這篇文章于2023年7月發(fā)表于Cell Metabolism（IF=29乞娄，Acetate controls endothelial-to-mesenchymal transition）彭则，是一篇探討內(nèi)皮細(xì)胞乳酸代謝調(diào)控內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換的文章，其在代謝方面的驗(yàn)證和對(duì)分子機(jī)制的探索比較典型锡凝，正在做相關(guān)研究的同學(xué)可以借鑒一下。

研究意義：內(nèi)皮間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)換（EMT）是血管慢性炎癥垢啼、動(dòng)脈粥樣硬化、肺動(dòng)脈高壓张肾、移植動(dòng)脈病以及衰老等過程發(fā)生的重要病理生理改變芭析，TGF-β信號(hào)通路激活是EMT發(fā)生的主要原因。正常情況下吞瞪，內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)低水平的TGF-β受體（ALK5）馁启，而炎癥因子會(huì)促進(jìn)ALK5表達(dá)，激活內(nèi)皮細(xì)胞的TGF-β信號(hào)通路芍秆，引起EMT發(fā)生惯疙，而EMT又會(huì)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)白細(xì)胞黏附分子促進(jìn)白細(xì)胞的募集和局部炎癥加重EMT。這里作者致力于探究長(zhǎng)時(shí)間的TGF-β信號(hào)通路激活對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞代謝的影響妖啥，以進(jìn)一步闡明EMT發(fā)生的分子機(jī)制霉颠。大部分正常細(xì)胞葡萄糖產(chǎn)生的丙酮酸進(jìn)入線粒體并在丙酮酸脫氫酶（PDH）作用下被代謝為乙酰輔酶A（Ac-CoA），從而進(jìn)入TCA循環(huán)為細(xì)胞供能（圖0）荆虱。但在內(nèi)皮細(xì)胞中蒿偎，谷氨酰胺是為TCA循環(huán)提供碳的主要物質(zhì)朽们。由于PDH激酶（PDK）對(duì)PDH的磷酸化抑制了內(nèi)皮細(xì)胞線粒體對(duì)丙酮酸的分解，從而使內(nèi)皮細(xì)胞的丙酮酸被乳酸脫氫酶（LDH）氫化為乳酸（與癌細(xì)胞的葡萄糖代謝類似）诉位。PDK通過磷酸化PDH的E1限速亞基抑制PDH骑脱，最近有文章指出，PDH異常激活會(huì)產(chǎn)生乳酸而非Ac-CoA苍糠，而乳酸是可以自由通過線粒體進(jìn)入胞漿的[1]叁丧。與經(jīng)典的ATP乳酸裂解酶（ACLY）分解代謝乳酸產(chǎn)生Ac-CoA不同，這種情況下產(chǎn)生的乳酸在ACSS2合酶的作用下被轉(zhuǎn)化為Ac-CoA[2]岳瞭。那么拥娄，EMT過程中內(nèi)皮細(xì)胞是否會(huì)采用這種Ac-CoA生成形式呢？

圖0

綜上寝优，闡明EMT發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制對(duì)相關(guān)病理生理改變具有重要意義条舔，而闡明新報(bào)導(dǎo)的PDH-乳酸-ACSS2生Ac-CoA通路是否參與TGF-β介導(dǎo)的EMT及其機(jī)制，將為EMT提供新治療靶點(diǎn)乏矾。

研究策略： 這篇文章中孟抗，作者以內(nèi)皮細(xì)胞代謝為研究靶點(diǎn)，探究了其在EMT發(fā)生發(fā)展過程中的具體改變钻心。通過使用通用細(xì)胞模型（TGF-β刺激）模擬EMT凄硼，然后進(jìn)行RNA-seq，找到了發(fā)生顯著改變且與代謝相關(guān)的基因捷沸。對(duì)其相應(yīng)代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析摊沉，找到發(fā)生改變的代謝階段，并對(duì)其是否影響EMT進(jìn)行驗(yàn)證痒给，對(duì)其具體分子機(jī)制進(jìn)行闡明说墨，最后在拔高一下其臨床價(jià)值（診斷/治療價(jià)值）。

