hello，大家好爵嗅，在昨天分享的文章10X單細(xì)胞娇澎、VDJ、空間轉(zhuǎn)錄組助力研究轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的免疫圖譜操骡，提到了記憶CD8⁺ T細(xì)胞分為兩種九火，常駐記憶（T_rm）和循環(huán)記憶（T_cirm）細(xì)胞,兩種細(xì)胞對(duì)于抗腫瘤都起到了關(guān)鍵的作用赚窃，但上一篇主要是研究各個(gè)組織的T_rm對(duì)于抗腫瘤擴(kuò)散的關(guān)鍵作用，而今天岔激，我們要討論一下淋巴結(jié)處的CD8⁺ T細(xì)胞的抗腫瘤特性勒极，參考文章在A reservoir of stem-like CD8⁺ T cells in the tumor-draining lymph node preserves the ongoing antitumor immune response，2021年10月發(fā)表于Science Immunology虑鼎，IF18分辱匿，值得借鑒。

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Abstract

“干細(xì)胞樣” TCF1⁺ CD8⁺ T (T_SL) 細(xì)胞對(duì)于 T 細(xì)胞反應(yīng)的長(zhǎng)期維持和免疫治療的療效是必要的炫彩，但是匾七，由于腫瘤包含驅(qū)動(dòng) T 細(xì)胞終末分化的信號(hào)，這些細(xì)胞如何在腫瘤中維持還不清楚江兢。在這項(xiàng)研究中昨忆，發(fā)現(xiàn)在肺腫瘤的整個(gè)發(fā)展過(guò)程中都存在少量 TCF1⁺ 腫瘤特異性 CD8⁺ T 細(xì)胞。然而杉允，大多數(shù)瘤內(nèi) T 細(xì)胞隨著腫瘤的進(jìn)展而分化邑贴，對(duì)應(yīng)于腫瘤微環(huán)境 (TME) 從“熱”（T 細(xì)胞發(fā)炎）到“冷”（非 T 細(xì)胞發(fā)炎）的免疫轉(zhuǎn)變。相比之下叔磷，tumor-draining lymph nodes (dLN) 中的大多數(shù)腫瘤特異性 CD8⁺ T 細(xì)胞具有與慢性淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒感染的 T_SL 相似的功能和基因表達(dá)特征拢驾，并且盡管 TME 發(fā)生了變化，但該群體隨著時(shí)間的推移保持穩(wěn)定改基。 dLN T 細(xì)胞是其分化程度更高的腫瘤內(nèi)對(duì)應(yīng)物的發(fā)育前體繁疤，并且與其克隆相關(guān)。分析的數(shù)據(jù)支持以下假設(shè)：dLN T 細(xì)胞是腫瘤中 TCF1⁺ T 細(xì)胞的發(fā)育前體秕狰，通過(guò)持續(xù)遷移維持稠腊。最后，與 T_SL 相似的 CD8⁺ T 細(xì)胞也存在于肺腺癌患者的淋巴結(jié)中鸣哀，這表明類(lèi)似的模型可能與人類(lèi)疾病相關(guān)麻养。因此，猜想 dLN T_SL 儲(chǔ)庫(kù)在腫瘤發(fā)展過(guò)程中維持抗腫瘤 T 細(xì)胞和保護(hù)它們免受 TME 中發(fā)生的終末分化方面具有關(guān)鍵作用诺舔。

INTRODUCTION

非小細(xì)胞肺癌 (NSCLC) 是最致命的癌癥之一，但免疫檢查點(diǎn)抑制劑 (ICI)备畦，如抗程序性細(xì)胞死亡 1 (PD-1) 和抗程序性死亡配體 1 (PD-L1)低飒，具有在約 20% 的接受治療的 NSCLC 患者中提供了持久的反應(yīng)。幾個(gè)參數(shù)與反應(yīng)呈正相關(guān)懂盐，包括存在免疫“熱”腫瘤微環(huán)境（TME褥赊；包含浸潤(rùn)的 CD3⁺ T 細(xì)胞，也稱(chēng)為 T 細(xì)胞發(fā)炎）莉恼、PD-1⁺ CD8⁺ T 細(xì)胞的浸潤(rùn)拌喉、PD-L1 對(duì)腫瘤的免疫染色和免疫細(xì)胞速那，以及增加的腫瘤突變負(fù)荷/新抗原。這些觀(guān)察結(jié)果與 PD-1 阻斷增強(qiáng)熱腫瘤中“耗盡”的 PD-1⁺ 腫瘤浸潤(rùn) CD8⁺ T 細(xì)胞功能的想法一致尿背。相比之下端仰，免疫學(xué)“冷”腫瘤（也稱(chēng)為“免疫排斥”或“非 T 細(xì)胞發(fā)炎”）的患者對(duì)免疫治療反應(yīng)不佳，其抗腫瘤 CD8⁺ T 細(xì)胞反應(yīng)的狀態(tài)尚不確定田藐。由于免疫療法的反應(yīng)率低荔烧，特別是對(duì)于冷腫瘤患者，更好地了解與熱腫瘤和冷腫瘤相關(guān)的 CD8⁺ T 細(xì)胞生物學(xué)至關(guān)重要汽久。

CD8⁺ T 細(xì)胞耗竭是一個(gè)漸進(jìn)的終末分化過(guò)程鹤竭。 耗竭的 T (T_EX) 細(xì)胞的特征是喪失增殖潛能和效應(yīng)功能 [產(chǎn)生腫瘤壞死因子-α (TNFα) 和干擾素-β(IFNβ) 的能力]，以及幾種抑制性受體的表達(dá)增加 （例如景醇，PD-1 和 Tim3）和轉(zhuǎn)錄因子（例如臀稚，Blimp-1、Tox 和 Eomes）三痰。 T_EX 細(xì)胞來(lái)源于分化程度較低的前體吧寺，包括 PD-1^mid CXCR5⁺ SLAMF6⁺ TCF1⁺ “莖樣”T (T_SL) 細(xì)胞。 TCF1⁺ T_SL 細(xì)胞在慢性免疫反應(yīng)中至少有兩個(gè)功能：維持正在進(jìn)行的 T 細(xì)胞反應(yīng)和介導(dǎo)對(duì) PD-1 阻斷的治療反應(yīng)酒觅。 T 細(xì)胞因子 1 (TCF1) 的表達(dá)對(duì)于這兩種功能都是必需的撮执，因此為識(shí)別 T_SL 細(xì)胞提供了重要工具。

TCF1⁺ CD8⁺ T 細(xì)胞存在于腫瘤中舷丹，它們的存在與免疫治療后的更好結(jié)果相關(guān)抒钱。 然而，腫瘤富含促進(jìn) CD8⁺ T 細(xì)胞耗竭的信號(hào)颜凯，例如持續(xù)的抗原暴露谋币。 這就提出了一個(gè)基本問(wèn)題：在自然腫瘤發(fā)展過(guò)程中，腫瘤內(nèi) TCF1⁺CD8⁺T 細(xì)胞是如何維持?jǐn)?shù)月至數(shù)年的症概？ 此外蕾额，因?yàn)?TCF1 表達(dá)是維持 T 細(xì)胞群所必需的，所以免疫學(xué)上的冷腫瘤是否是由于腫瘤內(nèi) TCF1⁺ CD8⁺ T 細(xì)胞的丟失造成的彼城？(這個(gè)問(wèn)題很重要)

