細胞培養(yǎng)的步驟：
1、細胞復(fù)蘇
將凍存細胞從液氮中取出后喻杈，在37℃水浴鍋內(nèi)不斷搖動促進其融化。將融化的細胞移入離心管中凤薛，加入37℃預(yù)熱的DMEM完全培養(yǎng)基中（其中胎牛血清約為10%）枚冗，輕輕吹勻缓溅，離心，500g離心2min赁温，棄上清液坛怪。
加入DMEM完全培養(yǎng)基清洗，棄上清液股囊。加入DMEM完全培養(yǎng)基袜匿，輕輕吹打混勻，制成細胞懸液稚疹，接種于培養(yǎng)皿/瓶中居灯，在含5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
2内狗、細胞傳代
當(dāng)細胞密度達到80%~90%（過早產(chǎn)量不足怪嫌，過晚細胞狀態(tài)不佳，1:2至1:10以上的比率傳代培養(yǎng)柳沙，一般1:3至1:5細胞一代喇勋，即從細胞接種到分離再培養(yǎng)的一段時間，非細胞有絲分裂次數(shù)）時偎行，去掉完全培養(yǎng)基川背，用1X PBS清洗2次。
加入胰蛋白酶（注意：消化液的量以蓋住細胞蛤袒，消化溫度是37℃熄云。顯微鏡下觀察細胞：倒置顯微鏡下觀察消化細胞，若胞質(zhì)回縮妙真，細胞之間不再連接成片缴允，表明此時細胞消化適度）進行消化，放入細胞培養(yǎng)箱中約2-3min。
加入適量DMEM完全培養(yǎng)基終止胰蛋白酶消化练般，轉(zhuǎn)移至離心管后500g離心2min矗漾，棄上清液，再加入DMEM完全培養(yǎng)基清洗薄料，棄上清液敞贡。
加入DMEM完全培養(yǎng)基，輕輕吹打混勻摄职，吸取10微升進行計數(shù)誊役，然后按照所需細胞量在含5% CO2的細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。
3谷市、細胞凍存
當(dāng)細胞密度達到80%~90%時蛔垢，去掉完全培養(yǎng)基，用1X PBS清洗2次迫悠。加入胰蛋白酶進行消化鹏漆，放入細胞培養(yǎng)箱中約2-3min。加入DMEM完全培養(yǎng)基終止胰蛋白酶消化创泄，轉(zhuǎn)移至離心管后500g離心2min艺玲，棄上清液，再加入DMEM完全培養(yǎng)基清洗验烧，棄上清液板驳。加入lml凍存液（90%胎牛血清，10%DMSO碍拆。 一般來講血清含量可以在10%-90%之間調(diào)整若治，凍存液中加入血清一方面可以為細胞提供營養(yǎng)，另一方面可以在細胞凍存過程中提供非滲透性保護物質(zhì)感混，如蔗糖端幼，白蛋白等從而更好地保護細胞），放入凍存管內(nèi)（管內(nèi)有異丙醇弧满，以保證溫度降低的速度）婆跑，立即放入4℃冰箱中凍存30min，然后放入-20℃冰箱中凍存30min庭呜，再置于-80℃冰箱內(nèi)過夜滑进。
第二天放入液氮中，可以保存至少兩年募谎，如不放人液氮扶关，可以保存三個月。
細胞凍存和復(fù)蘇的原則是：慢凍速融数冬，這樣更加有利于保持細胞的活力节槐。凍存細胞不加任何保護劑，會導(dǎo)致細胞內(nèi)冰晶的產(chǎn)生，從而使細胞產(chǎn)生內(nèi)源性的機械損傷铜异，引起細胞內(nèi)環(huán)境滲透壓哥倔，PH，電解質(zhì)等的改變揍庄，進而促使細胞死亡咆蒿。
注意事項：
一、復(fù)蘇
1币绩、復(fù)蘇細胞時蜡秽，將凍存細胞從液氮中取出后府阀，在37℃水浴鍋內(nèi)不斷搖動促進其融化缆镣。
2、 已解凍的細胞避免長時間常溫存放试浙，需盡快離心去除DMSO董瞻；
3、剛復(fù)蘇的細胞貼壁尚不牢固田巴，24h內(nèi)不要頻繁觀察和換液钠糊；
二、消化
1壹哺、加入胰蛋白酶（注意：消化液的量以蓋住細胞抄伍，消化溫度是37℃。顯微鏡下觀察細胞：倒置顯微鏡下觀察消化細胞管宵，若胞質(zhì)回縮截珍，細胞之間不再連接成片，表明此時細胞消化適度）箩朴，不同細胞消化時間有所不同岗喉。
2、吹打細胞需要輕柔炸庞，以免對細胞產(chǎn)生機械性損傷钱床。
3、PBS潤洗細胞時埠居，從與貼壁細胞層相對的容器一側(cè)輕輕加入PBS查牌，避免沖刷到細胞層。
三滥壕、細胞凍存
1纸颜、選取對數(shù)生長期的細胞進行凍存，此時細胞狀態(tài)比較好捏浊；
2懂衩、細胞凍存和復(fù)蘇的原則是：慢凍速融，這樣更加有利于保持細胞的活力。
四浊洞、無菌操作
1牵敷、使用物品用75%酒精消毒后放入生物安全柜。
2法希、手盡量不要經(jīng)過敞開的培養(yǎng)基上方枷餐。
五、培養(yǎng)條件
1苫亦、將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱毛肋，并將瓶蓋旋松，以便進行充分的氣體交換（如使用透氣性瓶蓋屋剑，則無需旋松瓶蓋）润匙。