研究方法：

1苍柏、Metabolic effects of endothelial TGF-β signaling

TGF-β處理原代內(nèi)皮細(xì)胞并進(jìn)行RNA-seq分析發(fā)現(xiàn)尼斧，代謝相關(guān)基因中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因SLC2A1顯著增加，而糖酵解和大部分的TCA循環(huán)基因顯著降低（圖1A-D）试吁。葡萄糖吸收和糖酵解途徑顯著增強(qiáng)（圖1E-F）棺棵。同位素標(biāo)記結(jié)果顯示，雖然TGF-β抑制乳酸/異檸檬酸合成不顯著熄捍，但它能顯著抑制α-酮戊二酸生成和TCA循環(huán)（圖1G）烛恤。進(jìn)一步研究表明，TGF-β使耗氧率（OCR）顯著下降余耽，而胞外酸化率（ECAR）顯著增加缚柏，這表明圖1F是TCA循環(huán)被阻滯在異檸檬酸脫氫酶（IDH）階段，而非谷氨酰胺生成的α-酮戊二酸增加（圖1H-I）宾添。因此船惨，EMT抑制內(nèi)皮細(xì)胞TCA循環(huán)柜裸。

圖1

2、TGF-β regulates PDK4 expression and Ac-CoA synthesis

由1可知粱锐，TGF-β抑制PDK4表達(dá)疙挺，因此可能促進(jìn)PDH介導(dǎo)的Ac-CoA生物合成。敲低PDK4顯著抑制PDH磷酸化并上調(diào)Ac-CoA（圖2A-B）怜浅。PDK不同剪切異構(gòu)體中铐然，PDK4顯著促進(jìn)EMT，PDK3對(duì)EMT有一定的促進(jìn)作用恶座，而PDK1和PDK2對(duì)EMT沒有影響（圖2C-D）搀暑。作者在PDK4啟動(dòng)子區(qū)找到了四個(gè)TGF-β信號(hào)通路轉(zhuǎn)錄因子SMADs的結(jié)合位點(diǎn)（SBEs），ChIP表明TGF-β促進(jìn)SMAD和SBEs的結(jié)合跨琳，且過表達(dá)持續(xù)激活A(yù)LK5促進(jìn)SMAD2磷酸化自点，抑制PDK4表達(dá)（圖2E-H）。此外脉让，敲低SMAD4能逆轉(zhuǎn)TGF-β對(duì)PDK4表達(dá)的抑制作用（圖2I）桂敛。綜上，TGF-β/SMAD信號(hào)通路抑制PDK4轉(zhuǎn)錄溅潜，促進(jìn)Ac-CoA合成术唬。

圖2

3、Increase in endothelial Ac-CoA induces EMT in ACSS2-dependent manner

接下來作者探討了Ac-CoA對(duì)EMT的影響及其來源滚澜。敲低PDK4導(dǎo)致EMT（圖3A-B）粗仓。已知PDH在線粒體里催化Ac-CoA產(chǎn)生，一部分Ac-CoA進(jìn)入TCA循環(huán)设捐，另一部分則通過乳酸穿梭被轉(zhuǎn)運(yùn)到胞漿借浊，被ACLY催化而生成Ac-CoA。但敲除ACLY對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞Ac-CoA水平?jīng)]有影響萝招，表明其它Ac-CoA生成通路主導(dǎo)了內(nèi)皮細(xì)胞的Ac-CoA合成（圖3C）巴碗。敲低催化乳酸形成Ac-CoA的另一重要酶ACCS2顯著抑制TGF-β未處理/處理內(nèi)皮細(xì)胞Ac-CoA的生成，并促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)即寒，而過表達(dá)ACSS2會(huì)促進(jìn)EMT（圖3D-G）。此外召噩，在TGF-β處理時(shí)過表達(dá)PDK4可以抑制EMT（圖3H）母赵。因此，內(nèi)皮細(xì)胞胞漿Ac-CoA的主要來源是由ACSS2而非ACLY所介導(dǎo)具滴，且依賴PDK4的Ac-CoA上調(diào)促進(jìn)EMT發(fā)生凹嘲。

