2023年2月2日，bioRxiv發(fā)表了Panagiotis F. Sarris團隊題為“The core effector RipE1 of Ralstonia solanacearum interacts with and cleaves Exo70B1 and is recognized by the Ptr1 immune receptor”的研究論文。該論文提出青枯菌的核心效應子 RipE1與 Exo70B1 相互作用并降解Exo70B1乱陡，并被 Ptr1 免疫受體識別捣炬。https ://doi.org/10.1101/2022.08.31.506019

青枯菌依賴多種毒力因子（也稱為效應子）促進多種具有重要經(jīng)濟意義的寄主植物患病熊昌。盡管其中一些效應子已被表征，但尚未顯示出能夠針對宿主的分泌機制湿酸。在這里婿屹，我們使用 NLR 植物免疫受體整合域 (ID) 的擴展庫來識別新的效應靶點。篩選發(fā)現(xiàn)稿械，青枯菌核心效應子 RipE1 與擬南芥外囊組件 Exo70B1 相關选泻。RipE1 根據(jù)其預測的半胱氨酸蛋白酶活性，在體外裂解 Exo70B1 ，并促進 Exo70B1在植物中降解页眯。RipE1 酶活性還導致 TN2 依賴性異位細胞死亡的激活梯捕。TN2 是一種非典型 NLR，已被提議用于保護 Exo70B1窝撵。盡管之前有報道稱 RipE1 可以激活模型植物物種的防御反應傀顾，但我們在此介紹一種煙草物種，其中 RipE1 的表達不會激活細胞死亡碌奉。此外短曾，我們發(fā)現(xiàn) RipE1通過其半胱氨酸蛋白酶活性被 Ptr1（一種本塞姆氏煙草CC-NLR）識別〈土樱總的來說嫉拐，這項研究揭示了一個新的 RipE1 靶點和一個新的 RipE1 激活的 NLR，同時為推進 RipE1 和同源效應子的深入研究提供了證據(jù)和新工具魁兼。

青枯菌是一種破壞性植物病原體婉徘，也是青枯病的病原體，影響超過 250 種植物咐汞，包括重要的農(nóng)藝作物 盖呼。與許多植物或動物的革蘭氏陰性細菌病原體一樣，其 III 型分泌系統(tǒng) (T3SS) 被認為是關鍵的毒力機制化撕，對于青枯菌在植物組織中成功定殖是必需的几晤。T3SS 對于病原體來說是不可或缺的，因為它負責將 70 多個 III 型效應器 (T3E) 注射到宿主細胞內(nèi)以促進定植 植阴。

RipE1 是一種 T3E蟹瘾，存在于迄今為止已測序的青枯菌的大多數(shù)菌株中，并且似乎在不同的系統(tǒng)型中高度保守墙贱。最近的數(shù)據(jù)表明效應子對毒力的貢獻热芹，雖然它似乎觸發(fā)了本塞姆氏煙草、煙草和擬南芥的植物免疫力惨撇，但其他青枯菌T3E 可能能夠抑制這些反應伊脓。RipE1 已被證明可通過其半胱氨酸蛋白酶活性促進 JAZ（茉莉酸 ZIM 結構域）阻遏物的降解，誘導 JA 信號轉(zhuǎn)導魁衙，從而抑制 SA 反應报腔，與早期表征的來自丁香假單胞菌的 RipE1 同源物 HopX1（以前稱為 AvrPphE）一致。此外剖淀，已知 RipE1 的半胱氨酸蛋白酶活性是觸發(fā)本塞姆氏煙草和擬南芥免疫反應所必需的纯蛾。除了催化三聯(lián)體之外，HopX/AvrPphE 同源物還共享一個保守的 N 末端結構域纵隔，即所謂的 A 盒翻诉，其功能未知炮姨，但顯然對于植物中的效應器功能是必需的。對于 RipE1碰煌，A-box 結構域也是觸發(fā)本塞姆氏煙草免疫反應所必需的舒岸。

