Comprehensive analysis of the immunological implication and prognostic value of CXCR4 in non-small cell lung cancer

CXCR4在非小細(xì)胞肺癌中的免疫學(xué)意義和預(yù)后價(jià)值的綜合分析

發(fā)表期刊：CANCER IMMUNOL IMMUN

發(fā)表日期：2022 Oct 29

影響因子：6.630

DOI:? 10.1007/s00262-022-03298-y

一系吩、研究背景

????????肺癌的死亡率最高，發(fā)病率在各種癌癥中排名第二，約占癌癥相關(guān)死亡總數(shù)的18%液肌。它是一種高度惡性的腫瘤。根據(jù)組織病理學(xué)類型鸥滨，約85%的肺癌被歸為非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）嗦哆，其中肺腺癌（LUAD）和肺鱗癌（LUSC）是最常見的亞型。

????????目前有48種趨化因子婿滓，屬于四個(gè)亞家族老速；它們與七種跨膜的G蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）相互作用，在體內(nèi)不同條件下影響免疫細(xì)胞的運(yùn)輸凸主。近年來(lái)橘券，許多研究表明，趨化因子/趨化因子受體環(huán)路以自分泌和旁分泌形式相互作用卿吐，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生存和生長(zhǎng)旁舰，加速腫瘤新血管生成。

二嗡官、材料與方法

1箭窜、數(shù)據(jù)來(lái)源

1） 實(shí)驗(yàn)部分涉及中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院國(guó)家癌癥中心/癌癥醫(yī)院（NCC/CAMS，中國(guó)北京）的NSCLC患者的回顧性研究衍腥，包括242名LUAD患者和188名LUSC患者（隊(duì)列1）

2） 13名LUAD患者和33名LUSC患者（隊(duì)列2）

3） CXCR4 mRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)和突變注釋數(shù)據(jù)從癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)下載

4） LUAD樣本數(shù)據(jù)集（535個(gè)癌癥組織和59個(gè)正常組織）和LUSC樣本數(shù)據(jù)表達(dá)譜（502個(gè)癌癥組織和49個(gè)正常組織）均從TCGA獲得

5） 從癌癥細(xì)胞系百科全書（CCLE）數(shù)據(jù)庫(kù)中提取了188個(gè)肺癌細(xì)胞系的RNA-seq數(shù)據(jù)

2绽快、分析流程

1） NSCLC中的腫瘤浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞景觀及其與CXCR4的相關(guān)性：CIBERSORT、TIMER

2） 評(píng)估CXCR4表達(dá)對(duì)預(yù)測(cè)免疫治療反應(yīng)的作用：從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得了經(jīng)典免疫檢查點(diǎn)的表達(dá)數(shù)據(jù)紧阔，分析了CXCR4表達(dá)與這些標(biāo)志物之間的差異和關(guān)聯(lián)性坊罢；加入被廣泛認(rèn)可的免疫反應(yīng)標(biāo)志物，腫瘤突變負(fù)擔(dān)（TMB）擅耽、免疫分?jǐn)?shù)（IPS）活孩、新抗原和腫瘤免疫功能紊亂和排斥（TIDE）分?jǐn)?shù)，以進(jìn)一步評(píng)估CXCR4潛在的免疫治療反應(yīng)預(yù)測(cè)性能

3） 基因組富集分析：GSEA

4） 免疫調(diào)節(jié)劑的確定及其與CXCR4的關(guān)系從TISIDB中確定了與CXCR4顯著相關(guān)的免疫刺激劑和免疫抑制劑乖仇，將這些免疫調(diào)節(jié)劑輸入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)憾儒，以生成一個(gè)蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)询兴，并探討它們?cè)贜SCLC中的意義；進(jìn)行了GO注釋和KEGG途徑富集分析

5） CXCR4相關(guān)免疫調(diào)節(jié)劑簽名和nomogram的構(gòu)建：識(shí)別出與LUAD和LUSC表現(xiàn)出明顯相關(guān)性的免疫刺激因子和免疫抑制劑起趾，并采用Cox模型中的Akaike信息準(zhǔn)則對(duì)變量進(jìn)行依次篩選诗舰；對(duì)年齡和TNM分期進(jìn)行了單變量和多變量Cox回歸分析，以確定NSCLC患者的獨(dú)立預(yù)后因素训裆；構(gòu)建一個(gè)nomogram眶根，為每個(gè)NSCLC患者的疾病進(jìn)展提供一個(gè)預(yù)測(cè)模型