圖3

4、Endothelial Ac-CoA is largely derived from acetate, and acetate drives EMT

接下來构韵，作者探討了內(nèi)皮細(xì)胞Ac-CoA的來源周蹭。13C同位素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)表明趋艘，給內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液補(bǔ)充不同水平被標(biāo)記過的乳酸會(huì)改變其吸收速率，但其合成速率不變凶朗，即內(nèi)皮細(xì)胞的乳酸合成有其內(nèi)源性調(diào)控機(jī)制（圖4A-B）瓷胧。對(duì)13C標(biāo)記的葡萄糖、谷氨酰胺（內(nèi)皮細(xì)胞TCA碳的重要來源）以及棕櫚酸酯進(jìn)行追蹤的結(jié)果顯示棚愤，新合成和釋放到培養(yǎng)液的乳酸里有60%來源于葡萄糖搓萧，而非線粒體的TCA循環(huán)（圖4C）。此外宛畦，敲除ACLY對(duì)乳酸生成沒有影響瘸洛，表明ACLY對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞EMT沒有影響（圖4D）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)次和，乳酸是內(nèi)皮細(xì)胞Ac-CoA的主要來源反肋，且乳酸來源的Ac-CoA主要定位于細(xì)胞質(zhì)（圖4E-G）。內(nèi)皮細(xì)胞乳酸向Ac-CoA的轉(zhuǎn)換需要ACSS2的催化踏施，TGF-β處理的內(nèi)皮細(xì)胞其葡萄糖來源乳酸的合成水平增加（圖4H-I）石蔗。此外，向內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液添加乳酸會(huì)導(dǎo)致EMT的發(fā)生以及SMAD2/3的核定位（圖4J-L）读规。因此抓督，內(nèi)皮細(xì)胞通過依賴ACCS2的方式促進(jìn)乳酸和Ac-CoA的生成，從而引起EMT束亏。

圖4

5铃在、ACSS2-generated Ac-CoA regulates TGF-β signaling

接下來作者探討了胞漿Ac-CoA增加引起EMT的機(jī)制。由于TGF-β是介導(dǎo)EMT發(fā)生的主要信號(hào)通路碍遍，所以作者檢測(cè)了ACSS2對(duì)SMADs家族成員活性的影響定铜。TGF-β促進(jìn)SMAD2/3/4的核定位，敲低ACSS2抑制SMAD2/4的核定位（圖5A-B）怕敬。同時(shí)揣炕，敲低ACSS2抑制SMAD2/4的乙酰化东跪，而過表達(dá)ACSS2則增加SMAD2的乙趸福化以及SMA2/3的核定位（圖5C-E）。敲低ACSS2抑制TGF-β對(duì)ALK5表達(dá)的上調(diào)虽填，敲低SMAD2/4則能抑制ALK5表達(dá)（圖5F-H）丁恭。TGF-β處理以及敲低PDK4均會(huì)增加ALK5乙酰化斋日，而敲低ACSS2抑制其乙跎溃化（圖5I-K）。因此恶守，ACSS2介導(dǎo)的Ac-CoA水平上調(diào)會(huì)影響SMADs以及ALK5的乙醯谙祝化贡必，從而影響其定位、活性以及穩(wěn)定性庸毫。接下來作者進(jìn)一步探討了乙踝心猓化影響ALK5蛋白表達(dá)的機(jī)制。敲低PDK4增加了ALK5蛋白的穩(wěn)定性岔绸，而敲低ACSS2促進(jìn)ALK5蛋白降解（圖5L-M）理逊。使用靶向蛋白降解的主要途徑--蛋白酶體和溶酶體途徑的抑制劑處理細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，抑制蛋白酶體可以增加ACSS2敲低細(xì)胞ALK5蛋白表達(dá)的下調(diào)盒揉，表明發(fā)生乙踅唬化的ALK5通過蛋白酶體途徑降解（圖5N-O）。接下來刚盈，為了找到ALK5被乙跸勐澹化的賴氨酸位點(diǎn)，作者將ALK5蛋白的25個(gè)賴氨酸位點(diǎn)突變?yōu)榫彼崤菏l(fā)現(xiàn)K223欲侮、K343、K391和K449是可被乙趵吡化的位點(diǎn)（圖5P）威蕉。綜上，ACSS2介導(dǎo)的Ac-CoA水平上調(diào)通過影響SMADs的乙蹰先裕化韧涨、活性和定位，以及ALK5的乙跷攴保化和蛋白穩(wěn)定性虑粥，引起EMT。

