MSK-IMPACT (Integrated Mutation Profiling of Actionable Cancer Targets) 是美國(guó)紀(jì)念斯隆卡特琳癌癥中心（MSK）的一款 NGS 大panel栓拜，自2014年1月起被 MSK 用于制定晚期癌癥患者的治療方案十籍。該P(yáng)anel 一直進(jìn)行迭代升級(jí)，涵蓋基因數(shù)量也一直在增長(zhǎng)艰管，由2014年的341個(gè)基因彬呻，到2017年的468個(gè)基因俭令，之后又增加了新的腫瘤驅(qū)動(dòng)基因驻粟、與免疫治療及克隆性相關(guān)的基因到2020年的已包括505個(gè)基因友扰。MSK-IMPACT?于2017年11月16日通過(guò)FDA批準(zhǔn)役电，成為第一款通過(guò)審批檢測(cè)組織多癌種多基因的大Panel 赚爵。
MSK-IMPACT 通過(guò)對(duì)腫瘤組織 FFPE 樣本和 Normal 樣本進(jìn)行 Panel 捕獲、NGS測(cè)序及生信分析檢測(cè)宴霸，可以廣泛檢測(cè)基因組中的腫瘤基因突變囱晴。它采用的測(cè)序平臺(tái)是Illumina HiSeq? 2500 Sequencer (qualified by MSK)，檢測(cè)的突變類型有 SNVs瓢谢、INDEL（<30bp）畸写、MSI，不能檢測(cè)CNVs氓扛、重排和TMB枯芬。本篇文章主要對(duì)通過(guò)FDA審批 468 個(gè)基因版本的MSK-IMPACT 技術(shù)細(xì)節(jié)進(jìn)行匯總介紹。
1 panel描述
附表Appendix 1a 列出了MSK-IMPACT的檢測(cè)熱點(diǎn)采郎，附表Appendix 1b 列出了468個(gè)基因和相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄本信息千所，附表Appendix 1c 列出了73個(gè)Panel 覆蓋深度低，不進(jìn)行報(bào)出的基因和外顯子區(qū)域信息蒜埋。
1.1 樣品制備
質(zhì)控要求腫瘤細(xì)胞含量大于10%淫痰，切片含量大于20%，MSI檢測(cè)腫瘤細(xì)胞含量大于25%
1.2 文庫(kù)制備整份、1.3 雜交捕獲
略
1.4 測(cè)序和數(shù)據(jù)分析
1.4.1 樣本配對(duì)檢測(cè)
利用純合位點(diǎn)一致性對(duì)來(lái)自同一樣本的Normal樣品和Tumor樣品的配對(duì)情況進(jìn)行檢測(cè)待错，可以預(yù)期配對(duì)樣品純合位點(diǎn)不一致性較低（<5%）,不配對(duì)樣品純合位點(diǎn)不一致性較高（在25%附近）籽孙。如果配對(duì)樣品純和位點(diǎn)不一致水平較高（>5%）,則被標(biāo)記為“可能不配對(duì)”類型。
1.4.2 樣本污染檢測(cè)
檢測(cè)雜合位點(diǎn)不同等位基因的頻率火俄，如果頻率異常犯建，對(duì)樣品進(jìn)行標(biāo)記為“可能污染”類型。
1.4.3 對(duì)Normal樣品中腫瘤的含量進(jìn)行檢測(cè)
Normal樣品中不應(yīng)該含有SNVs瓜客、INDEL适瓦。分析流程會(huì)對(duì)Normal樣品中的變異熱點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，如果有熱點(diǎn)的變異頻率>1%,對(duì)樣品進(jìn)行標(biāo)記
1.4.4 SNVs 及 INDELs 類型突變檢測(cè)
SNVs( MuTect 軟件) 和 INDELs( SomaticIndelDetector 軟件) CALL變異流程需要 Normal 和 Tumor 配對(duì)樣品谱仪，如果缺少Normal樣品或者Normal樣品的平均測(cè)序深度較低（<50X）, 則從批處理樣品中選擇一個(gè)Normal樣品作為對(duì)照玻熙。
1.4.4.1 分析同批次的陽(yáng)性和陰性對(duì)照樣品
對(duì)NC樣品分析用于確定沒有污染以及對(duì)PC樣品分析用于保證分析的靈敏度
1.4.4.2 深度過(guò)濾
Tumor 樣品質(zhì)控要求 98% 的外顯子覆蓋深度大于200X，配對(duì)Normal樣品深度大于50X
