)驗(yàn)玄窝。
制備結(jié)果
以上內(nèi)容來自聯(lián)川生物壮啊，有誰如果照著這個(gè)步驟做了方便的話留言反饋效果如何~（帶圖的最好），哪里沒有照做有修改的也最好寫清楚