基于結構預測的RipE1細胞內(nèi)功能

AlphaFold Colab 預測 RipE1 (47.31 kDa) 的 3D 結構（圖 1A）。所得結構證實RipE1具有半胱氨酸蛋白酶折疊芦圾。半胱氨酸蛋白酶（硫醇蛋白酶）是能夠通過酶活性位點中硫醇的去質(zhì)子化來降解蛋白質(zhì)的酶蛾派。因此，此類中的所有酶都具有共同的催化三聯(lián)體或二聯(lián)體个少，涉及親核半胱氨酸殘基洪乍。通過 DALI 在線服務器將預測的 RipE1 結構與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫結構進行比較。與嗜肺軍團菌周質(zhì)蛋白酶 LapG的相似性最高（圖 1C）夜焦。根據(jù)這一比較壳澳，RipE1 活性位點處延伸的疏水性表面斑塊（圖 1B）可能表明其作為底物結合的相互作用界面的作用。隨后茫经，兩種蛋白質(zhì)之間的活性位點域的疊加（圖1D）具有1.544的均方根偏差（RMSD）钾埂。RipE1的催化三聯(lián)體半胱氨酸-組氨酸-天冬氨酸(CHD)，特別是C172-H203-D222(圖1A )科平，似乎與LapG C137-H172-D189催化三聯(lián)體(圖1D )相同。RipE1 屬于 HopX1/AvrPphE 效應家族姜性，其成員共享一個保守的 N 末端結構域和一個具有預測半胱氨酸蛋白酶活性的催化三聯(lián)體瞪慧。RipE1 已被證明在體外具有半胱氨酸蛋白酶活性，并且似乎依賴它來裂解 JAZ 阻遏物部念。利用基于人工智能的結構預測（圖1）弃酌，我們進一步確認RipE1是一種半胱氨酸蛋白酶。這進一步支持了 Sang 等人的發(fā)現(xiàn)儡炼，他們報道妓湘，當屬于其催化三聯(lián)體的半胱氨酸殘基被取代時， RipE1 在本塞姆氏煙草和擬南芥植物中失去了其免疫誘導屬性乌询。

RipE1 與酵母中的六個 ID 蛋白結構域和擬南芥 Exo70B1 相互作用

為了確定 RipE1 新的假定亞細胞靶標榜贴，我們在 RipE1 和 22 個真核蛋白結構域之間進行了酵母雙雜交（Y2H）篩選，這些結構域作為集成結構域（NLR-ID）與植物 NLR 融合妹田。我們發(fā)現(xiàn)了RipE1 和 NLR-ID 之間總共 6 個相互作用（圖 2A ）唬党，其中包含大型植物蛋白家族的保守特征域。RipE1 與我們列表中的 TRX 類鬼佣、WRKY 類驶拱、Exo70 類和 CG 類 NLR-ID 相互作用，而 RipE1 與 TFIIS 類晶衷、HSF 類和 Ubox 之間也檢測到弱相互作用蓝纲。

為了本研究的目的阴孟，我們進一步研究了 RipE1 和 Exo70-ID 之間的相互作用，旨在揭示屬于宿主分泌途徑的效應靶標税迷∮浪浚基于我們之前使用 Exo70 樣 ID 作為查詢進行的 Blastp 分析，我們假設At Exo70B1（一種含有 Exo70 的擬南芥蛋白和植物外囊復合體的組成部分）最有可能是 RipE1 的目標翁狐。我們繼續(xù)測試酵母中 Exo70B1 和 RipE1 之間的相互作用类溢。如圖2B所示，Exo70B1不僅與RipE1相互作用露懒，而且還與效應子的兩個突變體RipE1-C172A相互作用闯冷，在活性位點攜帶C172A取代，并且發(fā)現(xiàn)RipE1 ΔA缺乏8個保守氨基酸(121-128)位于 HopX1 效應器家族的N 末端懈词，也稱為 A 盒蛇耀。這兩種突變是根據(jù)圖 1所示的結構預測設計的，但也是由于之前報道的它們無法在模型植物中誘導植物免疫反應坎弯。