KP（Kra^{slox-stop-lox (lsl)-G12D/+}诅蝶；p53^flox/flox）模型是一種基因工程小鼠癌癥模型，它忠實(shí)地再現(xiàn)了發(fā)展中的人類(lèi)肺腺癌 (LUAD) 的組織學(xué)募壕、轉(zhuǎn)錄組學(xué)调炬、表觀(guān)基因組學(xué)和遺傳特征) 并在我們了解人類(lèi)肺癌的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。 KP 模型中的腫瘤可以被編程為表達(dá)新抗原舱馅，這允許研究正在發(fā)育的腫瘤中的腫瘤特異性 T 細(xì)胞反應(yīng)缰泡。早期表達(dá)新抗原的 KP 肺腫瘤被腫瘤特異性 CD8⁺ T 細(xì)胞浸潤(rùn)，并具有免疫學(xué)熱的 TME代嗤。然而棘钞，隨著腫瘤的發(fā)展缠借，它們會(huì)出現(xiàn)免疫學(xué)上的冷 TME，T 細(xì)胞被排除在腫瘤實(shí)質(zhì)之外宜猜，并被限制在三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu) (T_LS) 中泼返。因此，KP 模型為我們提供了一個(gè)機(jī)會(huì)來(lái)研究來(lái)自熱和冷 TME 的 T 細(xì)胞之間的差異宝恶，并評(píng)估在腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程中如何維持腫瘤特異性 CD8⁺ T 細(xì)胞的機(jī)制符隙。

RESULTS

Tumor-specific TCF1⁺ CD8⁺ T cells are present throughout disease progression

為了研究表達(dá)新抗原的肺腫瘤中腫瘤特異性 CD8⁺ T 細(xì)胞反應(yīng)，我們用單獨(dú)表達(dá) Cre 的腺病毒或慢病毒（Ad5mSPC-Cre 或 lenti-Cre）氣管內(nèi)感染 KP-NINJA 小鼠（KP × R26-NINJA × CCSP-rtTA Tg）垫毙。 在該模型中霹疫，受感染的肺上皮細(xì)胞中的 Cre 表達(dá)會(huì)激活 Kras G12D 并消除 Trp53。 新抗原在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá) [來(lái)自淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒 (LCMV) 糖蛋白的 GP33-43 和 GP66-77] 由多西環(huán)素和他莫昔芬治療在感染后 7 至 10 天開(kāi)始 (p.i.) 開(kāi)始综芥。 Cre 暴露的細(xì)胞在給予強(qiáng)力霉素和他莫昔芬之前保持新抗原陰性丽蝎，允許腫瘤起始和新抗原誘導(dǎo)的時(shí)間分離。 最早在感染后 8 周內(nèi)可檢測(cè)到腫瘤特異性 CD8⁺ T 細(xì)胞膀藐，腫瘤開(kāi)始后逐漸發(fā)展屠阻。 感染后 16 至 20 周時(shí)肉眼可見(jiàn)的大塊肺腫瘤。
先前的研究表明额各，早期腫瘤和晚期腫瘤之間存在從熱腫瘤到冷腫瘤的轉(zhuǎn)變国觉。 為了證實(shí)這一點(diǎn)，我們通過(guò) CD3 免疫組織化學(xué) (IHC) 染色量化了 8 周和 16 至 20 周腫瘤中的 T 細(xì)胞浸潤(rùn)虾啦。 KP-NINJA 模型中的腫瘤經(jīng)歷了從免疫熱到免疫冷 TME 的轉(zhuǎn)變麻诀。 這種轉(zhuǎn)變不是由于腫瘤抗原的丟失，因?yàn)橛?20 周腫瘤制成的細(xì)胞系表達(dá)的新抗原具有主要組織相容性復(fù)合體 (MHC) I 類(lèi)和 PD-L1 的可誘導(dǎo)表達(dá)傲醉，并引發(fā) GP33 和 GP66 特異性 CD8⁺ 和 CD4 移植后的 T 細(xì)胞反應(yīng)（分別）蝇闭。 因此，假設(shè)從熱 TME 到冷 TME 的轉(zhuǎn)變可能反映了動(dòng)物體內(nèi)腫瘤特異性 CD8⁺ T 細(xì)胞在晚期時(shí)間點(diǎn)的整體耗竭硬毕。

為了驗(yàn)證假設(shè)呻引，分析了早期（8 至 10 周）和晚期（16 周以上）瘤 KP-NINJA 小鼠肺組織腫瘤特異性 CD8⁺ T 細(xì)胞上 TCF1 和 PD-1 的表達(dá)。出乎意料的是吐咳，在研究的兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)逻悠，腫瘤中都有一群 TCF1⁺PD-1⁺CD8⁺T 細(xì)胞，其數(shù)量沒(méi)有隨著腫瘤進(jìn)展而發(fā)生實(shí)質(zhì)性變化韭脊。盡管如此蹂风，在早期和晚期時(shí)間點(diǎn)之間，腫瘤內(nèi)終末分化的 Tim3⁺ TCF1-PD-1⁺ CD8⁺ T 細(xì)胞的比例顯著增加（早期 3.7% 至 7.9%）乾蓬。腫瘤中的一部分 TCF1⁺PD-1⁺CD8⁺T 細(xì)胞也在早期 (~38%) 和晚期 (~67%) 時(shí)間點(diǎn)表達(dá) T_SL 標(biāo)志物信號(hào)淋巴細(xì)胞活化分子家族成員 6 (SLAMF6)。相比之下慎恒，SLAMF6⁺ 的瘤內(nèi) TCF1^-PD-1⁺ CD8⁺ T 細(xì)胞顯著減少（早期約 2% 至晚期約 7%）任内。當(dāng)腫瘤被編程為在 NINJA 中用含有新抗原的慢病毒表達(dá)新抗原時(shí)撵渡，也看到了類(lèi)似的結(jié)果，這表明 T 細(xì)胞分化與用于新抗原編程的方法無(wú)關(guān)死嗦∏骶啵總之，這些數(shù)據(jù)表明晚期 KP 腫瘤中的冷腫瘤表型可能不是由于 TCF1⁺ CD8⁺ T 細(xì)胞的丟失越除。(假設(shè)被否定了)

