Downregulation of m6A writer complex member METTL14 in bladder urothelial carcinoma suppresses tumor aggressiveness
膀胱尿路上皮癌中m6A writer復合物成員METTL14的下調抑制腫瘤侵襲性
發(fā)表期刊：Mol Oncol
發(fā)表日期： 2022 Jan 19
doi:10.1002/1878-0261.13181
一、背景
????????膀胱癌（BlCa）是全球第十大發(fā)病癌癥侵贵，是癌癥死亡的第十四大原因届搁。BlCa被進一步分為兩大類缘薛，具有獨特的病理和臨床意義：非肌層浸潤性BlCa（NMIBC）和肌層浸潤性BlCa（MIBC）。
????????表觀基因組學是指對影響RNA分子的可逆化學修飾的研究，包括mRNA和非編碼RNA。N6-甲基腺苷（m6A途茫，即腺苷堿在氮-6位的甲基化）是真核生物中最豐富的mRNA內(nèi)部化學修飾碰酝。m6A在終止密碼子附近，在3'-UTR處和長內(nèi)部外顯子內(nèi)特異性富集附迷，從而影響mRNA壽命的不同步驟，例如轉錄，剪接显歧，核輸出和翻譯。這種修飾是由m6A甲基轉移酶復合物-MTC（"writers"）催化的确镊，它由甲基轉移酶樣3和14蛋白（METTL3和METTL14）及其輔助因子（Wilms 腫瘤相關蛋白 (WTAP)士骤、Virilizer (KIAA1429/VIRMA)、RNA 結合基序蛋白 15/15B (RBM15/15B) 和鋅指 CCCH 結構域蛋白 13（HAKAI 和 ZC3H13））組成蕾域。m6A也可以通過 m6A去甲基化酶（“橡皮擦”）去除拷肌，包括人類肥胖相關蛋白 (FTO) 和 AlkB 同源物 5 (ALKBH5)到旦。此外，還有一些直接與 m6A 結合并介導其功能的蛋白質巨缘，稱為“閱讀器”添忘，包括 YTH 結構域家族和HNRNPA2B1或IGF2BP蛋白質家族。值得注意的是若锁，一些研究表明m6A和相關的調節(jié)蛋白與一些癌癥有關搁骑。
二、材料與方法
1.數(shù)據(jù)來源
(1）腫瘤樣本：120份（60份NMIBC和60份MIBC）福爾馬林固定和石蠟包埋未經(jīng)治療的組織又固；40份正常尿道粘膜（NUT）的組織樣本靶病，來源于腎細胞腫瘤（腎細胞癌或腫瘤細胞瘤）患者的腎切除標本，沒有UC病史
(2）細胞系：七個膀胱癌細胞系（MGHU3, RT112, 5637, J82, T24, UMUC3, TCCSUP）和一個來自ATCC的正常膀胱細胞系SV-HUC1用于m6A調節(jié)因子的蛋白質表征
2.實驗流程
(1）數(shù)據(jù)分析：訪問在線平臺cBio-Portal口予，評估BlCa組織中m6A“writer”和“橡皮擦”的差異表達娄周，以確定哪個亞單位可能在BlCa中發(fā)揮m6A脫控的關鍵作用；GEPIA用于分析TCGA和GTEx項目的膀胱腫瘤和正常樣本的RNA測序表達數(shù)據(jù)
(2）實驗：免疫組化沪停、膀胱癌細胞系和細胞培養(yǎng)煤辨、蛋白質的提取和定量、蛋白質印跡（WB）分析木张、免疫熒光分析众辨、RNA甲基化定量分析、CRISPR-Cas9介導的METTL14的敲除舷礼、點狀印跡鹃彻、細胞存活率測定、細胞凋亡試驗妻献、傷口愈合試驗蛛株、侵襲試驗、鄰近連接試驗育拨、絨毛膜試驗
三谨履、實驗結果
01 - 膀胱癌中m6A甲基化酶和去甲基化酶的計算機分析
????????TCGA數(shù)據(jù)庫可在cBioPortal進行分析，包括413名MIBC患者的腫瘤樣本熬丧。74%為男性笋粟，而26%為女性，診斷時的中位年齡為61歲析蝴。對編碼m6A調節(jié)蛋白的基因組區(qū)域的計算機分析顯示害捕，56%的MIBC患者有不同的分子改變（圖1A）。在所有查詢到的 m6A 調節(jié)蛋白中闷畸，VIRMA 是最常改變的基因（30%的樣本）尝盼，經(jīng)常被擴增或有表達高mRNA水平。接下來腾啥，使用GEPIA服務器东涡，分析了同一組樣本與非癌組織的表達水平比較冯吓。與正常膀胱組織相比，METTL14 mRNA的表達是所分析的樣本中唯一明顯下調的m6A調節(jié)蛋白（圖1B）疮跑。
02 - BlCa組織中m6A和m6A調節(jié)因子蛋白的免疫表達情況