RipE1 與At Exo70B1在植物中相互作用

RipE1 已被證明可在本塞姆氏煙草纺涤、煙草中引發(fā)過敏反應，并在擬南芥中誘導防御反應抠忘。在這項研究中撩炊，我們篩選了各種煙草物種，包括各種樟子松生態(tài)型崎脉，為我們的植物內(nèi)實驗尋找新的植物模型拧咳。我們發(fā)現(xiàn)，當通過農(nóng)桿菌介導的滲透在我們收集的煙草生態(tài)型 NS2706的葉子中瞬時表達時囚灼，RipE1 不會觸發(fā) HR 反應骆膝，因此，我們將其用作一種新工具并進行了所有進一步的研究灶体。

對該生態(tài)型的實驗阅签。為了測試 RipE1 和 Exo70B1在植物中可能的共定位，我們在煙草葉組織中分別瞬時表達與熒光標簽融合的兩種蛋白 -YFP 和 -mCherry蝎抽，通過共聚焦顯微鏡在 48hpi 觀察到政钟。如圖3A所示，RipE1和Exo70B1共定位在植物細胞的外圍樟结。

BiFC和Co-IP均表明植物中兩種蛋白質(zhì)之間的關聯(lián)锥涕。

此前已證明，在本塞姆氏煙草中狭吼，A 盒的刪除可消除 RipE1 誘導的細胞死亡层坠。該結構域雖然在 HopX1/AvrPphE 效應器家族中是保守的，但其功能未知刁笙，并且較早被提議作為促進效應器-靶點相互作用的結構域破花。我們的結果表明谦趣，刪除這個8個氨基酸結構域不會改變RipE1在離體測定中與Exo70B1的物理相互作用能力（圖2B ），但它確實消除了其在植物中與Exo70B1結合的能力座每。

RipE1在體外裂解Exo70B1

為了擴展我們對 Exo70B1 和 RipE1 之間相互作用的理解前鹅，我們在計算機中預測并可視化了相互作用（圖 4A）∏褪幔基于此舰绘，Exo70B1 146-201 aa 區(qū)域似乎接近 RipE1 半胱氨酸蛋白酶的催化三聯(lián)體。這一觀察結果以及兩種蛋白質(zhì)之間的相互作用（圖2B葱椭、圖3）表明Exo70B1是RipE1的底物捂寿。為了測試RipE1對Exo70B1的蛋白水解作用，用純化的蛋白進行體外切割測定(圖4B )孵运。將純化的 6xHis-SUMO3-Exo70B1 與 RipE1-6xHis 一起孵育秦陋，添加或不添加半胱氨酸蛋白酶抑制劑亮肽素。每種感興趣的蛋白質(zhì)和 6xHis-SUMO3 標簽均單獨孵育治笨，作為測定的陰性對照驳概。通過SDS-PAGE分析反應，然后進行抗his標簽蛋白質(zhì)印跡分析（圖4B）旷赖。RipE1 在所有情況下似乎都具有自蛋白水解活性顺又，包括在存在亮肽素的情況下。另一方面等孵，僅在不存在該抑制劑且存在RipE1的情況下才檢測到代表切割的6xHis-SUMO3-Exo70B1的條帶（參見圖4B 待榔，橙色框）（圖4B）。

從 Exo70B1 去除 His:SUMO3 標簽后流济，重復體外裂解測定。通過SDS-PAGE分析反應腌闯，然后進行銀染色（圖4C绳瘟，左）∽丝ィ基于切割的6xHis-SUMO3-Exo70B1(圖4B )條帶分子量和已去除的His-SUMO3標簽糖声，選擇三個區(qū)域通過質(zhì)譜法進一步分析，由圖4C上的箭頭標記分瘦。對 MS 衍生數(shù)據(jù)的分析識別出存在于這些區(qū)域中的 Exo70B1 肽蘸泻，如灰色區(qū)域所示（圖 4C，右）嘲玫。這些發(fā)現(xiàn)證實Exo70B1在體外被RipE1在特定序列之間切割悦施。

