感受態(tài)細胞（competent cell）是指用理化方法誘導細胞屈张，吸收周圍環(huán)境中的DNA分子溢十，使其處于最適攝取和容納外來DNA的生理狀態(tài)巨税。主要原理就是通過處理使細胞的通透性變大，直觀的說培他，使得細胞膜表面出現(xiàn)一些孔洞鹃两，便于外源基因或載體進入感受態(tài)細胞。

其中大腸桿菌作為最早用于原核表達的菌株舀凛，其使用最為廣泛俊扳，后續(xù)衍生也相當全面。其原理主要是猛遍，在進行重組質(zhì)粒構(gòu)建的過程中馋记，將目的基因片段連入載體構(gòu)建成含有目的基因片段的重組質(zhì)粒并獲得相應菌株。并通過感受態(tài)細胞與野生菌株比較確認是否得到所需基因片段懊烤。

由此在重組質(zhì)粒構(gòu)建中梯醒，感受態(tài)細胞是不可或缺的。接下來就以耀海生物常用的大腸桿菌為例學習其中涉及到的知識腌紧。

BL21

BL21是最常用于原核表達的菌株之一茸习，其后續(xù)衍生包括BL21(DE3)、Rosetta壁肋、OrigamiB(DE3) 等一系列原核表達菌株号胚。

BL21主要適用于非毒性蛋白的表達，因為其不含T7 RNA聚合酶浸遗，所以不適用于T7啟動子驅(qū)動的蛋白表達(如：pET系列)猫胁。因為其具有大腸桿菌聚合酶，故可適用于tac或trc等使用大腸桿菌RNA聚合酶的原核系統(tǒng)的表達（如：pGEX跛锌，pMAL質(zhì)粒）

操作方法：

1. BL21感受態(tài)細胞從-80℃拿出杜漠，迅速插入冰中，5分鐘后待感受態(tài)細胞融化，加入目的DNA（質(zhì)良蒈睿或連接產(chǎn)物）并用手撥打EP管底輕輕混勻(避免用槍吸打)盼樟，冰中靜置30分鐘。

2. 42℃水浴熱激45秒锈至，迅速放回冰上并靜置2分鐘晨缴，晃動會降低轉(zhuǎn)化效率。

3. 向離心管中加入不含抗生素的無菌培養(yǎng)基 (2YT或LB)峡捡，混勻后37℃击碗，200 rpm復蘇60分鐘

4. 5000 rpm離心一分鐘收菌，留取100 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含相應抗生素的2YT或LB培養(yǎng)基上们拙。5. 將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)稍途。

星耀小TIP：

1. 感受態(tài)細胞最好在冰中緩慢融化，插入冰中8分鐘內(nèi)加入目標DNA砚婆，不可在冰中放置時間過長械拍，長時間存放會降低轉(zhuǎn)化效率。

2. 混入質(zhì)粒時應輕柔操作装盯。

3. 轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)量缆牵可相應減少最終用于涂板的菌量。

4. 誘導時埂奈，IPTG濃度可選（0.1-2 mM均可）

5. 為獲得需要量的蛋白迄损，最佳誘導時間、溫度账磺、IPTG濃度需實驗者優(yōu)化芹敌。

BL21（DE3）

BL21(DE3)菌株用于高效表達克隆于含有噬菌體T7啟動子的表達載體(如pET系列)的基因。λ噬菌體DE3區(qū)含有T7噬菌體RNA聚合酶垮抗，該基因整合于BL21的染色體上党窜，所以稱為BL21(DE3)〗柘可同時表達T7 RNA聚合酶和大腸桿菌RNA聚合酶幌衣，用于pET系列，pGEX壤玫，pMAL等質(zhì)粒的蛋白表達豁护。

操作方法：

1.快速轉(zhuǎn)化操作方法（10min）

(1). 提前10分鐘將用到的篩選培養(yǎng)基平板拿到37℃預熱。

(2). F-BL21(DE3) 感受態(tài)細胞從-80℃拿出欲间，迅速插入冰中楚里，5分鐘后待菌塊融化，加入目的DNA并用手撥打EP管底輕輕混勻猎贴，冰中靜置5分鐘班缎。

(3). 用200 μl槍將感受態(tài)細胞-DNA混合物轉(zhuǎn)移到已經(jīng)37℃預熱的LB培養(yǎng)基上蝴光，涂均勻，表面無水漬达址。

