單細胞測序方法和原理系列：
- 1. 單細胞轉(zhuǎn)錄組建庫原理：SMART捂蕴、TargetAmp和10X genomics
- 2. DNA文庫構(gòu)建和Illumina測序化學(xué)原理
- 3. 單細胞免疫組庫：TCR基因重排原理和TCR測序建庫方法
- 4. 單細胞ATAC-seq原理介紹與報告解讀
- 5. CITE-seq：同時測細胞表面蛋白和RNA的單細胞測序
- 6. LIBRA-seq：快速開發(fā)單克隆抗體的單細胞技術(shù)
一、單細胞測序技術(shù)的發(fā)展史
二淫茵、多種平臺的比較
三、液滴型單細胞測序技術(shù)比較
基于液滴的方法包括15年背靠背發(fā)在cell上的Drop-seq和inDrop配椭，還有17年發(fā)在NC上的10X Genomics Chromium渔欢。
三種液滴型方法采用相似的技術(shù)生成液滴，采用barcode標(biāo)記細胞羹铅，應(yīng)用UMI進行偏好校正。但它們在beads的制造愉昆、barcode的設(shè)計职员、cDNA擴增等不同。
三種方法的比較2019年發(fā)在molecular cell上
總體差異
三種平臺中跛溉，Drop-seq和inDrop的細節(jié)在15年的cell中描敘的非常詳盡焊切。而10X作為商用平臺扮授，技術(shù)細節(jié)未完全披露（整合了inDrop和Drop-seq）
三種技術(shù)的珠子上的序列大體類似，包含PCR handle, cell barcode, UMI和poly-T蛛蒙。inDrop的beads還帶有photo-cleavable moiety和一個T7啟動子糙箍。
但是10X和inDrop采用的是有彈性的水凝膠beads (hydrogel)，引物可以固定在beads里面牵祟，而Drop-seq使用的是聚苯乙烯固體磁珠，引物只能固定在beads表面抖格。相較于Drop-seq體積較小的固體磁珠诺苹，inDrops與10x的膠體珠可以在微流控管道交匯處形變，能夠耐受擠壓雹拄，流速可控收奔，最終可以達到幾乎全部(98%)液滴含有規(guī)定數(shù)量的膠體珠（實現(xiàn)方差的超級小）滓玖，在磁珠相打破了泊松分布(Sub-Poisson loading)坪哄，實現(xiàn)了超泊松分布（super-Poissonian distribution）（僅細胞相服從泊松分布），從而大大提高了細胞的捕獲率势篡。（參考：基于液滴的單細胞測序通量：泊松分布與次泊松分布）
10X is reported to have ~80% bead occupancy and a cell capture rate of ~50%.
包裹到液滴后翩肌，10X的beads發(fā)生溶解，引物釋放到溶液中可以提高mRNA的捕獲效率禁悠。inDrop使用紫外誘導(dǎo)的切割技術(shù)釋放引物念祭。而DropSeq的引物不能從beads釋放，會降低其mRNA捕獲效率碍侦。
此外粱坤，DropSeq和10X的反轉(zhuǎn)錄等過程都在液滴內(nèi)進行，有利于提高效率和降低試劑消耗瓷产。inDrop采用體外轉(zhuǎn)錄方式進行擴增站玄，需要時間比較久。關(guān)于cDNA擴增的方法濒旦，inDrop使用的是CEL-seq株旷，10X和Drop-seq使用的則是類似于Smart-seq的template-switching protocol。參考單細胞轉(zhuǎn)錄組建庫原理：SMART疤估、TargetAmp和10X genomics
結(jié)論
為了比較不同平臺產(chǎn)生的數(shù)據(jù)灾常，研究團隊開發(fā)了可適用于三個分析平臺的數(shù)據(jù)分析框架，方便數(shù)據(jù)比較铃拇。
結(jié)果顯示：
- 基因表達聚類與分析使用的平臺有關(guān)钞瀑，表明存在基因水平的系統(tǒng)特異性量化偏差。研究人員仔細分析了每個平臺中偏差的來源慷荔，發(fā)現(xiàn)Chromium平臺偏愛較短的序列和GC含量較高的序列雕什，而Drop-seq對GC含量較低的基因檢測效果較好。
- 可捕獲的細胞數(shù)目理論值：By rough estimation, the effective barcode size is ～5x104 for inDrop and at least 1x106 for Drop-seq and 3x105 for 10X。
但是10X Genomics微珠的條形碼錯配較少贷岸，另外兩個平臺有超過一半的細胞條形碼出現(xiàn)明顯的錯配壹士。其中，Drop-seq約10%微珠的條形碼出現(xiàn)一個堿基缺失偿警。
- 文庫大小拐點法鑒定含有細胞的液滴躏救，10X和inDrop拐點更明顯
液滴型scRNA-seq方法中只有一小部分的液滴包含珠狀物和一個完整細胞。然而生物實驗不會那么理想螟蒸，有些RNA會從死細胞或破損細胞中漏出來盒使。所以沒有完整細胞的液滴有可能捕獲周圍環(huán)境游離出的少量RNA并且走完測序環(huán)節(jié)出現(xiàn)在最終測序結(jié)果中。液滴大小七嫌、擴增效率和測序環(huán)節(jié)中的波動會導(dǎo)致“背景”和真實細胞最終獲得的文庫大小變化很大少办，使得區(qū)分哪些文庫來源于背景哪些來源于真實細胞變得復(fù)雜。
大多數(shù)方法使用每個barcode對應(yīng)的總分子數(shù)(如果是UMI)或總reads數(shù)的分布來尋找一個“break point”區(qū)分來自于真實細胞的較大的文庫和來自于背景的較小的文庫诵原。
CellRanger假設(shè)真實細胞文庫大小變化在10倍以內(nèi)英妓，用期望的細胞數(shù)目估計區(qū)間的分布。
- 10X Genomics檢測到的基因數(shù)目相對更多绍赛，有效Reads比例也最高
- 就性能而言蔓纠，10X Genomics的靈敏度最高，可在3000個基因中平均捕獲17000個轉(zhuǎn)錄組惹资；Drot-seq檢測到2500個基因的8000個轉(zhuǎn)錄組贺纲；InDrop可檢測到1250個基因的2700個轉(zhuǎn)錄組。靈敏度高的一個好處就是可以通過較少的reads獲取相同級別的分子標(biāo)記褪测。此外猴誊，10X Genomics平臺的噪音也最少。研究人員認(rèn)為侮措，inDrop平臺噪音的一個來源是微珠的易變性懈叹，因為研究中出現(xiàn)了兩批微珠檢測同一樣本的結(jié)果完全不同的情況。
液滴型單細胞測序平臺各有優(yōu)缺點分扎，適用于不同應(yīng)用澄成。總體來說畏吓，10X Genomics的Chromium系統(tǒng)比Drop-seq或inDrop表現(xiàn)更強大墨状，其技術(shù)噪音最小，穩(wěn)定性最高菲饼。