RipE1促進植物中Exo70B1的降解

為了研究植物中RipE1 對 Exo70B1 的可能降解，我們通過農(nóng)桿菌介導的滲透在樟子松組織中瞬時表達了感興趣的蛋白質(zhì)去团。通過SDS-PAGE和免疫印跡提取和分析蛋白質(zhì)（圖5A）抡诞，并且總共使用三次重復來對蛋白質(zhì)條帶強度進行計算機定量（圖5B）穷蛹。與體外切割的觀察結果一致(圖4 )，在植物中短暫共表達后昼汗，RipE1的表達似乎以統(tǒng)計學上顯著的方式降低了Exo70B1蛋白水平(圖5B )肴熏。與RipE1在體外對Exo70B1的裂解相比，其在植物體內(nèi)的降解顯得更為嚴重顷窒。這符合以下事實：圖 4中所示的體外實驗可能并未反映 RipE1 和 Exo70B1 之間相互作用的確切天然條件蛙吏，而圖 5中所示的實驗是在植物組織中進行的。

RipE1通過其半胱氨酸蛋白酶活性被本塞姆氏煙草NLR Ptr1a識別

本塞姆氏煙草CC-NLR Nb Ptr1 是 RipE1 半胱氨酸蛋白酶活性激活細胞死亡所必需的鞋吉。

受保護的 RIN4 不是 RipE1 的直接目標

Nb Ptr1 激活與 RIN4 的裂解相關鸦做。基于此坯辩，我們決定調(diào)查RipE1除了靶向Exo70B1之外是否還靶向RIN4馁龟。

我們測試了 RipE1 和 RIN4 之間的潛在相互作用，最初使用 Y2H 測定（圖 7A）在體外漆魔，并通過 BiFC 測定（圖 7B ）在植物中測試坷檩。RipE1 不與酵母中的 RIN4 結合（圖 7A）。然而改抡，當進行BiFC測定以測試植物中的RipE1-RIN4關聯(lián)時矢炼，在一些細胞中觀察到相當弱的YFP信號（圖7B）。RipE1-C172A/RIN4關聯(lián)的信號更強并且在大多數(shù)細胞中檢測到（圖7B）阿纤。為了進一步研究 RipE1 靶向 RIN4 的可能性句灌，我們嘗試通過 AlphaFold在計算機中可視化這兩種蛋白質(zhì)，就像對 RipE1/Exo70B1 復合物所做的那樣（圖 4A）欠拾。該軟件無法以可信的方式預測 RipE1 和 RIN4 之間的復合物胰锌，因此該分析的結果是不確定的（數(shù)據(jù)未顯示）。這里提供的數(shù)據(jù)總體表明RipE1和RIN4在物理上不相互作用（圖7A ）藐窄，但它們在植物中關聯(lián)并且非常接近（圖7B）资昧。

對這些結果的一種可能的解釋是，RipE1 可能通過 Exo70B1 降解間接損害 RIN4荆忍。2017 年格带，Sabol 等人報道，在 AvrRpt2 遞送后刹枉，RIN4 片段和 Exo70B1 都從細胞 PM 釋放到細胞質(zhì) 叽唱。盡管這些數(shù)據(jù)支持 RIN4 完整性對于 Exo70B1 定位到 PM 很重要的假設，但尚未研究在 Exo70B1 降解的情況下 RIN4 定位會發(fā)生什么微宝。此外棺亭，雖然煙草中 RPM1 異位過度表達會導致細胞死亡，除非 RIN4 也過度表達蟋软，但我們的結果表明侦铜，樟子松中Nb Ptr1 異位過度表達不會引起細胞死亡（圖 6A））专甩。考慮到這一點钉稍，Nb Ptr1 可以在沒有物理關聯(lián)的情況下監(jiān)測 RIN4涤躲，從而留下了其他 RIN4 相互作用蛋白（如 Exo70B1）參與該過程的可能性。然而贡未，需要進一步研究以破譯RipE1 對Nb Ptr1 的激活种樱，并確定 Exo70B1 降解是否參與該機制。圖 8展示了一個描述分子機制的擬議模型俊卤，該模型共同整合了本研究的結果嫩挤。

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