(4). 將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)蔑祟。

2.快速熱激轉(zhuǎn)化操作方法（25min,可提高轉(zhuǎn)化效率）

(1). F-BL21(DE3)感受態(tài)細胞從-80℃拿出，迅速插入冰中沉唠，5分鐘后待菌塊融化疆虚，加入目的DNA并用手撥打EP管底輕輕混勻,，冰中靜置5分鐘满葛。

(2). 42℃水浴熱激45秒径簿，迅速放回冰上并靜置2分鐘（晃動會降低轉(zhuǎn)化效率）。加入700 μl不含抗生素的LB嘀韧，37℃篇亭，200 rpm 復蘇10分鐘，涂板（均勻锄贷，表面無水漬）译蒂。

(3). 將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。

星耀小TIP

F-BL21(DE3)感受態(tài)細胞肃叶，無需42℃熱激，37℃孵育步驟十嘿，只需冰浴因惭，10min內(nèi)完成轉(zhuǎn)化、涂板操作即可绩衷。

BL21（AI）

BL21(AI)來源于BL21菌株蹦魔，為Lon蛋白酶和膜外蛋白酶OMPT的缺陷型菌株，這兩種酶的缺失有效防止異源蛋白在大腸桿菌體內(nèi)的降解咳燕。在培養(yǎng)基中添加L-阿拉伯糖可誘導araBAD啟動子下游T7RNA聚合酶的表達進而促進目的蛋白的表達勿决。在培養(yǎng)基中添加葡萄糖可抑制araBAD啟動子下游T7RNA聚合酶的表達進而抑制目的蛋白的表達。BL21(AI)感受態(tài)細胞適用于任何以T7啟動子為基礎(chǔ)的表達載體招盲，能夠進行高水平的重組蛋白表達低缩。因為菌株能夠?qū)w內(nèi)的T7 RNA聚合酶水平進行高效調(diào)節(jié)，BL21(AI) 感受態(tài)細胞能夠表達對其他BL21細胞有毒性或抑制生長的蛋白曹货。普通重組蛋白在BL21(AI) 菌株中獲得產(chǎn)量和其他BL21菌株產(chǎn)量相當咆繁；對大部分毒性蛋白，在BL21(AI) 菌株中獲得的產(chǎn)量高于BL21(DE3)pLysS菌株或BL21(DE3)菌株顶籽。

操作方法：

1. BL21(AI)感受態(tài)細胞從-80℃拿出玩般，迅速插入冰中，5分鐘后待菌塊融化礼饱，加入目的DNA（質(zhì)粱滴或連接產(chǎn)物）并用手撥打EP管底輕輕混勻(避免用槍吸打)究驴，冰中靜置25分鐘。

2. 42℃水浴熱激45秒匀伏，迅速放回冰上并靜置2分鐘洒忧，晃動會降低轉(zhuǎn)化效率。

3. 向離心管中加入700μl不含抗生素的無菌培養(yǎng)基（2YT或LB）帘撰，混勻后37℃跑慕，200rpm復蘇60分鐘。4. 5000rpm離心一分鐘收菌摧找，留取100μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含抗生素的2YT 或LB培養(yǎng)基上核行。5.將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。

BL21(DE3)pLysS

BL21(DE3)pLysS菌株攜帶pLysS質(zhì)粒蹬耘，具有氯霉素抗性芝雪。pLysS含有表達T7溶菌酶的基因，T7溶菌酶可以作用于大腸桿菌細胞壁上的肽聚糖溶解大腸桿菌综苔，能夠降低目的基因的背景表達水平惩系，但不干擾IPTG誘導的表達，適合表達毒性蛋白和非毒性蛋白如筛。

操作方法：

1.BL21(DE3)pLysS感受態(tài)細胞從-80℃拿出堡牡，迅速插入冰中，5分鐘后待菌塊融化杨刨，加入目的DNA（質(zhì)廖畋或連接產(chǎn)物）并用手撥打EP管底輕輕混勻(避免用槍吸打)，冰中靜置25分鐘妖胀。

2.42℃水浴熱激45秒芥颈，迅速放回冰上并靜置2分鐘，晃動會降低轉(zhuǎn)化效率赚抡。

3.向離心管中加入700μl不含抗生素的無菌培養(yǎng)基 (2YT或LB)爬坑，混勻后37℃，200rpm復蘇60分鐘涂臣。

4.5000rpm離心一分鐘收菌盾计，留取100μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含34 μg/ml氯霉素及所選質(zhì)粒篩選抗生素的2YT或LB培養(yǎng)基上。

