肝細胞癌(HCC)是世界范圍內(nèi)癌癥致死的第三大常見腫瘤整陌，術(shù)后復發(fā)和轉(zhuǎn)移是臨床高致死率的痛點。臨床研究識別驅(qū)動基因和闡明關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)昔园，可以促進發(fā)現(xiàn)HCC治療的前瞻性策略蔓榄。
2024年7月，南通大學鄭文杰默刚、趙輝及劉東團隊共同在Cell Death Differ（IF=13.7）上甥郑，發(fā)表“Ubiquitin-specific protease 1 facilitates hepatocellular carcinoma progression by modulating mitochondrial fission and metabolic reprogramming via cyclin-dependent kinase 5 stabilization”的研究成果，揭示了泛素特異性蛋白酶1 (USP1)在肝細胞癌(HCC)進展過程中荤西，是一個重要的促癌基因澜搅。
圖形摘要：
Highlights如下：
1）USP1在HCC組織中顯著升高。
2）USP1通過調(diào)節(jié)線粒體分裂增強HCC細胞的侵襲性和代謝重編程邪锌。
3）機制上勉躺，USP通過去泛素化和穩(wěn)定CDK5（可被 E3 連接酶NEDD4L 降解）來增強 Drp1 Ser616 的磷酸化，誘導線粒體裂變觅丰，從而惡化 HCC 進展饵溅。
4）小分子藥物ML323和Prasugrel抑制USP1功能，抑制HCC進展妇萄。
臨床相關(guān)性：
USP1在HCC組織中高表達蜕企，與HCC患者的不良預(yù)后相關(guān)咬荷。
功能研究：
USP1過表達促進體外肝癌細胞增殖（增殖和成球?qū)嶒灒腕w內(nèi)惡性增殖（斑馬魚模型轻掩、裸鼠皮下和原位成瘤模型）幸乒。相反，抑制或敲除USP1損害 HCC 細胞的表型唇牧。
機制研究：
（1）USP1可能通過誘導糖酵解促進HCC進展
為了研究其致瘤作用的潛在機制罕扎，蛋白質(zhì)組學分析發(fā)現(xiàn)糖酵解等代謝途徑中富集（圖1a），TCGA數(shù)據(jù)集GSEA表明丐重，USP1表達與糖酵解呈正相關(guān)（圖1b）腔召。細胞學實驗也顯示USP1促進腫瘤生長（圖1c-e）。表明USP1可能通過誘導糖酵解促進HCC進展扮惦。
（2）USP1可能通過調(diào)節(jié)線粒體分裂加速HCC的進展
GO分析表明USP1與線粒體基質(zhì)和線粒體相關(guān)過程的相關(guān)性（圖1f）宴咧，公共數(shù)據(jù)集分析也表明USP1與線粒體的活性和狀態(tài)有關(guān)（圖1g）。推測USP1可能會影響HCC細胞線粒體分裂融合径缅。Drp1是與線粒體分裂相關(guān)的關(guān)鍵蛋白。WB檢測顯示烙肺，ML323（USP1抑制劑）或敲減USP1降低Drp1-S616磷酸化水平（圖1h）纳猪。另外，ML323抑制或敲減USP1使線粒體呈細長狀桃笙，而USP1過表達促使形成顆粒狀線粒體（圖1i-j）氏堤，這些結(jié)果表明USP1可以促進線粒體分裂，從而加速HCC的進展（圖1k）搏明。
（3）USP1與CDK5相互作用并去泛素化
由于USP1具有去泛素酶的功能鼠锈，并在其靶蛋白上移動泛素化，假設(shè)USP1可能通過與其靶蛋白相互作用并去除泛素化來誘導上述表型星著。
第一步购笆，初步確定與USP1相互作用的蛋白
通過IP-MS分析與USP1互作的蛋白分子（圖2a），同時參考UbiBrowser預(yù)測的USP1底物中虚循，篩選出USP1的6個候選蛋白同欠。其中，CDK5與線粒體功能障礙和肝癌發(fā)生相關(guān)横缔。表達相關(guān)性檢測顯示铺遂，敲低或抑制USP1降低CDK5蛋白水平（圖2b），而不引起CDK5 mRNA的變化（圖2c）茎刚，表明USP1在翻譯后水平調(diào)控了CDK5蛋白的豐度襟锐。
第二步，USP1可以與CDK5相互作用
RosettaDock預(yù)測分析顯示USP1可與CDK5互作（圖2d）膛锭。內(nèi)粮坞、外源Co-IP實驗發(fā)現(xiàn)USP1與CDK5互作（圖2e-f）蚊荣。GST pulldown實驗顯示USP1與CDK5相互作用（圖2g）。
第三步捞蚂，確定USP1上哪個結(jié)構(gòu)域?qū)εcCDK5相互作用
構(gòu)建三個USP1截斷突變體(TMs)妇押，USP1-TM1(1-400 aa)，USP1-TM2 (401-785 aa)和USP1-TM3 (201-785 aa)姓迅，Co-IP分析顯示敲霍，WT、TM2和TM3可與CDK5互作丁存，而TM1不能與CDK5互作（圖2h-i）肩杈，表明USP1的c端(401-785 aa)主要負責與CDK5的相互作用。
