基因編輯需要通過網(wǎng)站設(shè)計合適的sgRNA会涎，確認(rèn)切割效率之后既可以進(jìn)行細(xì)胞實驗或者活體注射锡足，下面講述幾點關(guān)于sgRNA活性檢測中遇到的問題及思考别洪。
雖然體外的剪切活性并不能模擬體內(nèi)真實的情況飘弧，也有報道的sgRNA并未經(jīng)過篩選直接進(jìn)行注射后突變檢測。但是邪狞，體外的檢測在一定程度上還是可以縮小候選sgRNA祷蝌，提高突變的效率。并且市面上的各種包裝的產(chǎn)品也有這一流程帆卓，所以綜合來講還是可以作為評價的標(biāo)準(zhǔn)的杆逗。
整個制備sgRNA過程包含以下幾個步驟：
1. sgRNA模板制備：
| 成分 | 含量 |
|---|---|
| sgRNA_foward primer(10uM) | 6.25 ul |
| scaffold primer(10uM) | 6.25 ul |
| 2x PCR master mix | 12.5 ul |
反應(yīng)條件：
Standard PCR conditions were as follows: denaturation at 94 °C for 3 min, followed by 30 cycles of denaturation at 94 °C for 30 s,annealing at 55 °C for 30 s and extension at 72 °C for 30 s, with a final extension at 72 °C for 10 min.
Zheng, W., et al. (2019). "Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated 9-mediated mutagenesis of the multiple edematous wings gene induces muscle weakness and flightlessness in Bactrocera dorsalis (Diptera: Tephritidae)." Insect Mol Biol 28(2): 222-234.
該反應(yīng)不存在指數(shù)擴(kuò)增的過程。
產(chǎn)物純化回收用于轉(zhuǎn)錄模板鳞疲；
2. sgRNA轉(zhuǎn)錄：
| 成分 | 含量 |
|---|---|
| DNA template | 1000 ng |
| 2 * T7 Reaction buffer | 10 ul |
| T7 Enzyme | 2 ul |
| H2O | up to 20 ul |
37℃或42℃孵育2h
添加DNase 37℃孵育30min去除模板DNA
3. sgRNA產(chǎn)物純化
產(chǎn)物純化參考試劑盒說明書，或者參考MEGAclear? 轉(zhuǎn)錄純化試劑盒替代方案
4. 體外活性檢測：
通過cas9酶切檢測：
| 成分 | 含量 |
|---|---|
| DNA | 400-600ng |
| 10*Buffer | 1ul |
| sgRNA | 200ng - 500ng |
| cas 9 protein(1000ng/ul) | 0.5ul |
| H2O | up to 10ul |
37℃ PCR儀孵育1h
添加loading buffer后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳（切勿含SDS)蠕蚜。
影響sgRNA活性因素：
理論上尚洽，產(chǎn)生的sgRNA為單鏈RNA序列，不同的方法并不會對切割活性造成顯著的影響靶累，然而根據(jù)筆者的經(jīng)驗腺毫，情況要比想象的更為復(fù)雜癣疟。以下羅列出影響sgRNA活性的因素，但是并沒有系統(tǒng)性的研究支撐潮酒，所以僅供參考睛挚。
sgRNA核酸序列決定了sgRNA是否具有切割活性；
不同核酸序列特異性識別效率不同急黎。sgRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物純化質(zhì)量決定切割效率扎狱；
用Thermo fisher純化試劑盒和Aidlab試劑盒回收產(chǎn)物，切割效率不同勃教。DNA模板片段長度淤击，影響sgRNA切割效率；
通過對800bp和500bp長度用相同sgRNA切割故源，結(jié)果顯示不同的切割效率不等污抬。T7轉(zhuǎn)錄效率決定切割效率；
T7轉(zhuǎn)錄時加入1500ngDNA模板绳军，轉(zhuǎn)錄后的sgRNA結(jié)果顯示活性較好印机。不同DNA模板質(zhì)量對后續(xù)sgRNA活性有影響。
用過柱純化獲得的sgRNA和磁珠法回收的sgRNA對后續(xù)切割效率有影響门驾。
幾種影響活性的推斷：
sgRNA轉(zhuǎn)錄后射赛，不同純化方式影響了其二級結(jié)構(gòu)，使得識別DNA片段有所影響猎唁，才導(dǎo)致切割產(chǎn)生差異咒劲。同理，DNA長度不同诫隅，存在復(fù)雜的二級結(jié)構(gòu)腐魂，或者隱匿了識別的位點，造成切割上的差異逐纬。
所以蛔屹，在進(jìn)行sgRNA初步功能篩選時候，如果切割活性不佳豁生，并不能武斷地下結(jié)論定性兔毒，而是嘗試優(yōu)化實驗過程中的諸多影響條件，再次驗證切割活性甸箱∮或者更換不同試劑，不同引物合成公司芍殖、間隔一定時日再次從新實驗等方法來確認(rèn)切割效率豪嗽。