6） 免疫組化（IHC）染色和CXCR4表達(dá)的評(píng)估、RNA制備和RT-PCR

三边琉、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

01 - CXCR4與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)之間的相關(guān)性

????????利用CIBERSORT程序計(jì)算TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中LUAD和LUSC患者的基因表達(dá)譜得到22種免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)率属百。LUAD和LUSC患者組織中的幼稚B細(xì)胞、漿細(xì)胞变姨、T濾泡輔助細(xì)胞族扰、T調(diào)節(jié)細(xì)胞、γδT細(xì)胞定欧、M1巨噬細(xì)胞渔呵、靜止樹突狀細(xì)胞（DC）和嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)水平明顯高于正常組織。腫瘤組織中靜止的CD4記憶T細(xì)胞砍鸠、活化的CD4記憶T細(xì)胞厘肮、單核細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞睦番、靜止的肥大細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)水平都明顯高于正常組織类茂。記憶B細(xì)胞在LUAD組織中尤其明顯富集，而M0巨噬細(xì)胞和活化的DC在LUSC患者中明顯富集托嚣。靜止的自然殺傷（NK）細(xì)胞的浸潤(rùn)水平在LUAD和LUSC中是對(duì)比鮮明的（圖1A巩检，B）。22種免疫細(xì)胞在LUAD和LUSC腫瘤和正常組織中的不同浸潤(rùn)水平以熱圖的形式顯示出來(lái)（圖1C示启，D）兢哭。此外，相關(guān)熱圖顯示夫嗓，22種免疫細(xì)胞在LUAD和LUSC腫瘤中表現(xiàn)出弱到中等程度的相關(guān)性（圖1E迟螺，F(xiàn)）。

圖1 TCGA NSCLC隊(duì)列中22種腫瘤浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞比例的評(píng)估

????????為了探索CXCR4表達(dá)協(xié)調(diào)LUAD和LUSC變化的潛在機(jī)制舍咖，確定了與CXCR4相關(guān)的突變基因矩父。根據(jù)CXCR4表達(dá)的中位數(shù)將LUAD患者（補(bǔ)充圖2A，C）和LUSC患者（補(bǔ)充圖2B排霉，D）分為高表達(dá)組和低表達(dá)組后窍株，構(gòu)建了一個(gè)熱圖來(lái)確定與CXCR4表達(dá)相關(guān)的突變基因的突變頻率。隨后，發(fā)現(xiàn)DNAH8球订、PAPPA2后裸、SPHKAP、XIRP2和ZNF804B（補(bǔ)充圖2E）的突變頻率在LUAD隊(duì)列的CXCR4高表達(dá)組和低表達(dá)組中存在明顯差異冒滩。同樣微驶，CSMD2、PCDH15开睡、RELN因苹、SI和ZNF804A的突變頻率在LUSC隊(duì)列的CXCR4高表達(dá)和低表達(dá)組中也有明顯不同（補(bǔ)充圖2F）。

補(bǔ)充圖2

????????為了闡明CXCR4調(diào)節(jié)不同免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的內(nèi)在機(jī)制士八，作者首先調(diào)查了主要免疫細(xì)胞與CXCR4表達(dá)之間的相關(guān)性。發(fā)現(xiàn)在LUAD中梁呈，CXCR4與腫瘤純度呈中度負(fù)相關(guān)婚度，而與B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞官卡、CD4+T細(xì)胞蝗茁、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和DC細(xì)胞的腫瘤浸潤(rùn)呈中度正相關(guān)（補(bǔ)充圖3A）寻咒。在LUSC中哮翘，CXCR4的表達(dá)與主要免疫細(xì)胞之間的相關(guān)性與LUAD中觀察到的相似，但更為顯著毛秘，特別是CXCR4與DC細(xì)胞之間的相關(guān)系數(shù)為0.624（補(bǔ)充圖3B）饭寺。接下來(lái)，分析了CXCR4中的體細(xì)胞CNAs對(duì)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的影響叫挟。在LUAD中艰匙，CXCR4中的CNAs，包括臂級(jí)缺失和臂級(jí)增益抹恳，顯著影響B(tài)細(xì)胞员凝、CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞奋献、中性粒細(xì)胞和DCs的浸潤(rùn)水平（補(bǔ)充圖3c）健霹。在LUSC中，臂級(jí)增益和高擴(kuò)增顯著影響B(tài)細(xì)胞瓶蚂、CD4+T細(xì)胞糖埋、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和DCs的浸潤(rùn)水平（補(bǔ)充圖3D）窃这。此外阶捆，還評(píng)估了LUAD和LUSC中CXCR4表達(dá)和22種免疫細(xì)胞之間的相關(guān)性。