????????由于沒有NMIBC的可用數(shù)據(jù)并且缺乏MIBC的驗證组贺，因此在葡萄牙波爾圖腫瘤研究所（IPO Porto）診斷和治療的膀胱癌患者的不同和獨立的組織中進一步評估m(xù)6A。對所有測試的蛋白質都觀察到了核表達祖娘。圖2A中描述了免疫染色模式的例子失尖。總的來說渐苏，METTL3掀潮、METTL14、VIRMA和ALKBH5的免疫表達水平在腫瘤和正常組織之間有明顯差異琼富。具體來說仪吧，METTL3、METTL14鞠眉、ALKBH5和VIRMA（圖2A）在BlCa中的表達明顯低于正常組織薯鼠。此外，METTL3和METTL14（異源催化核心）在MIBC中的表達水平與NMIBC相比明顯較低械蹋。然而出皇，在三個組織樣本中，m6A哗戈、WTAP和FTO的免疫染色沒有明顯的差異郊艘。
????????所有研究的writer的表達與腫瘤樣本中的m6A豐度呈正相關。除FTO外唯咬，在“橡皮擦”的表達方面也觀察到同樣的情況纱注。有趣的是，除了WTAP和兩個“橡皮擦”外副渴，大多數(shù)m6A writer和“橡皮擦”的表達之間也有相關性奈附，VIRMA和FTO之間也有相關性。 沒有發(fā)現(xiàn)任何測試的蛋白質的表達與病人的吸煙習慣煮剧、性別或診斷時的年齡有統(tǒng)計學意義上的差異。盡管如此将鸵，在METTL3的表達和病理階段之間發(fā)現(xiàn)了一個重要的關聯(lián)勉盅。事實上，METTL3的表達在晚期疾病中明顯減少（圖2B）顶掉。
03 - 細胞系中m6A和調節(jié)蛋白的細胞定位和定量分析
????????m6A調節(jié)蛋白的表達在測試的細胞系中存在明顯差異（圖3A）草娜。具體而言，與良性細胞系相比痒筒，BlCa 細胞系揭示了 METTL14 writer 的異質水平宰闰。在BlCa細胞系中茬贵，UMUC3顯示了METTL14的高相對表達∫婆郏總的來說解藻，在所有的細胞系中，所有的“writer”和“橡皮擦”都分別定位在細胞核和細胞質中（圖3B）葡盗，這與使用IHC在原發(fā)腫瘤中的觀察結果一致螟左。從整體上看，BlCa細胞與正常細胞相比表現(xiàn)出更高的m6A水平觅够，盡管沒有發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計學上的顯著差異胶背。在5637和UMUC3細胞中觀察到最高水平，大約是良性細胞系的兩倍（圖3C）喘先。
04 - METTL14在UMUC3中的敲除：體外實驗
????????雖然METTL3是研究最多的催化亞基钳吟，但METTL14作為m6A甲基轉移酶的“writers ”之一，也積極參與腫瘤的發(fā)生窘拯。由于UMUC3細胞系顯示了METTL14的相對高表達量砸抛，而且它代表了浸潤性尿路上皮癌，這是一種侵襲性的疾病形式树枫，作者決定在這個特定的細胞系中對這個角色進行敲除直焙。通過CRISPR-Cas9系統(tǒng)，METTL14-KD 在 UMUC3 中通過 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)有效完成砂轻，蛋白質水平降低了約 55%（圖?4A）奔誓，同時總 m6A 水平降低（圖?4B）。
????????METTL14-KD UMUC3細胞在24小時內(nèi)顯示出明顯的細胞凋亡（約3倍）（圖4C）搔涝，而在兩個不同的測試時間點上沒有觀察到細胞活力的明顯差異（圖4D）厨喂。此外，METTL14-KD UMUC3 細胞的遷移（24?h庄呈，P?<?0.001）（圖?4E）和細胞侵襲能力（24?h蜕煌，P?=?0.0006）（圖?4F）顯著降低。值得注意的是诬留，與加擾相比斜纪，METTL14-KD UMUC3細胞中METTL14和METTL3之間的相互作用明顯減少（圖4G）。
05 - METTL14在UMUC3中的敲除：體內(nèi)試驗
????????為了進一步了解METTL14在BlCa腫瘤生長中發(fā)揮的作用文兑，作者進行了CAM試驗盒刚。與加擾狀態(tài)相比，METTL14-KD細胞產(chǎn)生的腫瘤明顯較新陶辍（圖5A因块，B）。此外籍铁，METTL14-KD細胞在腫瘤外圍的血管數(shù)量較少涡上，即使在腫瘤大小正持憾希化的情況下也是如此（圖5C）。
四吩愧、結論
????????總的來說芋酌，m6a調控蛋白在BlCa中經(jīng)常失調。重要的是耻警，這是一項關于METTL14在BlCa中功能的全面研究隔嫡，除了評估其敲低對活力，細胞凋亡甘穿，遷移和入侵特性的表型影響外腮恩，還評估了其在120個人類患者樣本和8個不同細胞系中的表達。METTL14-KD和隨后的m6A下調降低了BlCa細胞的惡性表型温兼，表明METTL14在BlCa中具有致癌作用秸滴。
