常規(guī)載體構(gòu)建原理及流程較為簡單暇韧，具體操作也比較容易。這里進(jìn)行簡單總結(jié)廊宪，并對(duì)幾點(diǎn)需要注意的點(diǎn)進(jìn)行說明矾瘾。
原理依賴于限制性核酸內(nèi)切酶，DNA連接酶和其他修飾酶的作用箭启，分別對(duì)目的基因和載體DNA進(jìn)行適當(dāng)切割和修飾后壕翩，將二者連接在一起，再導(dǎo)入宿主細(xì)胞傅寡，實(shí)現(xiàn)目的基因在宿主細(xì)胞內(nèi)的正確表達(dá)放妈。
前面提到的幾個(gè)驗(yàn)證蛋白互作的實(shí)驗(yàn)，第一步就是要構(gòu)建對(duì)應(yīng)的載體荐操。
【進(jìn)入正題】
同樣芜抒，直接看圖了解質(zhì)粒構(gòu)建的基本流程。
了解了大致流程后托启，逐一了解一下載體構(gòu)建過程中需要用到的一些材料宅倒。
載體
下面就以pCMV-Blank為例展開。
從質(zhì)粒圖譜可以看到這幾個(gè)主要的組成部分屯耸。
p CMV啟動(dòng)子（以及其他的啟動(dòng)子SV40拐迁、bla蹭劈、T7……）：高效率啟動(dòng)基因表達(dá)。
MCS（Multiple cloning site）：多克隆位點(diǎn)线召，外源基因的插入铺韧。
TK pA（以及SV40 polyA信號(hào)）：轉(zhuǎn)錄終止，給mRNA添加polyA防止降解缓淹。
neomycin（G418）/kanamycin/ampicillin/puromycin resistance：用于細(xì)菌轉(zhuǎn)化/細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的篩選哈打。
這也就是為什么在做轉(zhuǎn)化過程中，有時(shí)候要加kan割卖，有時(shí)候要加Amp前酿。
實(shí)際上我們?cè)诓僮鬟^程中主要還是關(guān)注MSC和抗性標(biāo)簽這兩部分患雏。
限制性內(nèi)切酶
限制性核酸內(nèi)切酶是可以識(shí)別并附著特定的核苷酸序列鹏溯，并對(duì)每條鏈中特定部位的兩個(gè)脫氧核糖核苷酸之間的磷酸二酯鍵進(jìn)行切割的一類酶，簡稱限制酶淹仑。
根據(jù)限制酶的結(jié)構(gòu)丙挽，輔因子的需求切位與作用方式，可將限制酶分為三種類型匀借，分別是第一型（Type I）颜阐、第二型（Type II）及第三型（Type III）。
Ⅰ型限制性內(nèi)切酶既能催化宿主DNA的甲基化吓肋，又催化非甲基化的DNA的水解凳怨；
Ⅱ型限制性內(nèi)切酶只催化非甲基化的DNA的水解。
Ⅲ型限制性內(nèi)切酶同時(shí)具有修飾及認(rèn)知切割的作用是鬼。
常規(guī)的載體構(gòu)建主要用到II型限制性內(nèi)切酶肤舞。
限制酶的命名是根據(jù)細(xì)菌種類而定囤耳，以EcoRI為例：
E
Escherichia
（屬）
co
coli
（種）
R
RY13
（品系）
I
首先發(fā)現(xiàn)
在此類細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的順序
再來看EcoRI在質(zhì)粒中的位置及其他的酶切位點(diǎn)篙顺。
【下面開始載體構(gòu)建】
目的基因的擴(kuò)增
選擇合適的酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)的引物充择，以cDNA為模板德玫，擴(kuò)增目的基因。
首先椎麦，找出目的基因的CDS序列化焕。
這里可以看到深色區(qū)域的CDS序列是以ATG開始，TGA結(jié)束的铃剔。
找到目的基因的序列之后撒桨，就需要選擇合適的酶切位點(diǎn)查刻，因?yàn)橹挥写_定了合適的酶切位點(diǎn)才可以進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。
那酶切位點(diǎn)的選擇需要注意什么呢凤类？
1穗泵、通常我們會(huì)使用雙酶切，因?yàn)閱蚊盖泻筝d體容易自連谜疤；且不能保證目的基因插入的方向性佃延。
2、雙酶切需要注意同尾酶的自連夷磕。比如下圖中BamHI和BGl II雖然識(shí)別的序列不同履肃，但是酶切后的末端是相同的，這種情況在選擇酶切位點(diǎn)時(shí)應(yīng)避免坐桩。
那這里怎么檢查我們的目的基因序列中有沒有選定的酶切位點(diǎn)的序列呢尺棋？總不能一個(gè)一個(gè)去查找吧？這里給大家推薦一個(gè)在線工具绵跷。
限制性酶切位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)工具h(yuǎn)ttp://www.detaibio.com/sms2/rest_summary.html
統(tǒng)計(jì)結(jié)束之后膘螟，會(huì)彈出一個(gè)非常詳細(xì)的表格。
只要是這里顯示none的碾局，即為目的序列中不包含對(duì)應(yīng)酶切位點(diǎn)的序列荆残，也就是說可供使用。
當(dāng)然净当，一般在選擇酶切位點(diǎn)的時(shí)候内斯，兩個(gè)酶切位點(diǎn)不易挨得太近（不能緊挨）。
那我們這里就使用EcoRI和BamHI這兩個(gè)位點(diǎn)像啼。
酶切位點(diǎn)選擇好之后就進(jìn)行引物設(shè)計(jì)俘闯。
通常來說，引物設(shè)計(jì)有以下原則埋合。
長度盡量保持在15-30bp备徐；
GC含量保持在40%-60%之間；
上下游引物的Tm值要盡量保持一樣甚颂；
盡量避免連續(xù)的GGGGG或CCCCC蜜猾。
先來選取上游引物。
F（5'-3'）：atggagga gccgcagtca gatcctagc
再來選取下游引物振诬，注意蹭睡，在選取下游引物時(shí)要去掉終止密碼子，且需反向互補(bǔ)赶么。
R（5'-3'）：GTCTGAGTCAGGCCCTTCTGTCTTGAAC
然后給引物5‘端加上我們選定的酶切位點(diǎn)的序列肩豁，再加上保護(hù)堿基。這時(shí)需要注意，不能造成移碼突變清钥。
如下：
F（5'-3'）：ctctagcccgggcGGATCCAatggaggagccgcagtcagatcctagc
R（5'-3'）：CGACGATATCGAATTCCTGTCTGAGTCAGGCCCTTCTGTCTTGAAC
引物設(shè)計(jì)完成后就可以送公司合成了琼锋。
然后擴(kuò)增目的基因，對(duì)載體進(jìn)行酶切祟昭，目的基因和載體連接缕坎，轉(zhuǎn)化，檢測(cè)篡悟，提質(zhì)粒谜叹。測(cè)序……