在整個(gè)腫瘤發(fā)展過(guò)程中节腐，腫瘤特異性 TCF1⁺PD-1⁺CD8⁺T 細(xì)胞的存在很有趣，因?yàn)樗砻鞔嬖诰S持腫瘤內(nèi)這一群體的機(jī)制摘盆。我們推斷這可能是由于 TCF1⁺ 細(xì)胞的局部維持和/或從遠(yuǎn)端部位遷移所致翼雀。因此，評(píng)估了來(lái)自 KP-NINJA 小鼠的 TCF1⁺PD-1⁺CD8⁺T 細(xì)胞的引流淋巴結(jié) (dLNs) 并確定了腫瘤特異性 CD8⁺T 的~65(±2.8)% 和~74(±2.4)%在腫瘤發(fā)生后 8 至 10 周和 16+ 周孩擂，dLN 中的細(xì)胞分別為 TCF1⁺ 和 PD-1⁺狼渊。與腫瘤相比，dLN 中 TCF1⁺PD-1⁺GP33 特異性 CD8⁺T 細(xì)胞數(shù)量增加了約 10 倍类垦。從表型上看狈邑，dLN 中的這個(gè)群體隨著時(shí)間的推移顯得相當(dāng)穩(wěn)定，并且在整個(gè)腫瘤發(fā)展過(guò)程中主要保持 Tim3^-蚤认。此外米苹，早期 (80.6 ± 3.54%) 和晚期 (96.7 ± 0.98%) dLN 中的大多數(shù) TCF1⁺PD-1⁺ CD8⁺ T 細(xì)胞是 SLAMF6⁺。從功能上講砰琢，盡管在體外 GP33-41 肽再刺激后蘸嘶，來(lái)自腫瘤的一部分 T 細(xì)胞產(chǎn)生了 IFNγ（5.2±1.8%），但來(lái)自 dLN 的 T 細(xì)胞似乎具有增強(qiáng)的功能能力氯析，因?yàn)?IFNγ+ 的比例增加了 10 倍再刺激 (59 ± 10.4%)亏较。總之掩缓，這些數(shù)據(jù)表明 dLN 中的大多數(shù)腫瘤特異性 CD8⁺ T 細(xì)胞是 TCF1⁺ 和 SLAMF6⁺雪情，并且這些細(xì)胞中有相當(dāng)一部分具有功能能力。調(diào)查的所有其他組織你辣，包括脾臟巡通、胸腺、骨髓舍哄、腹股溝和腸系膜 LN宴凉，不包含可觀(guān)的 GP33 特異性 TCF⁺PD-1⁺ CD8⁺ T 細(xì)胞群。

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TCF1⁺ CD8⁺ T cells are enriched in dLNs in an orthotopic lung tumor model

為了在第二個(gè)腫瘤模型中驗(yàn)證我們的結(jié)果表悬，使用源自 KP-NINJA 小鼠（20 周 p.i.）的晚期腫瘤的細(xì)胞系 (KPN1) 建立了原位肺腫瘤移植模型弥锄。 移植后第 10 天和第 20 天對(duì) dLN 和腫瘤中 GP33 特異性 CD8⁺ T 細(xì)胞的分析表明，在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)肺中都存在 TCF1⁺PD-1⁺ T 細(xì)胞，但也存在大量 TCF1⁺PD -1⁺ dLN 中的 T 細(xì)胞籽暇。 此外温治，它們?cè)?dLN 中的頻率和數(shù)量更大。 因此戒悠，使用第二個(gè)模型熬荆，我們證實(shí) dLN 是腫瘤特異性 TCF1⁺PD-1⁺CD8⁺T_SL 細(xì)胞大量富集的位點(diǎn)。

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Heterogeneous tumor-specific CD8⁺ T cells include populations of T_SL and T_EX similar to those present in chronic LCMV infection

為了了解腫瘤特異性 CD8⁺ T 細(xì)胞在早期和晚期時(shí)間點(diǎn)的分化绸狐，我們熒光激活細(xì)胞分選 (FACS) 分選了來(lái)自 KP- NINJA 小鼠 8 周（早期）和 17 周 pi （后期）并使用 T 細(xì)胞受體 (TCR-seq) 的配對(duì) V(D)J 測(cè)序進(jìn)行單細(xì)胞 RNA 測(cè)序 (RNA-seq)卤恳。 在慢性 LCMV 感染的背景下已經(jīng)很好地描述了耗竭的 CD8⁺ T 細(xì)胞譜系，KP-NINJA 模型的一個(gè)優(yōu)勢(shì)是內(nèi)源性 GP33 特異性 CD8⁺ T 細(xì)胞識(shí)別與急性 (Armstrong) 中存在的相同的抗原肽 和慢性（克隆 13）LCMV寒矿。 我們還在注射后 28 天從 C57BL/6 小鼠的脾臟中 FACS 分選了內(nèi)源性 GP33 特異性 CD8⁺ T 細(xì)胞突琳。 使用 LCMV Clone 13 或 LCMV Armstrong 并進(jìn)行單細(xì)胞 RNA-seq 和 TCR-seq。 然后我們直接比較了分類(lèi)的抗腫瘤和抗病毒 T 細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組劫窒。
分析了來(lái)自慢性 LCMV 感染的單細(xì)胞 RNA-seq 數(shù)據(jù)本今，以確定符合先前對(duì)naive、“前體耗盡”T_SL主巍、“暫時(shí)性”/遷移效應(yīng) T 細(xì)胞和終末耗盡 T_EX 細(xì)胞描述的cluster冠息。對(duì)來(lái)自慢性感染的 GP33 特異性 CD8⁺ T 細(xì)胞的無(wú)偏聚類(lèi)分析揭示了聚類(lèi)，并且根據(jù)先前與慢性 LCMV 中 T 細(xì)胞亞群（幼稚相關(guān)孕索、祖細(xì)胞相關(guān)逛艰、遷移相關(guān)、和疲憊有關(guān)）搞旭。還包括編碼 T 細(xì)胞效應(yīng)分子的基因散怖、與 CD8⁺ T 細(xì)胞分化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子以及與 TCR 信號(hào)相關(guān)的基因。根據(jù)基因表達(dá)模式肄渗，我們確定了最能代表naive（cluster 5）镇眷、T_SL（cluster 2）、遷移（cluster 7 和 0）和 T_EX（cluster 1）細(xì)胞群的cluster翎嫡。除了所選基因的表達(dá)之外欠动，基于親和力的過(guò)渡嵌入（PHATE（關(guān)于PHATE，大家可以參考我的文章10X單細(xì)胞降維分析之PHATE））的熱擴(kuò)散的無(wú)偏潛力概括了clusters之間的預(yù)期譜系關(guān)系惑申，表明從 T_SL 到遷移或 T_EX 細(xì)胞的逐步分化具伍。
我們接下來(lái)分析了來(lái)自腫瘤和 dLN 的個(gè)體樣本。對(duì)單個(gè)樣本的無(wú)偏聚類(lèi)分析表明圈驼，每個(gè)樣本都包含幾個(gè)群體人芽，包括一組具有強(qiáng)烈初始 T (T_N) 細(xì)胞特征的細(xì)胞，我們假設(shè)這些細(xì)胞在我們的 GP33 特異性 T 細(xì)胞種類(lèi)中污染了 CD8⁺ T 細(xì)胞绩脆。使用 TCR-seq 數(shù)據(jù)萤厅，我們確認(rèn) T_N 細(xì)胞cluster完全由具有獨(dú)特 TCR 序列（即單峰）的 T 細(xì)胞組成橄抹，而非 T_N 細(xì)胞cluster包含具有與其他 T 細(xì)胞“共享”的 TCR 的 T 細(xì)胞在樣本中。 dLN T 細(xì)胞的分析表明祈坠，在大多數(shù)細(xì)胞中害碾，祖細(xì)胞、遷移和衰竭相關(guān)基因以及效應(yīng)分子和轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)相對(duì)一致赦拘。相比之下，腫瘤樣本中 T 細(xì)胞中這些基因的表達(dá)存在更多異質(zhì)性芬沉。還對(duì)來(lái)自祖細(xì)胞相關(guān)躺同、遷移相關(guān)、耗竭相關(guān)丸逸、效應(yīng)分子蹋艺、轉(zhuǎn)錄因子、TCR 信號(hào)傳導(dǎo)和naive相關(guān)類(lèi)別的其他基因進(jìn)行了分析黄刚。
為了比較腫瘤捎谨、L_N 和慢性 LCMV 樣本之間的 T_SL 和 T_EX T 細(xì)胞亞群，我們共同嵌入了所有五個(gè)數(shù)據(jù)集（早期和晚期 dLN 以及腫瘤和慢性感染）憔维，并將它們與 PHATE 的共同嵌入可視化涛救。 我們確定了 12 個(gè)cluster，并且根據(jù)它們對(duì)特征panel基因的表達(dá)业扒，我們確定了 na?ve（cluster 0检吆、2 和 10）、T_SL（cluster 5程储、4 和 6）蹭沛、遷移（cluster 8 和 1）以及 T_EX（cluster 11 和 3）細(xì)胞。
這三個(gè) T_SL cluster包括一個(gè)主要由來(lái)自慢性感染的細(xì)胞（cluster 5）和一個(gè)主要由來(lái)自?xún)蓚€(gè) dLN 樣本的細(xì)胞組成的cluster（cluster 4）章鲤。 這些cluster具有相似的基因表達(dá)模式摊灭，盡管 Cd200 和 Pdcd4 存在顯著差異。 cluster 6 主要由來(lái)自早期腫瘤的細(xì)胞組成败徊，并且除 Tcf7 外帚呼，大多數(shù)祖細(xì)胞相關(guān)特征基因的表達(dá)均較低。 這些數(shù)據(jù)表明集嵌，與腫瘤中的 TCF1+ 對(duì)應(yīng)物相比萝挤，dLN 中的 TCF1⁺ SLAMF6⁺腫瘤特異性 CD8⁺ T 細(xì)胞在基因表達(dá)上更接近慢性感染的 T_SL 細(xì)胞。 這些cluster在三維 PHATE 嵌入中的放置證實(shí)了來(lái)自慢性感染的 T_SL（cluster 5根欧，棕色）和 dLN（cluster 4怜珍，紫色）中的 T_SL 之間的接近。