補(bǔ)充圖3

02 - CXCR4在預(yù)測(cè)NSCLC患者免疫治療反應(yīng)中的潛在價(jià)值

????????為了探索CXCR4預(yù)測(cè)NSCLC患者免疫治療反應(yīng)的可能性，將PD1（PDCD1）洒试、PDL1（CD274）倍奢、CTLA4、LAG3垒棋、GAL9（LGALS9）卒煞、TIM-3（HAVCR2）、TIGIT和PD-1LG2（PDCD1LG2）作為免疫檢查點(diǎn)相關(guān)候選基因叼架，評(píng)估其與CXCR4的關(guān)系畔裕。結(jié)果顯示，CXCR4與LUAD中這些經(jīng)典的免疫檢查點(diǎn)的表達(dá)明顯正相關(guān)乖订，PD1扮饶、CTLA4、TIM3乍构、TIGIT和PD-1LG2的相關(guān)系數(shù)均大于0.5甜无。此外，上述免疫檢查點(diǎn)在CXCR4高表達(dá)組明顯上調(diào)哥遮。在LUSC中岂丘，CXCR4和免疫檢查點(diǎn)之間的差異和相關(guān)關(guān)系呈現(xiàn)出與LUAD相同的趨勢(shì)。

????????近年來(lái)新開發(fā)的眠饮、被廣泛認(rèn)可的免疫反應(yīng)標(biāo)志物奥帘，包括TMB、IPS仪召、neoantigen寨蹋、TIDE評(píng)分、T細(xì)胞功能障礙評(píng)分和T細(xì)胞排斥評(píng)分也被用于綜合評(píng)價(jià)扔茅。在LUAD中钥庇，沒有發(fā)現(xiàn)高低CXCR4表達(dá)組的TMB、IPS和neoantigen水平有明顯差異咖摹，但CXCR4高表達(dá)組的TIDE評(píng)分明顯較低评姨，T細(xì)胞功能障礙評(píng)分較高，T細(xì)胞排除評(píng)分較低萤晴，說明CXCR4高表達(dá)組可能對(duì)免疫治療更敏感（補(bǔ)充圖7A）吐句。在LUSC中，CXCR4高表達(dá)組的TMB店读、IPS和T細(xì)胞功能障礙評(píng)分明顯增加嗦枢，而TIDE評(píng)分和T細(xì)胞排異評(píng)分明顯下降，也顯示了CXCR4在預(yù)測(cè)免疫治療反應(yīng)方面的潛力（補(bǔ)充圖7B）屯断。

補(bǔ)充圖7

????????接下來(lái)文虏，對(duì)患者（隊(duì)列2）進(jìn)行RT-PCR分析侣诺，以驗(yàn)證CXCR4表達(dá)與免疫治療反應(yīng)之間的相關(guān)性。在LUAD患者中氧秘，CXCR4的高表達(dá)與更好的免疫治療反應(yīng)基本一致年鸳。四名PR的患者中，有三人的CXCR4表達(dá)高于SD的患者（圖2A丸相，B）搔确。百分比直方圖還顯示，在LUAD中灭忠，CXCR4高表達(dá)組的反應(yīng)率高于低表達(dá)組膳算，但由于樣本量的限制，沒有得到明顯的P值（圖2C）弛作。在LUSC患者中涕蜂，PR和CR患者顯示出CXCR4的高表達(dá)（圖2E，F(xiàn)）映琳。百分比直方圖顯示机隙，在LUSC中，CXCR4高表達(dá)組的反應(yīng)率高于低表達(dá)組（圖2G）刊头。ROC曲線顯示黍瞧，CXCR4表達(dá)在LUAD免疫治療反應(yīng)隊(duì)列中的AUC值為0.7778诸尽，在LUSC免疫治療反應(yīng)隊(duì)列中的AUC值為0.7231原杂，表明CXCR4表達(dá)水平具有預(yù)測(cè)免疫療效的良好潛力（圖2D，H）您机。此外穿肄，對(duì)隊(duì)列2樣本進(jìn)行IHC染色，以探索CXCR4表達(dá)與免疫治療反應(yīng)的相關(guān)性际看。在最后的26個(gè)IHC染色樣本中咸产，分別在LUAD、LUSC和總體三組進(jìn)行分析仲闽，發(fā)現(xiàn)CXCR4高表達(dá)組和低表達(dá)組之間的免疫治療反應(yīng)沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（補(bǔ)充圖8A-C）脑溢。然而，在26名NSCLC患者中赖欣，38%的樣本在RNA和蛋白水平上有一致的CXCR4表達(dá)屑彻，這需要通過擴(kuò)大樣本進(jìn)一步驗(yàn)證（補(bǔ)充圖8D）。