第四步解寝，USP1與CDK5互作扩然，使CDK5去泛素化
WB檢測顯示，抑制或敲減USP1促進CHX誘導的CDK5蛋白降解聋伦，而野生型USP1則延長了CDK5蛋白的半衰期夫偶，失活突變體USP1-C90S則無此功能（圖2j）。另外觉增，蛋白酶體抑制劑MG132顯著拯救了USP1敲低或抑制劑抑制的CDK5（圖2k-l）兵拢。進一步Co-IP實驗發(fā)現(xiàn)，抑制或敲減USP1顯著誘導CDK5的泛素化（圖2m-n）逾礁。與此同時说铃，與WT相比，突變失活體USP1-C90S失去了去泛素化CDK5的能力（圖2o）嘹履。與泛素K63相比腻扇，抑制或敲低USP1可促進K48連接的CDK5泛素化（圖3p-q）幼苛。
這些結(jié)果表明，USP1具有特異性地去除CDK5的泛素化修飾暑椰，具有穩(wěn)定CDK5蛋白的功能。
（4）USP1通過穩(wěn)定CDK5蛋白召夹，促進DRP1-S616磷酸化介導的線粒體分裂
為了探究CDK5是否介導USP1誘導的線粒體分裂纱意，挽救實驗顯示CDK5過表達挽救USP1缺失對DRP1-S616處磷酸化水平的影響，CDK5激酶失活突變體D144N功能喪失（圖3a）鲸阔。另外偷霉，使用CDK5抑制劑Roscovitine消除了USP1誘導的Drp1在S616位點的磷酸化（圖3a）。進一步，CDK5過表達挽救了USP1缺失對糖酵解表型和糖酵解酶表達的影響以及腫瘤生長硫狞，而激酶失活突變體D144N則無此功能（圖3b-c）。表明USP1通過穩(wěn)定CDK5蛋白，進一步上調(diào)DRP1-S616位點的磷酸化祖凫，促進HCC細胞線粒體分裂。
（5）USP1通過中斷NEDD4L介導的泛素化來穩(wěn)定CDK5
CDK5是USP1促癌的關(guān)鍵節(jié)點，USP1是CDK5的去泛素化酶，USP1如何打破CDK5的泛素修飾促進CDK5蛋白的穩(wěn)定性龙屉，需要探究CDK5的泛素化修飾機制转捕。
第一步作岖，篩選與USP1合作調(diào)節(jié)CDK5穩(wěn)定性的E3連接酶
結(jié)合UbiBrowser和HitPredict分析表明NEDD4L和STUB1是CDK5潛在的E3連接酶（圖3d）。Co-IP分析發(fā)現(xiàn)五芝，與STUB1相比痘儡，NEDD4L可以與CDK5顯著相互作用，在蛋白水平上降低CDK5的表達枢步，但對其mRNA水平無顯著影響（圖3e-g）沉删。
第二步，NEDD4L參與CDK5穩(wěn)定性調(diào)控
NEDD4L過表達加速了CHX誘導的CDK5降解价捧，而USP1進一步阻礙了NEDD4L介導的CDK5降解丑念；相反，NEDD4L的過表達或敲低顯著降低或增強CDK5蛋白的穩(wěn)定性（圖3h）结蟋。Co-IP實驗顯示脯倚，野生型NEDD4L顯著降低了CDK5的表達，誘導了CDK5上K48連接的泛素化嵌屎，而其激酶失活突變體C942S對CDK5蛋白水平?jīng)]有顯著影響（圖3i-j）推正。
第三步，確定USP1與NEDD4L競爭結(jié)合CDK5宝惰，其中USP1優(yōu)勢結(jié)合植榕。
Co-IP分析發(fā)現(xiàn)，USP1過表達或敲低顯著抑制或增強了NEDD4L/CDK5之間的相互作用尼夺；ML323抑制USP1尊残，對NEDD4L/CDK5的相互作用沒有顯著影響（圖3k-m）。此外淤堵，在NEDD4L缺失的細胞中寝衫，ML323誘導的泛素化變化較少（圖3n）。USP1的過表達或敲低顯著降低或增強NEDD4L介導的CDK5泛素化拐邪，而在ML323處理組中未觀察到顯著變化（圖3o-q）慰毅。WB檢測顯示，NEDD4L負向調(diào)節(jié)Drp1的表達水平(S616)扎阶，而通過USP1或CDK5過表達恢復Drp1的表達水平（圖3r）汹胃。此外，功能回復實驗顯示东臀，過表達USP1可以挽救侵襲性表型（圖3s-t）着饥。表明USP1/NEDD4L可以調(diào)節(jié)HCC細胞中CDK5的穩(wěn)定。
結(jié)論：該研究發(fā)現(xiàn)USP1在HCC表達水平升高惰赋，與不良預(yù)后正相關(guān)贱勃。功能上，USP1在體內(nèi)外促進HCC進展；抑制或敲減USP1贵扰，則表型受到抑制仇穗。機制上，高表達的USP1通過競爭性優(yōu)勢結(jié)合CDK5戚绕，使其去泛素化和穩(wěn)定來增強Drp1在Ser616位點的磷酸化纹坐，從而誘導線粒體分裂，誘導惡性表型和代謝重編程舞丛，從而惡化HCC進展耘子。