1.4.4.3 高置信度突變過(guò)濾
原始SNV 和INDEL 突變需要經(jīng)過(guò)下面一系列的過(guò)濾來(lái)保證報(bào)出突變的準(zhǔn)確性疯攒。
（1） VFtumor/VFnormal >=5揭芍，AD>=5,VF>=1%
（2） 突變是否在熱點(diǎn)突變庫(kù)中，Appendix 1a 為熱點(diǎn)列表
（3） 熱點(diǎn)： DP>=20,AD>=8,VF>=2%;非熱點(diǎn)：DP>=20,AD>=10,VF>=5%
（4） 過(guò)濾注釋結(jié)果卸例，保留位于外顯子區(qū)域的非同義突變，移碼突變
1.4.5 MSI 檢測(cè)
利用 MSIsensor 軟件計(jì)算 MSK-IMPACT 覆蓋的所有MSI位點(diǎn)的狀態(tài)肌毅。MSIsensor會(huì)計(jì)算出一個(gè)score,如果閾值大于10筷转，標(biāo)記為MSI-H。
1.5 質(zhì)量控制
1.5.1 對(duì)照Normal樣品
病人組織或者外周血作為Normal樣品悬而，如果使用分批中不配對(duì)的Normal樣品呜舒，可能會(huì)有一些稀有的胚系突變被當(dāng)做體細(xì)胞突變
1.5.2 陽(yáng)性對(duì)照（PC）
陽(yáng)性對(duì)照是3個(gè)陽(yáng)性樣品（3個(gè)樣品各自含有不同的類型和頻率的突變信息）的混合，陽(yáng)性對(duì)照的normal樣品是統(tǒng)一批次Normal樣品的混合笨奠，經(jīng)過(guò)流程分析后袭蝗，檢驗(yàn)分析的結(jié)果。（1）已知的突變是否檢出（2）檢出的突變頻率和原始樣品的突變頻率是否一致般婆，Table2是已知的突變頻率的樣本到腥。
1.5.3 陰性對(duì)照（NC）
陰性控制樣本是以前的重復(fù)試驗(yàn)證實(shí)的沒有腫瘤污染和沒有胚系拷貝數(shù)突變的FFPE正常樣品的混合物。以前的分析已經(jīng)確定了正常樣品特有多態(tài)性和頻率蔚袍，將流程產(chǎn)生的862個(gè)SNP的突變頻率和預(yù)期的突變頻率進(jìn)行比較乡范，計(jì)算Pearson一致性。預(yù)期突變頻率應(yīng)該大于0.9
1.5.4 空白對(duì)照
No Template Control(NTC)
1.6 結(jié)果報(bào)告
樣品質(zhì)量控制度量：
探針的Target區(qū)域大概是1.5Mb
1.7 確定流程閾值
這里計(jì)算所需要的覆蓋深度都用到了功效分析（power analysis）的概念
1a 外顯子覆蓋深度的確定：
當(dāng)設(shè)定潛在最低檢測(cè)線如2%時(shí)啤咽，可以通過(guò)功效分析可以計(jì)算出某顯著水平下的reads的深度晋辆。比如當(dāng)突變頻率為10%時(shí)，500X深度95%置信區(qū)間下宇整，突變頻率的范圍在7.5%和13%之間瓶佳。
所以，將10個(gè)不相關(guān)的FFPE的Normal樣本等摩爾的混合創(chuàng)造了一系列預(yù)設(shè)的突變頻率鳞青，最低的突變頻率為5%霸饲。然后用862個(gè)SNPs驗(yàn)證了預(yù)設(shè)的突變頻率和真實(shí)突變頻率之間的關(guān)系为朋。最后試驗(yàn)數(shù)據(jù)支持使用5%作為報(bào)告檢測(cè)到的突變的下限，實(shí)際潛在的頻率為10%贴彼。
2b 樣本覆蓋深度的確定：
如果一個(gè)樣本的平均覆蓋率低于200X潜腻，則該樣本被標(biāo)記為具有更高的假陰性風(fēng)險(xiǎn)。
3c 對(duì)于陽(yáng)性突變檢出所需的突變深度器仗，等位基因深度和突變頻率：
表4中的過(guò)濾標(biāo)準(zhǔn)保證了過(guò)濾大多數(shù)假陽(yáng)性的SNVs和INDELs,同時(shí)保證真陽(yáng)性的潛在檢出頻率在10%（觀測(cè)到的檢測(cè)頻率在5%-17.6%）
1.8 panel表現(xiàn)評(píng)估
(1) 精密度驗(yàn)證
Run內(nèi)和Run間設(shè)置重復(fù)融涣，每個(gè)樣品5個(gè)重復(fù)
1a Panel 精密度驗(yàn)證（標(biāo)準(zhǔn)品的驗(yàn)證）