兩個(gè) T_EX cluster主要由來(lái)自慢性感染（cluster 11）和早期/晚期腫瘤（cluster 3）的細(xì)胞組成凤粗。cluster 11 和cluster 3 共享許多衰竭特征基因的高表達(dá)酥泛，表明來(lái)自腫瘤的 TCF1^-PD-1^hi Tim3⁺ 腫瘤特異性 CD8⁺ T 細(xì)胞與慢性 LCMV 感染中的 T_EX 細(xì)胞相似今豆。然而，與來(lái)自慢性 LCMV（cluster 11）的 T_EX 相比柔袁，來(lái)自腫瘤（cluster 3）的 T_EX 具有更高的效應(yīng)分子轉(zhuǎn)錄物（Ifng呆躲、Tnfa 和 Il2）表達(dá)。這兩個(gè)遷移細(xì)胞cluster主要由來(lái)自慢性感染的細(xì)胞（clsuter 1 和 8）支配捶索，這證實(shí)了 dLN 或腫瘤中很少有腫瘤特異性 CD8⁺ T 細(xì)胞具有這種獨(dú)特的基因表達(dá)模式插掂。cluster 6（我們根據(jù)高 Tcf7 表達(dá)將其歸類(lèi)為 T_SL cluster）增加了許多遷移特征基因的表達(dá)，這可能表明在我們的腫瘤模型中腥例，cluster 6 與該群體最接近辅甥。總之燎竖，這些數(shù)據(jù)表明腫瘤特異性 CD8⁺ T 細(xì)胞群是從 T_SL 到 T_EX 的細(xì)胞的異質(zhì)混合物璃弄，并表明終末分化可能在空間上受到調(diào)節(jié)。

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dLN T_SL cells are distinct from memory CD8⁺ T cells

T_SL 細(xì)胞與記憶 T (T_mem) 細(xì)胞共享一些特征构回，因此我們旨在直接測(cè)試 dLN 中鑒定的 T_SL 群體是否與經(jīng)典 T_mem 不同夏块。 我們比較了來(lái)自早期和晚期 dLN 的 GP33⁺ CD8⁺ T 細(xì)胞與急性 LCMV 感染 28 天后從小鼠脾臟中分選的 GP33⁺ CD8⁺ T 細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組。 編碼來(lái)自急性感染的 CD8⁺ T 細(xì)胞的cluster與編碼 dLN T 細(xì)胞的cluster不重疊纤掸。 此外脐供，CCL5 和 Ly6c2 是急性 LCMV 和早期 dLN 細(xì)胞中差異表達(dá)最高的基因之一。 這些基因分別與 Tmem 細(xì)胞的維持和歸巢有關(guān)茁肠。 相比之下患民，T_mem 細(xì)胞的祖細(xì)胞和衰竭相關(guān)基因的表達(dá)較低。 總之垦梆，這些數(shù)據(jù)證實(shí) dLN 中的腫瘤特異性 T_SL 細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄上與急性感染后形成的典型 T_mem 不同匹颤。

Progressive differentiation of CD8⁺ T cells occurs over time in tumors but not dLNs

為了可視化 CD8⁺ T 細(xì)胞分化是否在空間或時(shí)間水平上受到調(diào)節(jié)，我們將來(lái)自 GP33 特異性 CD8⁺ T 細(xì)胞在早期或晚期時(shí)間點(diǎn)成對(duì)嵌入腫瘤或 dLN 中的表達(dá)數(shù)據(jù)托猩，并使用 PHATE 可視化它們的異同印蓖。單細(xì)胞可視化方法試圖在低維中嵌入細(xì)胞之間的關(guān)系。盡管一些單細(xì)胞可視化方法僅捕獲細(xì)胞之間的局部相似性或差異[例如均勻流形近似投影 (UMAP) 或 t 分布隨機(jī)鄰域嵌入 (tSNE)]京腥，但其他方法同時(shí)捕獲局部和全局距離（擴(kuò)散圖和 PHATE） .由于 PHATE 捕獲局部和全局距離赦肃，因此這種方法能夠準(zhǔn)確地可視化沿潛在稀疏采樣路徑的細(xì)胞狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)換；因此公浪，PHATE 是發(fā)生在連續(xù)分化分布中的發(fā)育過(guò)程的理想選擇他宛。在每個(gè) PHATE 共嵌入中，我們確定了原型 na?ve (Ccr7⁺ Sell⁺ Lef⁺)欠气、T_SL (Tcf7⁺ Xcl1⁺ Slamf6⁺) 和 T_EX (Pdcd1⁺ Havcr2⁺ Cd101⁺) 細(xì)胞在嵌入圖上的位置厅各。這允許更容易地可視化這些微分狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)換。為了對(duì)我們的 PHATE 嵌入的轉(zhuǎn)換進(jìn)行無(wú)偏分析预柒，我們執(zhí)行了偽時(shí)間分析并利用了 scVelo队塘，這是一種經(jīng)過(guò)優(yōu)化的工具袁梗，可以使用來(lái)自表達(dá)數(shù)據(jù)的轉(zhuǎn)錄剪接動(dòng)力學(xué)來(lái)推斷分化軌跡。根據(jù)它們從 0 到 1 的偽時(shí)間值憔古，在每個(gè) PHATE 嵌入中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行偽著色遮怜，并且相關(guān)的直方圖顯示了作為偽時(shí)間函數(shù)的相對(duì)細(xì)胞分布頻率。提取了來(lái)自 scVelo 在共嵌入腫瘤樣本上的細(xì)胞的偽時(shí)間排序鸿市，并估計(jì)了從 T_SL 到 T_EX 的發(fā)育軌跡锯梁。這些無(wú)偏見(jiàn)的分析支持這樣一種觀(guān)點(diǎn)，即在每個(gè)嵌入中焰情，分化的方向都從樸素到 T_SL 再到 T_EX涝桅。這使我們能夠通過(guò)評(píng)估來(lái)自每個(gè)樣本的細(xì)胞在 PHATE 嵌入中的相對(duì)位置來(lái)確定腫瘤特異性 CD8⁺ T 細(xì)胞分化是如何調(diào)節(jié)的。

