構(gòu)建 lncRNA 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒或者慢病毒槽唾、腺病毒包裝載體梗肝。原則上是將全長(zhǎng)lncRNA 定向克隆到表達(dá)載體上實(shí)現(xiàn) lncRNA 的過(guò)表達(dá)。然而有些 lncRNA很大或全長(zhǎng)尚未分離克懊，這時(shí)將視 lncRNA 在基因組上的定位采取不同的研究策略。在構(gòu)建 lncRNA 表達(dá)質(zhì)粒時(shí)七蜘，需關(guān)注 lncRNA 是否在蛋白編碼基因的啟動(dòng)子區(qū)域或 3′-UTR 區(qū)域谭溉，勿遺漏重要區(qū)段。
引物設(shè)計(jì)是載體構(gòu)建的第一步橡卤，也是最關(guān)鍵的一步扮念，這直接決定了后續(xù)實(shí)驗(yàn)?zāi)芊襁M(jìn)行下去。引物設(shè)計(jì)完成后的具體操作步驟見(jiàn)后文碧库。文章正在審核中... - 簡(jiǎn)書
整體操作：
1.? ? 選擇合適的載體柜与，依據(jù)實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的條件進(jìn)行選擇：plvx-puro，Amp嵌灰，puro弄匕，其他慢病毒載體的原理相似，例如pLenti-puro等
2.? ? 找到基因的CDS區(qū)沽瞭，復(fù)制迁匠；對(duì)于LncRNA，則直接選擇全部序列即可
3.? ? 用primer5找到目的基因上沒(méi)有and載體有的酶切位點(diǎn)
4.? ? 確定酶切效率驹溃，在酶邊是否需要加保護(hù)堿基以提高效率
5.? ?Kozak序列（針對(duì)表達(dá)蛋白的載體城丧，而對(duì)于L過(guò)表達(dá)載體，則不需要RNA）
6.? ?取目的基因CDS區(qū)兩端15~21個(gè)堿基（或反向互補(bǔ)鏈）豌鹤，加上酶切位點(diǎn)和kozak亡哄。當(dāng)然，這個(gè)范圍可以放寬布疙。
操作步驟：
一 擴(kuò)充全長(zhǎng)
①? 在NCBI找到基因序列蚊惯，復(fù)制ORIGIN區(qū)愿卸。
②? 打開primer5軟件，將序列復(fù)制到到中間的框內(nèi)
③點(diǎn)擊Enzyme
點(diǎn)擊OK截型，得到該基因所包含的酶切位點(diǎn)數(shù)據(jù)擦酌。
④ 分析載體質(zhì)粒的酶切位點(diǎn)，這里用pLvx-puro作為目的基因的載體
因此菠劝，BamH1、EcoR1不可使用睁搭，其他可用的有：
Xho1赶诊、BsyB1、Apal园骆、Smal舔痪、Xbal
酶切的選擇還需要考慮現(xiàn)實(shí)情況，我們組內(nèi)有現(xiàn)貨的酶：Xho1, Xbal锌唾。
在目的基因的上下游截取15-21bp序列锄码，點(diǎn)擊Primers里的Add primers,根據(jù)經(jīng)驗(yàn)選取Tm值在50-60℃左右，在上述范圍內(nèi)選取合適的bp晌涕。
選擇“引物”滋捶，“添加引物”，先設(shè)計(jì)上游引物：輸入上游18bp堿基后余黎，再插入XhoI位點(diǎn)：
得到CTCGAGGCTGCTGCCACGTAAGAA
再設(shè)計(jì)下游引物：因下游3’端有連續(xù)22個(gè)A重窟，若算入，則Tm值和GC含量均不達(dá)標(biāo)惧财。因此巡扇，在引物設(shè)計(jì)時(shí)，去掉尾部部分A序列垮衷，輸入尾部序列厅翔，點(diǎn)擊“反向互補(bǔ)序列”，插入XbaI位點(diǎn)搀突，得到TTTTTGTTTGACTTTGTGTTTATTTTTAAT刀闷，Tm=50℃。
查找保護(hù)堿基仰迁，隨便百度都能搜到涩赢。
①因此XhoI酶切位點(diǎn)處的上游引物為：對(duì)于LncRNA來(lái)說(shuō)，不需要起始密碼子轩勘，不需要Kozark序列筒扒，但是需要防止誤翻譯。
保護(hù)堿基+酶切位點(diǎn)+一小段目的基因
CCGCTCGAGCGGGCTGCTGCCACGTAAGAA绊寻，67%GC,Tm56℃
②XbaI酶切位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的下游引物為：
保護(hù)堿基+酶切位點(diǎn)+一小段目的基因
若是加上A尾花墩，GCTCTAGAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTTTGACTTTGTGTT
若是不加A尾GCTCTAGAGCTTTTTGTTTGACTTTGTGTTTATTTTTAAT悬秉。
二 分片段擴(kuò)充后再連接
對(duì)于一些過(guò)長(zhǎng)的基因來(lái)說(shuō)，直接通過(guò)兩端的上下游引物冰蘑，是無(wú)法擴(kuò)出合適的cDNA的和泌，因此可以選擇將基因分段擴(kuò)增，再進(jìn)行連接祠肥。
例如up主所研究的基因是6810bp武氓，之前已經(jīng)合成了1-3010長(zhǎng)度的質(zhì)粒，因此現(xiàn)在只要合成后半部分仇箱，再進(jìn)行DNA連接即可县恕。
因?yàn)楸窘M已有一個(gè)1-3010，兩端酶切位點(diǎn)分別為BamHI和XhoI的pcDNA3.1載體剂桥，因此可以設(shè)計(jì)從3011開始忠烛，以XhoI作為末端的上游引物：CCGCTCGAGCGGAAAATTAGGTTTATTCAAGC。
因此权逗，可將pcDNA3.1-AFAP1-AS1以BamHI/XhoI做酶切得到1-3010片段美尸，
以引物擴(kuò)增后的cDNA以XhoI和XbaI做酶切即可得位點(diǎn)為XhoI/XbaI的3011-6810片段，再連接在一起可得全長(zhǎng)full-length序列斟薇，位點(diǎn)為BamHI/XbaI师坎。
再將plvx載體以BamHI和XbaI做酶切，與上述cDNA相連堪滨，即可得出plvx-AFAP1-AS1-full-length屹耐。
詳細(xì)的載體構(gòu)建的操作步驟、注意事項(xiàng)等椿猎，可見(jiàn)于載體合成步驟 - 簡(jiǎn)書
對(duì)于其他過(guò)長(zhǎng)的載體惶岭，建議各位可以采取類似的方法，分段酶切犯眠、再連接按灶。這時(shí)要注意引物的選取。
接后續(xù)：阿婆主的6800bp載體做成了筐咧，直接從細(xì)胞的RNA里擴(kuò)全長(zhǎng)沒(méi)成功鸯旁，估計(jì)是因?yàn)閷?shí)在太長(zhǎng)了！
后面試了量蕊，分成了3000+3800兩個(gè)片段來(lái)做铺罢，可成功！２信凇韭赘！
