本文來自浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院的蔡秀軍教授團(tuán)隊(duì)的一篇刊登在《Molecular Cancer》的文章（N6-methyladenosine-modified CircRNA-SORE sustains sorafenib resistance in hepatocellular carcinoma by regulating βcatenin signaling）揣非，影響因子15.302分煤墙，該文章闡述了在肝細(xì)胞癌中m6A修飾的CircRNA-SORE通過調(diào)節(jié)β-catenin信號(hào)通路維持索拉非尼耐藥性跨细。
肝細(xì)胞癌是最常見的癌癥彤钟，也是在全球上死亡率最高的一種癌癥之一，目前對(duì)肝癌的治療主要應(yīng)用手術(shù)切除癌變組織倘零，但不適用于晚期肝癌患者红碑。對(duì)于不能切除的肝癌，治療方法主要是通過移植幔虏，消融，動(dòng)脈化療栓塞贝椿，靶向治療和免疫治療想括。索拉菲尼是一種多激酶抑制劑，是美國(guó)食品和藥物管理局批準(zhǔn)的治療晚期肝癌的一線靶向藥物烙博。但由于肝癌的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜瑟蜈，大多數(shù)患者在接受索拉菲尼治療數(shù)月后會(huì)對(duì)其藥物產(chǎn)生耐藥性，使肝癌進(jìn)一步惡化渣窜，給治療帶來了巨大的困難铺根。
CircRNA最常見的作用機(jī)制是作為ceRNA，吸附各種miRNA乔宿，導(dǎo)致原本miRNA結(jié)合的mRNA的翻譯不能被miRNA阻止位迂，形成mRNA的競(jìng)爭(zhēng)性激活，從而引起下游蛋白表達(dá)水平的升高而產(chǎn)生相對(duì)應(yīng)的生理病理表現(xiàn)详瑞。目前掂林，在肝細(xì)胞癌中，CircRNA對(duì)索拉非尼的原發(fā)性和獲得性耐藥性機(jī)制尚不清楚蛤虐。
m6A修飾是真核mRNAs最普遍的內(nèi)部修飾党饮，其影響mRNA代謝的關(guān)鍵過程，包括mRNA定位驳庭、剪接刑顺、翻譯和降解氯窍，進(jìn)而調(diào)節(jié)重要的生物學(xué)過程。近年來研究者發(fā)現(xiàn)蹲堂，circRNA的m6A修飾在腫瘤的進(jìn)展中扮演著重要作用狼讨，能通過抑制腫瘤細(xì)胞分化和凋亡發(fā)揮著致癌作用。
結(jié)果
1柒竞、CircRNA-SORE在索拉菲尼耐藥的肝癌細(xì)胞系中表達(dá)上升
本研究團(tuán)隊(duì)前期首先建立了四株索拉菲尼耐藥的肝癌細(xì)胞系政供，通過生物信息學(xué)分析和分子手段找到了在耐藥形成過程中扮演著重要角色的circRNA-SORE。通過UCSC Genome Browse網(wǎng)站分析發(fā)現(xiàn)朽基，circRNA-SORE是由TLE4基因的第7位和第8位外顯子后剪接產(chǎn)生的布隔，作者也通過設(shè)計(jì)circRNA-SORE特異性引物，通過PCR產(chǎn)物跑電泳和產(chǎn)物結(jié)果測(cè)序稼虎，片段大小和序列都符合網(wǎng)站分析的結(jié)果衅檀。熒光原位雜交（FISH）發(fā)現(xiàn)circRNA-SORE定位在細(xì)胞質(zhì)中。以上所知霎俩，作者確認(rèn)了CircRNA-SORE是引起在肝癌患者中索拉菲尼耐藥的重要分子哀军。
2、CircRNA-SORE對(duì)維持索拉菲尼耐藥至關(guān)重要
為了闡明CircRNA-SORE對(duì)維持索拉菲尼耐藥起到重要的作用打却，本研究團(tuán)隊(duì)利用siRNA靶向敲低circRNA-SORE杉适，來研究CircRNA-SORE對(duì)索拉菲尼在肝癌細(xì)胞耐藥機(jī)制。結(jié)果表明敲低circRNA-SORE以及聯(lián)合使用索拉菲尼藥物柳击，肝癌細(xì)胞凋亡顯著提高猿推。通過探索CircRNA-SORE對(duì)肝癌患者無復(fù)發(fā)生存時(shí)間（RFS）的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)低表達(dá)的circRNA-SORE較高表達(dá)組具有更長(zhǎng)的RFS時(shí)間腻暮。這些結(jié)果表明了：circRNA-SORE是維持索拉非尼耐藥性的關(guān)鍵彤守，而沉默circRNA-SORE通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡顯著提高索拉非尼的療效毯侦。
3哭靖、CircRNA-SORE作為ceRNA吸附miR-103a-2-5p和miR-660-3p作用