下圖顯示了腫瘤和 dLN 中 T 細(xì)胞分化的時(shí)間調(diào)控烙样。在腫瘤 PHATE 嵌入中，觀(guān)察到不同的初始細(xì)胞和 T_EX 細(xì)胞蕊肥，但難以識(shí)別原型 T_SL 細(xì)胞谒获，這與這些細(xì)胞可能不在我們模型中的腫瘤中的想法一致。 T_EX 樣細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)來(lái)自晚期腫瘤壁却，而早期腫瘤包含越來(lái)越少和越來(lái)越分化的 CD8⁺ T 細(xì)胞的混合物批狱。因此，隨著腫瘤的發(fā)展展东，我們觀(guān)察到腫瘤特異性 T 細(xì)胞群向更加終末分化的狀態(tài)發(fā)展赔硫。這與 TME 在早期腫瘤和晚期腫瘤之間從 T 細(xì)胞發(fā)炎到非 T 細(xì)胞發(fā)炎的總體轉(zhuǎn)變相對(duì)應(yīng)。在 dLN 中盐肃，確定了不同的原始細(xì)胞和 T_SL 細(xì)胞爪膊，但更難以辨別原型 T_EX 群體。與腫瘤相反砸王，來(lái)自早期和晚期 dLN 的細(xì)胞分布在很大程度上是重疊的推盛。同樣，scVelo 分析證實(shí)早期和晚期 dLN 的細(xì)胞之間沒(méi)有一致的分化方向谦铃。來(lái)自 dLN 的 T 細(xì)胞在早期和晚期時(shí)間點(diǎn)也顯示出類(lèi)似的偽時(shí)間分布耘成。早期和晚期 dLN 樣本之間的相似性值得注意，因?yàn)樗鼈兪菑哪[瘤發(fā)展不同階段的動(dòng)物中分離出來(lái)的驹闰，它們的穩(wěn)定性與 TME 中 T 細(xì)胞中觀(guān)察到的變化形成鮮明對(duì)比瘪菌。總之，這些數(shù)據(jù)表明嘹朗，在腫瘤發(fā)展過(guò)程中师妙，dLN 中的大多數(shù)腫瘤特異性 CD8⁺ T 細(xì)胞保持穩(wěn)定、分化程度較低的狀態(tài)骡显，而腫瘤中的 T 細(xì)胞逐漸分化為終末期疆栏。

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A continuum of differentiation defines the transition of tumor-specific CD8⁺ T cells from dLNs to tumor(空間位置）

分析了空間位置（dLN 與腫瘤）如何影響腫瘤特異性 CD8⁺ T 細(xì)胞分化曾掂。在早期和晚期小鼠中，我們?cè)趦蓚€(gè)時(shí)間點(diǎn)都觀(guān)察到了不同的初始壁顶、T_SL 和 T^EX 細(xì)胞珠洗，并且偽時(shí)間和 scVelo 分析支持從原型 T_SL 到原型 T_EX 細(xì)胞的連續(xù)分化軌跡。在這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)若专，細(xì)胞與 dLN 和腫瘤明顯分離许蓖，分化程度較低的 T 細(xì)胞主要來(lái)自 dLN，而分化程度較高的 T 細(xì)胞主要來(lái)自腫瘤调衰。在極端情況下膊爪，兩個(gè)部位的細(xì)胞平滑過(guò)渡，并且從 dLN 到腫瘤的速度模式很強(qiáng)嚎莉。轉(zhuǎn)錄動(dòng)力學(xué)表明 dLN 內(nèi)的假定分化運(yùn)動(dòng)向在腫瘤中觀(guān)察到的分化程度更高的狀態(tài)移動(dòng)米酬，這可能是由細(xì)胞從 dLN 遷移到腫瘤所驅(qū)動(dòng)的。偽時(shí)間分析支持這一結(jié)論趋箩，因?yàn)?dLN 和腫瘤 T 細(xì)胞分別在早期和晚期偽時(shí)間（分別為 0 和 1）富集赃额，且分布更均勻。這提供了一種方法來(lái)可視化初始相關(guān)叫确、祖細(xì)胞相關(guān)跳芳、遷移相關(guān)、耗竭相關(guān)竹勉、效應(yīng)分子和轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)如何隨著細(xì)胞在早期和晚期荷瘤小鼠中的分化而發(fā)生變化飞盆。隨著偽時(shí)間的進(jìn)展（0到1），祖細(xì)胞相關(guān)基因減少次乓，遷移相關(guān)吓歇、耗竭相關(guān)和效應(yīng)分子基因增加。此外檬输，對(duì)與 TCR 信號(hào)相關(guān)的基因的分析照瘾，如 Nr4a1、Nr4a2丧慈、Nr4a3析命、Egr1、Atf3逃默、Vps37b 和 Fosb鹃愤，也顯示了整個(gè)偽時(shí)間的明顯增加。
TCR 信號(hào)被認(rèn)為驅(qū)動(dòng) CD8⁺ T 細(xì)胞反應(yīng)的終末分化完域。 為了更好地可視化哪些 T 細(xì)胞正在接收 TCR 信號(hào)软吐，我們根據(jù) Nr4a1 (Nur77) 表達(dá)對(duì) 8 周和 17 周的 PHATE 共嵌入進(jìn)行了偽彩色，這是一種常用的 TCR 信號(hào)指標(biāo)吟税。 Nr4a1 在分化程度更高的細(xì)胞（在腫瘤中）增加凹耙，而 T_SL 細(xì)胞的 Nr4a1 表達(dá)水平與 TN 細(xì)胞相似姿现。 這些結(jié)果與我們之前對(duì)來(lái)自 dLN 和腫瘤（注意 TCR 信號(hào)基因）的 T_SL 和 T_EX cluster的分析一致，并表明 TCR 信號(hào)的空間調(diào)節(jié)肖抱。

The dLN maintains a reservoir of tumor-specific T_SL cells

盡管上述軌跡分析表明 dLN CD8⁺ T 細(xì)胞在腫瘤中分化為 CD8⁺ T 細(xì)胞备典，但腫瘤中的 T 細(xì)胞仍可能與 dLN 中的 T 細(xì)胞無(wú)關(guān)。為了評(píng)估 dLN 和腫瘤 T 細(xì)胞之間的譜系關(guān)系意述，我們確定了具有獨(dú)特和共享 TCR 序列的 T 細(xì)胞克隆提佣。然后我們?cè)u(píng)估了早期 dLN 和早期腫瘤以及晚期 dLN 和晚期腫瘤之間是否存在共享克隆（兩個(gè)或多個(gè)具有相同 TCRα 和 TCRβ 對(duì)的細(xì)胞）荤崇。在早期和晚期時(shí)間點(diǎn)拌屏，dLN 和腫瘤中的 GP33 特異性 CD8⁺ T 細(xì)胞之間存在大量克隆重疊。此外术荤，dLN 中單個(gè)克隆的頻率與腫瘤之間存在良好的相關(guān)性倚喂。腫瘤中共享 TCR 序列的克隆多樣性隨著時(shí)間的推移沒(méi)有太大變化（Simpsons D = 0.028 早期與 0.024 晚期），但相比之下瓣戚，早期 dLN 中的 TCR 克隆多樣性從第 8 周到第 17 周下降（Simpsons D = 0.009 早期與0.037 晚）务唐。此外，Morisita-Horn 指數(shù)在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)顯示 dLN 和腫瘤之間的高度相似性带兜，但不同時(shí)間點(diǎn)的組織之間幾乎沒(méi)有相似性。對(duì) dLN 和腫瘤中前三個(gè)克隆的分析表明吨灭，它們分布在整個(gè)分化軌跡中刚照，并以多種分化狀態(tài)和位置存在。此外喧兄，這些克隆細(xì)胞的假時(shí)間值增加并在腫瘤中達(dá)到峰值无畔。

