TRUST
1矛洞、?概述
TRUST，是從RNA-seq原始數(shù)據(jù)組裝到TCR CDR3的軟件噪矛，專門為RNA-seq數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)的工具[Ref1]放可。
它是這樣評(píng)價(jià)先前的工具的：[Ref2]
However,these studies adopted?computational methods not?specifically designed for unselected RNA-seqdata14–16, resulting in poor detection of CDR3?sequences and limited power in downstream characterization of the?tumor-infiltrating T cell repertoires of the cohorts.
2、?工作流程
比對(duì)RNA-seq數(shù)據(jù)茫叭，把那些沒有比對(duì)到基因組的reads從頭組裝出候選CDR3序列酬屉，最后用IMGT數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)注釋這些序列，保留能注釋到的作為最終組裝到的CDR3序列。
原理示意圖：
3呐萨、?TRUST的使用
一杀饵、輸入準(zhǔn)備：
輸入文件需要bam和與之對(duì)應(yīng)的索引文件bai
第一步：比對(duì)RNA-seq數(shù)據(jù)，獲得bam文件垛吗，并且將未比對(duì)上的reads和比對(duì)上的reads合并到一個(gè)bam文件里凹髓，作為TRUST輸入。
第二步：為輸入文件bam構(gòu)建索引怯屉，注意bam文件和對(duì)應(yīng)的索引文件bai要在同一個(gè)路徑下蔚舀。
二、開始組裝：
運(yùn)行TRUST锨络，組裝CDR3
例子：以及tophat做比對(duì)軟件為例
一赌躺、輸入準(zhǔn)備：
#比對(duì)RNA-seq數(shù)據(jù)
#注意使用tophat的-o參數(shù),將每個(gè)樣本比對(duì)結(jié)果單獨(dú)寫進(jìn)自己單獨(dú)的文件夾，因?yàn)閠ophat結(jié)果文件沒有樣本標(biāo)簽
tophat2 -o /pub6/temp/cmj/Bam2/sample??hg19??sample_1.fastq sample_2.fastq
#比對(duì)結(jié)果文件如下羡儿，如果不單獨(dú)建立一個(gè)文件夾礼患，后一個(gè)樣本結(jié)果可能覆蓋前一個(gè)樣本
#合并比對(duì)上和未比對(duì)上的bam文件,輸出為sample.unsorted.bam
samtools merge sample.unsorted.bam accepted_hits.bam unmapped.bam??????
#構(gòu)建sample.unsorted.bam文件的索引
samtools sort --threads 8 -o sample.sort.bam sample.unsorted.bam
samtools index sample.sort.bam
二、開始組裝：
#組裝CDR3序列
trust??-f??sample.sort.bam -g??hg19??-c
4掠归、?參數(shù)介紹
trust??-f??sample.sort.bam -g??hg19??-c
##必須參數(shù)
-f??????是你需要組裝的RNA-seq比對(duì)的結(jié)果文件缅叠，里邊需要含有未比對(duì)到基因組上的reads
-F?????處理給定文件名list下所有的文件(在一個(gè)txt文檔里)
-d?????處理給定文件夾下所有的bam文件
#以上是三選一
-g?????你要使用的索引，可選hg19或者h(yuǎn)g38
##可選參數(shù)
-c????輸出文件里虏冻，包含TCR基因的coverage文件
-B???組裝BCR的序列(我未使用過)
-B??-L??????組裝BCR的輕鏈(我未使用過)
-o 輸出結(jié)果所在的文件夾
更詳細(xì)的情況請參考：
https://bitbucket.org/liulab/trust/
或者在該鏈接下對(duì)應(yīng)的論壇交流
5肤粱、?結(jié)果文件
主要有三個(gè)文件：
其中.fa文件結(jié)果如下：
## Information line contains the following fields:
# File name
# Normalized read count, or relative expression
# Contig sequence length
# Total TCR reads count
# TRUST annotated variable gene
# TRUST annotated joining gene (and constant gene in the case of B cell heavy chain)
# Aligner reported gene (PE mode only)
# CDR3 amino acid sequence
# -log(E value), QC measure for mapping CDR3 contig to IMGT reference
# CDR3 DNA sequence
#其中第三個(gè)是每個(gè)基因覆蓋度
#txt文件和fa文件基本一樣,fa文件是經(jīng)過過濾掉一些短的CDR3 aa(來源于該軟件論壇)
Ref1: Ultrasensitive detection of TCR hypervariable-region sequences insolid-tissue RNA–seq data,Nat Genetics,30 March 2017.27
Ref2: Landscapeof tumor-infiltrating T cell repertoire of human cancers, Nat Genetics, 2016,27