5.將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)赁遗。

BL21 Star(DE3)

BL21 Star(DE3)菌株源于BL21(DE3)菌株闯估，含有rne131突變（RNaseE基因），RNaseE基因的突變降低了內(nèi)源RNase的積累吼和，增強菌株細胞內(nèi)mRNA的穩(wěn)定性涨薪，從而提高異源蛋白的表達水平。主要適用于T7啟動子表達載體(如pET系列)的高水平蛋白表達炫乓，同時含有大腸桿菌RNA聚合酶刚夺，也可用于非T7啟動子表達載體（pGEX献丑，pMAL等）的蛋白表達。由于BL21 Star(DE3)菌株的異源基因基礎(chǔ)表達水平較高侠姑，所以不適合毒性蛋白的表達创橄。

操作方法：

1.BL21 Star(DE3) 感受態(tài)細胞從-80℃拿出，迅速插入冰中莽红，5分鐘后待菌塊融化妥畏，加入目的DNA（質(zhì)粒或連接產(chǎn)物）并用手撥打EP管底輕輕混勻(避免用槍吸打)安吁，冰中靜置25分鐘醉蚁。

2. 42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰上并靜置2分鐘鬼店，晃動會降低轉(zhuǎn)化效率网棍。

3.向離心管中加入700μl不含抗生素的無菌培養(yǎng)基(2YT或LB)，混勻后37℃妇智，200rpm復蘇60分鐘滥玷。

4. 5000rpm離心一分鐘收菌，留取100μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含相應抗生素的2YT或LB培養(yǎng)基上巍棱。

5.將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)惑畴。

星耀小TIP：

1.大腸桿菌DH5α一般做克隆或保存質(zhì)粒用，BL21用來做原核表達用航徙。由于表達產(chǎn)量以及表達產(chǎn)物活性等各方面的原因如贷，一般不使用DH5α作為表達菌。

2.Pet載體是大腸桿菌蛋白表達的首選載體，主要原因是目標基因嚴格受T7強轉(zhuǎn)錄及翻譯信號控制，在宿主菌中無T7 RNA聚合酶時基因處于關(guān)閉不表達的狀態(tài)固阁。因此用不含T7 RNA聚合酶的宿主菌克隆目的基因可以避免目的基因表達蛋白對宿主菌造成毒性而引起質(zhì)粒不穩(wěn)定或颊。

BL21 Star(DE3)pLysS

BL21 Star(DE3)pLysS菌株來源于BL21(DE3)，含有rne131突變（RNaseE基因）谊路，RNaseE基因的突變降低了內(nèi)源RNase的積累讹躯，增強菌株細胞內(nèi)mRNA的穩(wěn)定性，從而提高異源蛋白的表達水平缠劝。主要適用于T7啟動子表達載體(如pET系列)的高水平蛋白表達潮梯，同時含有大腸桿菌RNA聚合酶，也可用于非T7啟動子表達載體（pGEX惨恭，pMAL等）的蛋白表達秉馏。由于BL21 Star(DE3)菌株的異源基因基礎(chǔ)表達水平較低，所以適合毒性蛋白的表達脱羡。BL21 Star(DE3)pLysS菌株攜帶pLysS質(zhì)粒萝究，具有氯霉素抗性免都。pLysS含有表達T7溶菌酶的基因，T7溶菌酶可以作用于大腸桿菌細胞壁上的肽聚糖溶解大腸桿菌帆竹，還可與T7 RNA聚合酶結(jié)合抑制其轉(zhuǎn)錄活性绕娘，進而降低目的基因的背景表達水平，但不干擾IPTG誘導的表達栽连。pLysS質(zhì)粒含有p15A復制起始子险领，可以和含有 pUC或pBR322等復制起始子的質(zhì)粒兼容。

操作方法：

1. BL21 Star(DE3)pLysS感受態(tài)細胞從-80℃拿出秒紧，迅速插入冰中绢陌，5分鐘后待菌塊融化，加入目的質(zhì)粒并用手撥打EP管底輕輕混勻噩茄，冰中靜置25分鐘下面。

2. 42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰上并靜置2分鐘绩聘，晃動會降低轉(zhuǎn)化效率沥割。