它們轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的穩(wěn)定性以及分化程度較低的 T_SL 細(xì)胞中早期和晚期 dLN T 細(xì)胞的富集提出了一個(gè)問(wèn)題，即 dLN 中腫瘤特異性 CD8⁺ T 細(xì)胞的克隆是否在腫瘤發(fā)展過(guò)程中得以維持吠冤。 縱隔 LN（腫瘤引流）中 T 細(xì)胞的分析需要對(duì)動(dòng)物進(jìn)行安樂(lè)死浑彰，因此我們無(wú)法直接比較早期和晚期時(shí)間點(diǎn)之間的 T 細(xì)胞克隆。 因此拯辙，我們使用了為響應(yīng)共同抗原的多克隆群體定義共同 TCR motif的算法郭变，并分析了來(lái)自早期和晚期 dLN 和腫瘤的 GP33 特異性 CD8⁺ T 細(xì)胞。 我們總共鑒定了 20 個(gè) TCRα 基序和 12 個(gè) TCRβ motif涯保，并發(fā)現(xiàn) dLN 中 TCR 基序的存在與同一小鼠的腫瘤之間存在良好的一致性诉濒。 這些數(shù)據(jù)有力地支持了以下假設(shè)：dLN（可能還有腫瘤）中的大多數(shù)腫瘤特異性 CD8⁺ T 細(xì)胞在腫瘤發(fā)展過(guò)程中得以維持(這部分是我們關(guān)注的重點(diǎn))担猛。

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Migration from the dLN maintains TCF1 expression by the intratumoral T cell pool

我們的數(shù)據(jù)支持在腫瘤中維持 T 細(xì)胞的兩種非互斥模型：(i) 腫瘤中的腫瘤特異性 TCF1⁺ CD8⁺ T 細(xì)胞可能是一個(gè)自我維持的群體攻冷，它繼續(xù)增殖和分化以維持 T 細(xì)胞反應(yīng) 腫瘤，或 (ii) 腫瘤中 TCF1⁺ T 細(xì)胞的維持可能是由于少量腫瘤特異性 T_SL 從 dLN 的持續(xù)遷移接箫。 T_SL 從 dLN 以外的組織遷移是不可能的及志，因?yàn)樵谒衅渌麢z查的組織（脾片排、胸腺寨腔、骨髓、腹股溝和腸系膜 LN）中都不存在 GP33 特異性 T_SL 群率寡。

為了驗(yàn)證后一個(gè)假設(shè)迫卢，我們用 FTY720 治療 KP-NINJA 荷瘤小鼠以阻止淋巴細(xì)胞遷移。腫瘤在 KP-NINJA 小鼠中通過(guò)氣管內(nèi)感染 2.5 × 10⁷ Ad5mSPC-Cre 的斑塊形成單位 (PFU) 和如前所述的多西環(huán)素和他莫昔芬給藥勇劣，然后在注射后 6 至 9 周內(nèi)用 FTY720 或載體治療. 在 FTY720 治療 3 周后靖避，與載體治療的對(duì)照相比，腫瘤組織中 GP33 特異性 TCF1⁺CD8⁺T 細(xì)胞而非 TCF1^-CD8⁺T 細(xì)胞的頻率和數(shù)量減少比默。這表示這些細(xì)胞的數(shù)量下降了約 4 倍（從 1216 ± 258 到 335 ± 78）幻捏。相比之下，dLN 中 TCF1⁺ CD8⁺ T 細(xì)胞的數(shù)量不受 FTY720 處理的影響命咐，表明觀(guān)察到的減少可能是由于阻斷遷移的影響篡九，而不是 FTY720 對(duì) TCF1⁺ CD8⁺T 細(xì)胞的直接影響。觀(guān)察到的腫瘤中 TCF1⁺ CD8⁺ T 細(xì)胞的四倍下降比腫瘤中同期 GP33 特異性 CD8⁺ T 細(xì)胞總數(shù)的兩倍下降（從 10,488 ± 2003 到 5506 ± 1392）更為急劇醋奠，表明TCF1⁺ T 細(xì)胞群受遷移阻斷的影響更大榛臼。在腫瘤中的 GP33^-CD8⁺T 細(xì)胞群中觀(guān)察到類(lèi)似的減少。因此窜司，這些結(jié)果與腫瘤特異性 T_SL 細(xì)胞從 dLN 的遷移是維持腫瘤中抗腫瘤 T 細(xì)胞 TCF1 表達(dá)所必需的假設(shè)一致沛善。

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T_SL-like populations are present in metastatic and nonmetastatic LNs of patients with lung cancer

來(lái)自人類(lèi)患者的 dLN 通常用于診斷目的，因此很難獲得用于研究塞祈。 因此金刁，為了研究 dLN T 細(xì)胞在人類(lèi) LUAD 中的潛在重要性，我們利用了最近發(fā)表的單細(xì)胞 RNA-seq 數(shù)據(jù)集议薪，該數(shù)據(jù)集來(lái)自一項(xiàng)研究尤蛮，其中包括正常肺組織 (nLung)、含腫瘤的肺組織 (tLung)斯议、 通過(guò)手術(shù)切除或超聲引導(dǎo)下的支氣管鏡活檢從 44 名初治 LUAD 患者 (GSE131907) 收集的轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié) (mLN) 和非轉(zhuǎn)移性肺引流淋巴結(jié) (nLN)产捞。 我們根據(jù)之前的注釋對(duì)來(lái)自所有四種組織的 10,046 個(gè) CD8⁺ T 細(xì)胞進(jìn)行了cataloged ，并將它們分為 15 個(gè)cluster并使用降維方法 UMAP 進(jìn)行可視化哼御。
使用前面使用的相同特征基因坯临，我們將來(lái)自 LUAD 患者的 CD8⁺ T 細(xì)胞cluster分為 T_N 細(xì)胞樣、T_SL 樣恋昼、遷移性 T 細(xì)胞 (T_MIG) 樣和 T_EX 樣類(lèi)別尿扯。我們確定了一個(gè)原始cluster（cluster 1）、四個(gè)具有類(lèi)似 T_SL 特征的cluster（cluster 14焰雕、0衷笋、8 和 2；從高到低的 TCF7 表達(dá)排序），五個(gè)具有類(lèi)似 T_MIG 特征的cluster（cluster 11辟宗、 3爵赵、9、12 和 5泊脐；從最高到最低的 KLRG1 表達(dá)排序）空幻，以及具有類(lèi)似 T_EX 特征的四個(gè)cluster（cluster 4、7容客、10 和 1秕铛；從最高到最低的 PDCD1 表達(dá)排序）。在我們的模型中缩挑，T_SL 樣和 T_EX 樣cluster的基因表達(dá)特征與來(lái)自荷瘤 KP-NINJA 小鼠的這些群體顯著相似但两。 73% 的 nLN CD8⁺ T 細(xì)胞是 T_SL 樣的，與我們?cè)谛∈笾械陌l(fā)現(xiàn)一致供置。 T_SL 樣細(xì)胞分別占來(lái)自 tLung 的 CD8⁺ T 細(xì)胞的 31%谨湘，僅占來(lái)自 mLN 和 nLung 的 CD8⁺ T 細(xì)胞的 9% 和 15%。相比之下芥丧，類(lèi) T_EX 細(xì)胞cluster在 mLN 和 tLung 中占主導(dǎo)地位（分別為 61% 和 61%）紧阔。 nLung 組織包含的細(xì)胞主要屬于 T_MIG 樣cluster (78%)⌒＃總之擅耽，來(lái)自 LUAD 患者的這些數(shù)據(jù)支持我們的假設(shè)，即 T_SL 細(xì)胞駐留在 dLN 中物遇，并且在 dLN T 細(xì)胞遷移到腫瘤后發(fā)生分化秫筏。