圖5

6宪哩、ACSS2 regulates EndMT In vivo

接下來娩贷，作者在體內(nèi)水平驗(yàn)證了內(nèi)皮細(xì)胞乳酸代謝對(duì)EMT相關(guān)疾病動(dòng)脈粥樣硬化的影響。ACSS2的表達(dá)在動(dòng)脈粥樣硬化患者以及小鼠組織中顯著上調(diào)（圖6A-B）锁孟。作者構(gòu)建了Acss2條件敲除小鼠彬祖，檢測(cè)結(jié)果顯示，敲除ACSS2顯著減小動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積（圖6C）品抽。為驗(yàn)證將ACSS2作為臨床治療動(dòng)脈粥樣硬化靶點(diǎn)的可行性涧至，作者使用納米顆粒將靶向ACSS2的siRNA注射到動(dòng)脈粥樣硬化小鼠體內(nèi)，結(jié)果顯示桑包，注射了siRNA納米顆粒的小鼠其動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積顯著減小（圖6D）纺非。因此哑了，ACSS2可以作為臨床治療動(dòng)脈粥樣硬化或其它EMT相關(guān)疾病的靶點(diǎn)（圖6E）赘方。

圖6

Take-home message：

這篇文章以經(jīng)典細(xì)胞模型為切入口，在明確了自己想要探究的細(xì)胞過程后弱左，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)測(cè)序窄陡，找到和自己感興趣細(xì)胞過程相關(guān)基因，并以此為突破口循序驗(yàn)證拆火，發(fā)現(xiàn)了內(nèi)皮細(xì)胞Ac-CoA生成新途徑可以促進(jìn)EMT是本文的亮點(diǎn)跳夭。給我們的啟示：在做研究時(shí)最好有自己成熟的細(xì)胞或者動(dòng)物模型，這樣當(dāng)我們根據(jù)文獻(xiàn)想到ideas的時(shí)候们镜，才能有條不紊的根據(jù)成熟的模型設(shè)計(jì)預(yù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證币叹。這同時(shí)也證明了科研需要專注某一領(lǐng)域“打陣地戰(zhàn)”，而非和散兵游勇一樣“打游擊戰(zhàn)”模狭，只有在自己熟悉的“陣地”不斷加固工事颈抚，我們才能立于不敗之地。與此同時(shí)嚼鹉，我們也應(yīng)該看到文章中的一些不太完善的地方贩汉，例如作者通過驗(yàn)證ACSS2調(diào)控EMT間接說明Ac-CoA對(duì)EMT的作用，其實(shí)并不是特別直接的證據(jù)（最好是和證明乳酸調(diào)控EMT一樣锚赤，直接給內(nèi)皮細(xì)胞補(bǔ)充Ac-CoA）匹舞；同時(shí)，作者原文Figure S3E用免疫熒光說明ACSS2的rescue作用线脚，并不合理（免疫熒光不適合用于蛋白定量）赐稽；最后，文中部分WB的結(jié)果存在極高的相似性（尤其是補(bǔ)充數(shù)據(jù)部分酒贬，例如Figure S2A和C的calponin以及GAPDH）又憨。所以，我們可以借鑒文章的研究思路锭吨，但是對(duì)于文章結(jié)論要保持謹(jǐn)慎態(tài)度蠢莺。

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