CircRNA最主要的作用機(jī)制是通過海綿吸附miRNA，導(dǎo)致miRNA不能阻止mRNA的翻譯侈离，形成mRNA的競(jìng)爭(zhēng)性激活试幽，進(jìn)而引起下游蛋白表達(dá)水平的升高。本文作者基于相關(guān)circRNA和miRNA結(jié)合預(yù)測(cè)軟件卦碾，篩選出12種與circRNA-SORE結(jié)合的miRNA分子铺坞，通過RNA-pulldown實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)8種miRNA在circRNA-SORE上由有明顯的富集。通過在耐藥細(xì)胞中加入miR-103a-2-5p mimic和miR-660-3p mimic后發(fā)現(xiàn)洲胖，其耐藥細(xì)胞對(duì)索拉菲尼的敏感性顯著升高济榨。通過FISH技術(shù)發(fā)現(xiàn)circRNA-SORE能與miR-103a-2-5p和miR-660-3p 在細(xì)胞中共定位。通過RNA免疫共沉淀和雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步提示circRNA-SORE能與miR-103a-2-5p和miR-660-3p相結(jié)合绿映。
接著作者想弄清楚circRNA通過結(jié)合miRNA后是通過哪些信號(hào)通路來調(diào)控索拉菲尼耐藥的擒滑，作者發(fā)現(xiàn)腐晾，在肝癌的研究中，wnt/β-catenin信號(hào)通路起到關(guān)鍵的作用丐一。通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)藻糖，耐藥細(xì)胞中β-catenin的蛋白水平顯著高于野生細(xì)胞，其表達(dá)量與circRNA-SORE的表達(dá)水平呈正相關(guān)库车。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明巨柒，耐藥細(xì)胞中的β-catenin和上游wnt2b的蛋白表達(dá)水平均受到circRNA-SORE對(duì)miR-103a-5p和miR-660-3p調(diào)控影響，作者猜測(cè)circRNA-SORE有可能是通過wnt/β-catenin信號(hào)通路調(diào)控的這兩個(gè)miRNA的下游柠衍。通過位點(diǎn)突變前后的雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)了這種假設(shè)洋满。綜上所述可知，circRNA-SORE海綿吸附miR-103a-5p和miR-660-3p作用后通過wnt /β-catenin途徑來誘導(dǎo)索拉非尼耐藥珍坊。
4芦岂、circRNA-SORE存在m6A修飾作用
近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)RNA的m6A甲基化修飾在腫瘤的發(fā)展中扮演著重要的作用垫蛆，而circRNA的m6A修飾（常發(fā)生在RRm 6 ACH模體上禽最，R?=?G or A; H?=?A, C or U）。作者猜想circRNA-SORE是否也存在m6A修飾作用袱饭，通過相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)川无，發(fā)現(xiàn)circRNA-SORE序列的juction位點(diǎn)附近存在一個(gè)極有可能被m6A修飾的位點(diǎn)。RNA pulldown實(shí)驗(yàn)表明circRNA-SORE能和m6A相關(guān)的酶蛋白酶結(jié)合（YTHDF1虑乖、YTHDF2懦趋、METTL3和FTO）。再通過甲基化RNA免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)表明耐藥細(xì)胞中circRNA-SORE的m6A修飾水平較野生細(xì)胞增高疹味。最后通過對(duì)m6A甲基化相關(guān)蛋白進(jìn)行沉默發(fā)現(xiàn)仅叫，對(duì)METTL3和METTL14敲減后，circRNA-SORE的m6A修飾水平顯著下降糙捺，而對(duì)FTO敲減后诫咱，其修飾水平顯著升高，說明了circRNA-SORE有m6A修飾位點(diǎn)的存在洪灯。
5坎缭、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證circRNA-SORE會(huì)引起索拉菲尼在肝癌耐藥性
作者通過構(gòu)建小鼠肝癌成瘤模型和對(duì)應(yīng)的索拉菲尼耐藥模型，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明签钩，相比較對(duì)照組掏呼，過表達(dá)sh-circRNA-SORE組顯著增加了肝癌細(xì)胞對(duì)索拉菲尼藥物的敏感性；在肝癌成瘤模型實(shí)驗(yàn)中铅檩，結(jié)果也表明了過表達(dá)circRNA-SORE和聯(lián)合用藥后憎夷，能顯著抑制在小鼠體內(nèi)成瘤能力；作者最后做了免疫組化實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果昧旨，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)circRNA-SORE組中拾给，Wnt2b 和 β-catenin的陽(yáng)性率明顯降低富拗；在體內(nèi)水平證實(shí)了circRNA-SORE可以通過wnt /β-catenin途徑來誘導(dǎo)索拉非尼耐藥。
綜上所述鸣戴，circRNA-SORE能海綿吸附miR-103a-2-5p和miR-660-3p啃沪，促使wnt /β-catenin途徑來誘導(dǎo)索拉非尼耐藥。其主要的是由m6A修飾的circRNA-SORE使在肝癌索拉非尼耐藥形成過程中發(fā)揮了重要的作用窄锅。