3. 向離心管中加入700 μl不含抗生素的無菌培養(yǎng)基(2YT或LB)，混勻后37℃凿菩，200 rpm復蘇60分鐘机杜。

4. 5000 rpm離心一分鐘收菌，留取100 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含相應抗生素的2YT或LB培養(yǎng)基上衅谷。

5. 將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)椒拗。

BL21-CodonPlus(de3)-RIPL

BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL菌株來源于Stratagene公司的BL21-Gold菌株，缺少Lon蛋白酶和OmpT蛋白酶获黔，從而減少對重組蛋白的降解蚀苛，補充大腸桿菌缺乏的4種稀有密碼子 (AGA, AUA, CCC, CUA)對應的tRNA (argU, ileY, proL, leuW)，提高外源基因玷氏，尤其是富含AT-或 GC-的真核基因在原核系統(tǒng)中的表達水平堵未。該菌株染色體整合了λ噬菌體DE3區(qū) (DE3區(qū)含有T7噬菌體RNA聚合酶)，可同時表達T7 RNA聚合酶和大腸桿菌RNA聚合酶盏触，可用于pET系列渗蟹、pGEX、pMAL等質(zhì)粒的蛋白表達赞辩，同時具有四環(huán)素雌芽，氯霉素，鏈霉素辨嗽，壯觀霉素抗性世落。

操作方法：

1.BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL感受態(tài)細胞從-80℃拿出，迅速插入冰中糟需，5分鐘后待菌塊融化屉佳，加入目的DNA（質(zhì)晾雌疲或連接產(chǎn)物）并用手撥打EP管底輕輕混勻(避免用槍吸打)，冰中靜置25分鐘忘古。

2.42℃水浴熱激45秒徘禁，迅速放回冰上并靜置2分鐘，晃動會降低轉(zhuǎn)化效率髓堪。

3.向離心管中加入700μl不含抗生素的無菌培養(yǎng)基 (2YT或LB)送朱，混勻后37℃，200rpm復蘇60分鐘干旁。

4.5000rpm離心一分鐘收菌驶沼，留取100μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含相應抗生素的2YT 或LB培養(yǎng)基上。

5.將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)争群。

Rosetta(DE3)

基因型：F-ompT?hsdSB(rB-mB-)?gal dcm(DE3) pRARE(argU, argW, ilex, glyT, leuW, proL) (CamR)

Rosetta 2(DE3)

基因型：F-ompThsdSB(rB-mB-)gal dcm(DE3) pRARE2 (CamR)

Rosetta-gami 2(DE3)

基因型：D(ara-leu)7697 DlacX74 DphoA PvuII phoR araD139 ahpC galE galK rpsL (DE3) F’[lac+ lacIq pro] gor522::Tn10 trxB pRARE2(CamR, StrR, TetR)

Rosetta-gami B(DE3)

基因型：F-ompThsdSB(rB-mB-)gal dcm lacY1ahpC(DE3)gor522::Tn10trxBpRARE(CamR, KanR, TetR)

共有特征：

pRARE/pRARE2：賦予其Rosetta菌株的優(yōu)點——補充大腸桿菌缺乏的6/7種稀有密碼子(AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA和[CGG])對應的tRNA回怜，提高外源基因的表達水平』槐。【使用時需添加34 μg/ml氯霉素防止質(zhì)粒丟失】

DE3：整合了λ噬菌體DE3區(qū) (DE3區(qū)含有T7噬菌體RNA聚合酶)玉雾，同時表達T7 RNA聚合酶和大腸桿菌RNA聚合酶。

可用于pET系列轻要，pGEX复旬，pMAL等質(zhì)粒的蛋白表達。

單獨特征：

Rosetta 2(DE3)：Lon蛋白酶和膜外蛋白酶OMPT的缺陷型菌株冲泥，這兩種酶的缺失有效防止異源蛋白在大腸桿菌體內(nèi)的降解驹碍。

Rosetta-gami 2(DE3)：gor522::Tn10 trxB?賦予其Origami2菌株的優(yōu)點——突變的硫氧還蛋白還原酶(thioredoxin reductase) (trxB)和谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase) (gor)基因，它們是還原途徑的兩個關(guān)鍵酶凡恍，其突變有利于高效形成正確折疊的含有二硫鍵的蛋白志秃，增強蛋白的可溶性；同時該菌株不具有卡那霉素抗性嚼酝，可用于具有卡那霉素抗性質(zhì)粒的蛋白表達浮还。