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DISCUSSION

TCF1⁺PD-1⁺ CD8⁺ T 細(xì)胞存在于人和鼠腫瘤中，是維持抗腫瘤 T 細(xì)胞反應(yīng)和免疫治療后反應(yīng)所必需的挎挖，但其維持機(jī)制尚不清楚。使用 LUAD 的本地模型航夺，我們發(fā)現(xiàn)瘤內(nèi) TCF1⁺PD-1⁺CD8⁺T 細(xì)胞群是通過(guò)從 dLN 遷移來(lái)維持的蕉朵。 dLN 中的大多數(shù)腫瘤特異性 CD8⁺ T 細(xì)胞表達(dá) PD-1、TCF1 和 SLAMF6阳掐，并且具有與慢性 LCMV 感染期間觀(guān)察到的典型 T_SL 細(xì)胞更相似的轉(zhuǎn)錄模式始衅。相比之下，雖然一些瘤內(nèi) CD8⁺ T 細(xì)胞是 PD-1⁺ 和 TCF1⁺缭保，但許多不表達(dá) SLAMF6 或其他與 T_SL 細(xì)胞相關(guān)的基因汛闸。此外，隨著 TME 從熱轉(zhuǎn)變?yōu)槔湟章睿[瘤內(nèi) T 細(xì)胞群變得更加分化诸老，而 dLN 中的細(xì)胞群在轉(zhuǎn)錄和表型水平上沒(méi)有變化。這些發(fā)現(xiàn)與在組織和偽時(shí)間分析之間發(fā)現(xiàn)的共享 TCR 序列相結(jié)合钳恕，提供了令人信服的證據(jù)别伏，即 dLN 中的腫瘤特異性 CD8⁺ T 細(xì)胞在發(fā)育上與更分化的瘤內(nèi) T 細(xì)胞相關(guān)（并且可能是其發(fā)育前體）蹄衷。早期和晚期腫瘤。未來(lái)的研究將需要直接測(cè)試這一點(diǎn)厘肮。盡管大多數(shù)抗腫瘤 CD8⁺ T 細(xì)胞功能和分化的研究都集中在腫瘤組織上愧口，但我們的數(shù)據(jù)表明，腫瘤特異性 CD8⁺ T 細(xì)胞的分化過(guò)程始于 dLN类茂，dLN 作為維持 T 細(xì)胞在在整個(gè)腫瘤發(fā)展過(guò)程中呈莖狀狀態(tài)耍属。

冷腫瘤患者是否可以對(duì)免疫治療干預(yù)產(chǎn)生反應(yīng)的問(wèn)題仍然不確定。冷腫瘤具有較差的 T 細(xì)胞浸潤(rùn)和/或 T 細(xì)胞排斥巩检，這被認(rèn)為反映了抗腫瘤免疫反應(yīng)減弱或缺失厚骗，這與其對(duì)檢查點(diǎn)療法的不良反應(yīng)一致。然而碴巾，冷腫瘤與熱腫瘤具有相似的突變負(fù)荷和抗原呈遞能力溯捆，這表明它們都具有啟動(dòng)和驅(qū)動(dòng)抗腫瘤 T 細(xì)胞反應(yīng)的能力。這些發(fā)現(xiàn)與我們模型中的冷腫瘤一致厦瓢，它們維持了新抗原的表達(dá)和新抗原的體內(nèi)呈遞提揍。鑒于這些觀(guān)察結(jié)果，我們假設(shè)冷 TME 是整個(gè)宿主中腫瘤特異性 CD8⁺ T 細(xì)胞全面耗盡的結(jié)果煮仇。出乎意料的是劳跃，晚期腫瘤中的許多腫瘤特異性 CD8⁺ T 細(xì)胞是 TCF1⁺，盡管偽時(shí)間分析表明這些 T 細(xì)胞比早期腫瘤的 T 細(xì)胞分化程度更高浙垫。這些數(shù)據(jù)與腫瘤內(nèi) T 細(xì)胞分化狀態(tài)增加可以解釋晚期腫瘤的冷表型的可能性一致刨仑。其他可能性包括遷移 T 細(xì)胞無(wú)法物理進(jìn)入腫瘤或樹(shù)突狀細(xì)胞 (DC) 遷移或功能缺陷。我們還發(fā)現(xiàn)夹姥，冷 TME 并不表示腫瘤特異性 CD8⁺ T 細(xì)胞的全面衰竭杉武，因?yàn)槔淠[瘤與含有 T_SL 細(xì)胞的 dLN 相關(guān)，這些 T_SL 細(xì)胞與熱腫瘤相關(guān)的 dLN 中的 T_SL 細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄上相似辙售。因此轻抱，dLN T_SL 細(xì)胞的遠(yuǎn)端位置可能保護(hù)它們免受腫瘤發(fā)展過(guò)程中 TME 內(nèi)發(fā)生的變化。
盡管許多信號(hào)可以促進(jìn)瘤內(nèi) CD8⁺ T 細(xì)胞的分化旦部，但 TCR 信號(hào)是主要候選者祈搜。 TCR 信號(hào)在慢性感染中驅(qū)動(dòng)終末 T 細(xì)胞分化，識(shí)別更多抗原的 CD8⁺ T 細(xì)胞會(huì)遭受更嚴(yán)重的衰竭士八。同樣容燕，傳遞較弱 TCR 信號(hào)的抗原肽是 T 細(xì)胞耗竭的較弱驅(qū)動(dòng)因素。在慢性感染期間婚度，Tcf7 是維持 CD8⁺ T 細(xì)胞所必需的蘸秘，但 TCR 和炎癥信號(hào)會(huì)促進(jìn) TCF1 下調(diào)。我們發(fā)現(xiàn)腫瘤內(nèi) T 細(xì)胞具有與下游 TCR 信號(hào)相關(guān)的高水平轉(zhuǎn)錄物，而 dLN T 細(xì)胞具有這些轉(zhuǎn)錄物的低表達(dá)秘血。這些數(shù)據(jù)與 dLN 可以保護(hù) T_SL 細(xì)胞免受持續(xù)抗原暴露的想法一致味抖。我們假設(shè)瘤內(nèi) CD8⁺ T 細(xì)胞無(wú)法逃避持久性抗原，并且如果不從 dLN 遷移灰粮，腫瘤特異性 CD8⁺ T 細(xì)胞池將耗盡仔涩。此外，由于以更高的親和力識(shí)別腫瘤抗原的 T 細(xì)胞克抡持邸（所謂的“最佳擬合”克氯壑）更容易耗盡，因此 dLN 可能在防止最佳擬合克隆在腫瘤發(fā)展過(guò)程中丟失方面發(fā)揮重要作用.脾白髓可能在慢性 LCMV 感染期間發(fā)揮類(lèi)似作用柑肴，盡管白髓和紅髓都是 LCMV 克隆 13 感染的部位霞揉。我們的數(shù)據(jù)還提出了腫瘤內(nèi)niche（如 T_LS）是否可以存在于腫瘤中以保護(hù) T_SL 細(xì)胞免于分化的問(wèn)題。我們之前表明晰骑，在我們的模型中與晚期腫瘤相關(guān)的 T_LS 是抗原呈遞的位點(diǎn)适秩，但諸如 T_LS 等腫瘤近端壁龕是否可以保護(hù)駐留 T 細(xì)胞免受持續(xù)的抗原暴露還有待觀(guān)察.