10個(gè)樣本（9個(gè)FFPE樣本，一個(gè)商業(yè)細(xì)胞系）代表不同的腫瘤類型精钮，不同的突變類型（突變類型已知）威鹿，不同的突變頻率（突變頻率已知）。
2b Panel精密度和重復(fù)性一致性驗(yàn)證（標(biāo)準(zhǔn)品的驗(yàn)證）
Table6在對(duì)已知的突變進(jìn)行精密度評(píng)估時(shí)轨香，也對(duì)重復(fù)樣品檢出的已知突變外的其他突變進(jìn)行了重復(fù)一致性的驗(yàn)證忽你。
5個(gè)重復(fù)樣本檢出的所有突變數(shù)目的一致性
5個(gè)樣品檢出的突變頻率的一致性
Table7列出了10個(gè)測(cè)試樣本（每個(gè)樣本5次重復(fù)）精密度驗(yàn)證的結(jié)果
3c 每個(gè)測(cè)試樣本的精密度驗(yàn)證（標(biāo)準(zhǔn)樣本的驗(yàn)證）
每個(gè)樣本檢測(cè)出的突變，以及每個(gè)突變?cè)?個(gè)重復(fù)樣本間的支持?jǐn)?shù)臂容，每個(gè)突變的陽(yáng)性率
Table8列出了10個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的突變的陽(yáng)性率
4d 良好參考材料精密度驗(yàn)證（另一種標(biāo)準(zhǔn)品）
為了驗(yàn)證測(cè)序錯(cuò)誤和DNA提取對(duì)panel的影響科雳，利用參考標(biāo)準(zhǔn)品（HapMap cell line NA20810），驗(yàn)證MSK-IMPACT脓杉，對(duì)比11,767個(gè)SNPs糟秘，23個(gè)重復(fù)樣本，檢出突變一致性和檢出突變頻率的一致性都很高球散。
5e MSI精密度驗(yàn)證：
用12個(gè)樣本（6個(gè)不同層次的MSI-H樣品尿赚，6個(gè)MSS樣本）測(cè)試了MSIsensor軟件檢測(cè)MSI的精確度。Table9
（2）靈敏度驗(yàn)證（最低檢測(cè)線LoD）
LoD是某一種突變?cè)谒械闹貜?fù)中蕉堰，95%的重復(fù)都可以穩(wěn)定的檢測(cè)出的突變等位基因頻率凌净。本部分就是驗(yàn)證假定突變的LoD。測(cè)試分為兩個(gè)部分屋讶。第一部分是梯度稀釋冰寻，確定可靠的最低突變頻率；第二部分是在眾多重復(fù)中丑婿，驗(yàn)證LoD.
1a 梯度稀釋
選擇10個(gè)FFPE樣本性雄，各選擇5個(gè)覆蓋度最高的外顯子和覆蓋度最低的外顯子。制備5-8個(gè)梯度稀釋
檢出結(jié)果 Table10
2b 確定LoD
在最小突變頻率5%附近羹奉，設(shè)計(jì)了3個(gè)del,4個(gè)insert秒旋，6個(gè)SNVs每個(gè)位點(diǎn)5次重復(fù)。
陽(yáng)性突變檢出結(jié)果 Table 11
（3）準(zhǔn)確性分析（不同檢測(cè)方法的對(duì)比分析）
1a SNV/indel 變異方法的比較
MSK-IMPACT方法與MSK-IMPACT方法正交驗(yàn)證后的原始結(jié)果進(jìn)行了比較诀拭。共檢測(cè)了433個(gè)FFPE樣本的20個(gè)基因的48個(gè)外顯子迁筛，檢出267個(gè)唯一的突變位點(diǎn)。433個(gè)樣品中的已知突變共432個(gè)樣品檢測(cè)出耕挨，一個(gè)樣品的EGFR基因的INSERT漏檢细卧。
檢出的一致性Table15A-C.
2b MSI方法的比較
為了確定MSK-IMPACT的MSIsensor的sore值用于區(qū)分MSS和MSI-H,用MSIsensor和免疫組化尉桩、PCR方法做了對(duì)比，最終確定了sore=10作為區(qū)分的閾值贪庙。
結(jié)果Table16和Table17
2 臨床試驗(yàn)
最終的MSK報(bào)告的突變分為兩種：一種是具有臨床意義的癌癥突變蜘犁，一種是具有潛在意義的癌癥突變。
1a 臨床樣本的驗(yàn)證
MSK測(cè)試了超過(guò)一萬(wàn)例的晚期腫瘤患者止邮，并將病歷信息以及突變信息存儲(chǔ)在了下列網(wǎng)站这橙。
https://www.cbioportal.org/study/summary?id=msk_impact_2017
3 參考文獻(xiàn)
https://www.accessdata.fda.gov/cdrh_docs/reviews/DEN170058.pdf