圖2 CXCR4可預(yù)測(cè)NSCLC中的抗PD-1免疫療法反應(yīng)

補(bǔ)充圖8

03 - CXCR4相關(guān)的生物過程和途徑

????????通過GSEA確定與LUAD和LUSC中CXCR4上調(diào)相關(guān)的信號(hào)通路顶吮。MYC靶點(diǎn)社牲、異體移植排斥反應(yīng)、DNA修復(fù)和炎癥反應(yīng)是LUAD中富集的前四個(gè)通路（補(bǔ)充圖10A）悴了。Notch信號(hào)搏恤、TGF-beta信號(hào)违寿、頂端連接和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化是LUSC富集的前四個(gè)途徑（補(bǔ)充圖10B）。CCLE數(shù)據(jù)庫(kù)中118個(gè)肺癌細(xì)胞系的RNA-seq數(shù)據(jù)顯示熟空，糖胺聚糖降解藤巢、長(zhǎng)期抑制、磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)和半乳糖代謝是肺癌細(xì)胞中最豐富的信號(hào)通路（補(bǔ)充圖10C-F）痛阻。

補(bǔ)充圖10

04 - CXCR4在NSCLC中表達(dá)的預(yù)后潛力

????????為了闡明CXCR4表達(dá)在LUAD和LUSC中的預(yù)后價(jià)值菌瘪，對(duì)NCC隊(duì)列的獨(dú)立樣本進(jìn)行了IHC染色和生存分析，發(fā)現(xiàn)CXCR4的高表達(dá)與LUAD（圖3A）以及LUSC患者（圖3B）的預(yù)后不良明顯相關(guān)阱当。用CXCR4抗體對(duì)LUAD和LUSC腫瘤組織進(jìn)行IHC染色俏扩，分別見圖3C和D。

圖3 基于NCC隊(duì)列的NSCLC中CXCR4的生存分析

????????進(jìn)一步弊添，LUAD患者的單變量分析顯示录淡，OS與年齡、腫瘤長(zhǎng)度油坝、分化程度嫉戚、T期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移澈圈、TNM分期和CXCR4表達(dá)顯著相關(guān)彬檀。多變量分析顯示，年齡瞬女、腫瘤長(zhǎng)度窍帝、分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和CXCR4表達(dá)是LUAD的獨(dú)立預(yù)后因素诽偷。在LUSC患者中坤学，OS與腫瘤長(zhǎng)度、分化程度报慕、T分期深浮、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期顯著相關(guān)，T分化程度眠冈、T分期和TNM分期被確定為L(zhǎng)USC的獨(dú)立預(yù)后因素飞苇。

05 - 構(gòu)建基于CXCR4相關(guān)免疫調(diào)節(jié)劑的預(yù)后特征

????????為了進(jìn)一步闡明CXCR4的免疫特性，作者鑒定了19種免疫刺激因子和11個(gè)免疫抑制劑與LUAD以及LUSC中的CXCR4顯著相關(guān)（圖4A, B）蜗顽。隨后布卡，在STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中構(gòu)建了一個(gè)包含30個(gè)明顯相關(guān)的免疫調(diào)節(jié)劑的PPI網(wǎng)絡(luò)，包含30個(gè)節(jié)點(diǎn)和262條邊（圖4C）诫舅。GO富集分析顯示羽利，這30種免疫調(diào)節(jié)劑所涉及的生物過程（BP）、細(xì)胞成分（CC）和分子功能（MF）涵蓋了淋巴細(xì)胞活化刊懈、白細(xì)胞細(xì)胞間粘附这弧、質(zhì)膜外側(cè)娃闲、腫瘤壞死因子受體結(jié)合等調(diào)節(jié)。KEGG分析顯示了免疫調(diào)節(jié)劑參與的頂級(jí)信號(hào)途徑匾浪，包括腸道免疫網(wǎng)絡(luò)的IgA產(chǎn)生皇帮、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體的相互作用和細(xì)胞粘附分子（圖4D）。