Rosetta-gami B(DE3)：除了gor522::Tn10 trxB以外，還具有lacY1基因?(半乳糖苷透性酶基因)突變賦予其Tuner菌株的優(yōu)點——IPTG以均一速度進入體系中大腸桿菌的每個細胞革半，產(chǎn)生更加嚴格碑定、均一的濃度依賴流码。

2.使用說明：

1．取100 μl感受態(tài)細胞置于冰浴中融化又官。

2．待感受態(tài)細胞融化后，向感受態(tài)細胞懸液中加入目的DNA（根據(jù)實際情況加入適量的DNA漫试，通常100 μl感受態(tài)細胞能夠被1 ng超螺旋質(zhì)粒DNA所飽和）六敬，用移液器輕輕吹打混勻，冰浴30min驾荣。

3．42℃熱擊45sec外构，然后快速將離心管轉(zhuǎn)移到冰浴中普泡，冰上靜置2-3min，該過程不要搖動離心管审编。

4．每個離心管中加入450 μl無菌的SOC或LB培養(yǎng)基（不含抗生素）撼班，混勻后置于37℃搖床， 150 rpm振蕩培養(yǎng)45～60min使菌體復蘇垒酬。

5．根據(jù)實驗需求砰嘁，取適量已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞，加到含相應抗生素的SOC或LB固體瓊脂培養(yǎng)基上勘究，用無菌的涂布棒將細胞均勻涂開矮湘，將平板置于37℃直至液體被吸收，倒置培養(yǎng)口糕，37℃培養(yǎng)12~16h缅阳。

3.注意事項：

1．剛化凍的細胞轉(zhuǎn)化效率最高，避免反復化凍景描。

2．整個動作要輕柔十办。

3．質(zhì)粒質(zhì)量和濃度等的差異會使轉(zhuǎn)化效率有所下降。

OrigamiB(DE3)

感受態(tài)細胞是采用大腸桿菌OrigamiB(DE3)菌株經(jīng)特殊工藝處理得到的感受態(tài)細胞超棺，可用于DNA的化學轉(zhuǎn)化橘洞。使用pUC19質(zhì)粒檢測，轉(zhuǎn)化效率可達107?cfu/μg说搅，-70℃保存幾個月轉(zhuǎn)化效率不發(fā)生改變炸枣。每支感受態(tài)可以酌情分裝使用，降低了實驗的成本弄唧。質(zhì)量穩(wěn)定适肠，使用方便，質(zhì)優(yōu)價廉候引。

基因型：?F-ompThsdSB(rB- mB-) galdcmlacY1ahpC(DE3)gor522::Tn10trxB(KanR,TetR)

抗生素耐藥性：細胞具有卡那霉素和四環(huán)素抗性侯养。

產(chǎn)品特點：

1.?適宜Amp抗性質(zhì)粒。

2. OrigamiB（DE3）菌株包含突變的硫氧還蛋白還原酶thioredoxin reductase(trxB)和谷胱甘肽還原酶glutathione reductase(gor)基因澄干，表達主要還原途徑的兩個關(guān)鍵酶逛揩。有利于形成正確折疊的含有二硫鍵的蛋白，增強蛋白的可溶性麸俘。

耀海分享

以上就是大腸桿菌感受態(tài)及其衍生菌株的感受態(tài)細胞的特性及其使用方式辩稽，由此可知作為最早被使用的原核的菌體，大腸桿菌感的應用之廣泛和操作之成熟从媚。通過以上的學習對于大腸桿菌的感受態(tài)細胞原理逞泄，特性及使用有一定的了解。下面就以耀海生物的某一項目具體了解。

項目目的旨在將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入三種大腸桿菌表達宿主 BL21(DE3)喷众、BL21STAR(DE3)各谚、BL21-AI，經(jīng)抗生素抗性篩選陽性克隆到千，獲得重組表達菌株;通過搖瓶誘導表達昌渤，SDS-PAGE 檢測分析，確認目的蛋白表達及其表達水平憔四，篩選優(yōu)勢菌株愈涩。

小編在此分享一下耀海生物生產(chǎn)車間內(nèi)的大致的工藝生產(chǎn)流程圖，以供參考：