我們的數(shù)據(jù)強(qiáng)調(diào)了遷移在維持腫瘤中 T_SL 細(xì)胞中的關(guān)鍵作用，但與 T 細(xì)胞在遷移前在淋巴組織中分化的觀(guān)點(diǎn)不太一致硕舆。后者已見(jiàn)于慢性 LCMV 感染秽荞，可能是由于組織中的持續(xù)感染所致。相比之下抚官，我們觀(guān)察到 TCF1^hi T 細(xì)胞在腫瘤內(nèi)分化扬跋，并且腫瘤中 TCF^hi T 細(xì)胞的存在需要遷移。我們不能排除來(lái)自除 dLN 之外的其他腫瘤外組織（例如脾臟或胸腺）的少量幼稚樣 T 細(xì)胞可能有助于在研究的時(shí)間過(guò)程中持續(xù)進(jìn)行的抗腫瘤免疫反應(yīng)的可能性凌节，因?yàn)?FTY720 治療可能也阻止從這些組織遷移钦听。然而，dLN 和腫瘤之間 TCR 序列的一致性表明這些貢獻(xiàn)將是最小的倍奢。目前尚不清楚是什么驅(qū)動(dòng)了 T_SL 細(xì)胞從 dLN 遷移到腫瘤朴上。 DC 從腫瘤遷移到 dLN 對(duì)啟動(dòng) T 細(xì)胞很重要，但 DC 在維持 dLN 中 T_SL 細(xì)胞中的作用尚不確定卒煞。一個(gè)簡(jiǎn)單的模型是來(lái)自遷移 DC 的周期性信號(hào)也是維持遷移 T 細(xì)胞群所必需的痪宰。關(guān)鍵的是，雖然我們沒(méi)有看到 FTY720 處理后 dLN 中分化程度較低的 T 細(xì)胞的積累跷坝，但 FTY720 也可能阻止抗原呈遞 DC 向 LN 遷移，這可能影響 dLN 中 T_SL 細(xì)胞的分化碉碉。需要進(jìn)一步的研究來(lái)測(cè)試哪些信號(hào)對(duì)于 dLN 中 T 細(xì)胞的維持和遷移是必要的柴钻。

dLN 在免疫治療中的作用仍不確定。 DCs 上 PD-L1 的表達(dá)對(duì)于某些腫瘤模型中抗 PD-L1 的反應(yīng)很重要垢粮，腫瘤 dLNs 中的遷移 DCs 表達(dá) PD-L1 和共刺激受體 B7-2贴届。此外，PD-1 阻斷劑可以在移植腫瘤模型中作用于 dLN。 PD-1 阻斷是否在人類(lèi) TME 之外起作用尚不清楚毫蚓，但患者抗 PD-1 治療后的療效與外周血中免疫細(xì)胞群的變化和腫瘤中 T 細(xì)胞克隆的出現(xiàn)有關(guān)之前未檢測(cè)到的治療后占键。我們對(duì)人類(lèi) CD8⁺ T 細(xì)胞的分析表明，淋巴結(jié)和腫瘤中存在 T_SL 樣細(xì)胞元潘。然而畔乙，由于 PD-1 阻斷在患有冷腫瘤的患者中功能不佳，這表明這些患者缺乏 LN T_SL 細(xì)胞翩概，或者 PD-1 阻斷不足以驅(qū)動(dòng)這些患者的 LN 的治療反應(yīng)牲距。因此，確定針對(duì) dLN 中腫瘤特異性 T 細(xì)胞的新治療策略可能是改善患有冷腫瘤的癌癥患者預(yù)后的一種手段钥庇。

MATERIALS AND METHODS(關(guān)注一下重點(diǎn)方法)

Motif analysis

Consensus motifs in grouped CDR3 amino acid sequences were identified using two motif-based sequencing analysis tools: Multiple Em for Motif Elicitation and Gapped Local Alignment of Motifs (GLAM2). The motif analysis across all four samples (early and late dLN and tumor) was performed separately for TCRα and TCRβ chain, including clones with ≥2 cells only. At first, fasta files were created separately, including TCRα or TCRβ CDR3 amino acid sequences for the clones with ≥2 cells, using Biostrings package. These fasta files were used as input files for motif analysis, separately for each chain. Filtration of CDR3 amino acid sequences were performed on the basis of low alignment scores by GLAM2. From there, CDR3 amino acid sequences for each chain were further subgrouped into separate fasta files based on similarity in sequences and alignment scores. Each subgroup of sequences for each chain were run for motif analysis using GLAM2 function and a position weight matrix as an output to define the motif for each subgroup of sequences, either for TCRα or β chain. The contribution of clones from each of the four samples to each motif (either for TCRα or TCRβ chain) was traced back using the clone IDs. After this, consensus motif for each chain was defined as having clones shared by all four samples and ranked in an order based on the number of clones, giving rise to each motif牍鞠。

Human CD8⁺ T cell single-cell RNAseq analysis

Single-cell data were obtained from the Gene Expression Omnibus (GEO) by accession code GSE131907. Data processing, analysis, and visualization were conducted using R program with package Seurat (version 3.1.0). Only CD8⁺ T cells (original labels “CD8 low T,” “Cytotoxic CD8⁺ T,” “Na?ve CD8⁺ T,” and “Exhausted CD8⁺ T”) with tissues from tumor or normal lungs and metastatic or normal LNs (original labels “tLung,” “nLung,” “mLN,” and “nLN”) were used for the analysis. Raw gene counts were log normalized by Seurat function NormalizeData with the parameter normalization.method set to “LogNormalize.” Cell clusters were identified from the normalized data using functions FindNeighbors and FindClusters on top 20 PCs and resolution 0.75. UMAP was used to visualize cell clusters based on the top 20 PCs. For the marker gene expression heatmap, relative abundances for each gene were calculated as Z-scaled average of log₂(RC + 1). Here, RC is the relative counts calculated by Seurat function NormalizeData with parameter normalization.method set to “RC.”

生活很好，有你更好