圖4 識(shí)別與CXCR4有顯著關(guān)系的免疫調(diào)節(jié)劑

????????為了探索CXCR4的預(yù)后價(jià)值蛋辈，在LUAD和LUSC中構(gòu)建了基于CXCR4相關(guān)免疫調(diào)節(jié)劑的預(yù)后特征属拾。在LUAD中，對(duì)確定的免疫調(diào)節(jié)因子進(jìn)行了單變量和多變量的Cox回歸分析冷溶，發(fā)現(xiàn)HAVCR2渐白、TGFBR1、CD40LG逞频、CD70纯衍、CD80、KLRK1苗胀、MICB和TNFRSF17與LUAD患者的OS顯著相關(guān)襟诸。隨后，調(diào)整了截止值基协，構(gòu)建了一個(gè)預(yù)后特征歌亲。根據(jù)最低標(biāo)準(zhǔn)和每種免疫調(diào)節(jié)劑的風(fēng)險(xiǎn)得分，產(chǎn)生了一個(gè)包含12種免疫調(diào)節(jié)劑（HAVCR2澜驮、TGFBR1陷揪、CD40、CD40LG泉唁、CD70鹅龄、CD80揩慕、CXCR4亭畜、ENTPD1、KLRK1迎卤、MICB拴鸵、TNFRSF14和TNFRSF17）的簽名（圖5A）。LUAD風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分計(jì)算如下：

????????風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分=（0.5448 * HAVCR）+（2.0341 * TGFBR1）+（0.7648 * CD40）+（0.3699 * CD40LG）+（2.9431 * CD70）+（0.6282 * CD80）+（0.6749 * CXCR4）+（0.7319 * ENTPD1）+（0.6553 * KLRK1）+（3.0730 * MICB）+（0.5057 * TNFRSF14）+（0.7327 * TNFRSF17表）蜗搔。根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分中值將患者分為高危組和低危組劲藐。生存分析顯示笆载，高危組的OS明顯短于低危組（圖5C）姑曙。高危組和低危組的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和基于TNM分期的曲線下面積（AUC）分別為0.786和0.683，結(jié)合風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和TNM分期計(jì)算的AUC為0.816趋厉，表明該特征的預(yù)測(cè)性能良好（圖5E）缝龄。同樣汰现，在LUSC中挂谍，根據(jù)CXCR4相關(guān)的免疫刺激物和免疫抑制劑構(gòu)建了16種免疫調(diào)節(jié)物（ADORA2A、BTLA瞎饲、CTLA4口叙、IDO1、TGFBR1嗅战、C10orf54妄田、CD70、HHLA2驮捍、ICOSLG疟呐、IL6、IL6R东且、KLRC1萨醒、KLRK1、PVR苇倡、TNFRSF13C和TNFRSF18）的預(yù)后簽名（圖5B）富纸。高風(fēng)險(xiǎn)分值與LUSC患者的不良預(yù)后明顯相關(guān)（圖5D）。風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的ROC-AUC為0.809旨椒，通過結(jié)合風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和TNM分期計(jì)算的AUC為0.817（圖5F）晓褪。

圖5 基于30種CXCR4相關(guān)免疫調(diào)節(jié)劑的NSCLC預(yù)后特征的構(gòu)建

?????????圖6A和B通過點(diǎn)狀分布圖和熱圖顯示每個(gè)LUAD和LUSC患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分、OS和生存狀態(tài)综慎。單變量Cox回歸模型顯示涣仿，TNM病理分期、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與LUAD和LUSC的OS顯著相關(guān)示惊，多變量Cox回歸分析證實(shí)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分是LUAD的獨(dú)立預(yù)后因素（圖6C好港，D）。最后米罚，根據(jù)LUAD和LUSC患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分構(gòu)建了一個(gè)預(yù)后nomogram钧汹，它可以通過不同的變量計(jì)算出3年和5年的生存概率。

圖6 評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的預(yù)后價(jià)值

四录择、結(jié)論

????????綜上所述拔莱，本研究初步顯示了免疫TME在NSCLC患者中的重要性，并確定了CXCR4與NSCLC免疫細(xì)胞浸潤(rùn)之間的相關(guān)性隘竭。作者在兩個(gè)NSCLC獨(dú)立隊(duì)列中證明了CXCR4在預(yù)測(cè)免疫治療反應(yīng)方面強(qiáng)大而可靠的預(yù)后價(jià)值和性能塘秦。更重要的是，所構(gòu)建的CXCR4相關(guān)免疫調(diào)節(jié)劑的預(yù)后特征被證明能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)LUAD和LUSC患者的生存狀態(tài)动看，并應(yīng)在臨床中實(shí)施尊剔。