日常掰蝦

??前面分別學習了DNA甲基化的基礎知識和甲基化BS-seq的分析方法，不知道的同學可以戳這里苹享，DNA甲基化知識概述弧可、DNA甲基化 Bismark & BAMAP 流程跑起來绷跑。
??今天接著來說DNA甲基化相關的內(nèi)容筷厘！BS-seq做為DNA甲基化的“金標準”還是有一定缺陷的驼修，所以科學家們一直在尋找更加無損的測序方法。目前已經(jīng)嶄露光芒的方向是將甲基化的C堿基轉換為T堿基的技術命咐。
??到底這種技術好不好呢篡九？
??帶著這個疑問，我們一起繼續(xù)往下看醋奠。
??今天的主要內(nèi)容關于（TET-assisted pyridine borane sequencing）榛臼，該技術的核心為Bisulfite-free，同時利用將甲基化的C堿基轉換為T堿基的方法窜司。

5caC/5fC 偶遇 Pyridine borane

??目前已有實驗證明TET蛋白可以將5-甲基胞嘧啶（5mC）and 5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）氧化最終轉換為 5-羧基胞嘧啶（5caC）沛善，在此基礎上，作者通過MALDI技術發(fā)現(xiàn)5caC可以被吡啶硼烷及衍生物（Pyridine borane）還原為二氫尿嘧啶（dihydrouracil塞祈，DHU）金刁，而DHU在鏈擴增方面與自然的U堿基并沒有差異，這樣經(jīng)過PCR擴增DHU可以轉化為T，從而到達不用亞硫酸鹽處理將甲基化的C堿基轉為T堿基的目的尤蛮。其實漠秋，不僅5caC可以被吡啶硼烷還原，5-甲醯钟欤基胞嘧啶（5fC）也可以被還原為DHU庆锦，且兩種的還原效率都很高。另外轧葛，5caC 和 5fC 與吡啶硼烷還原反應可以分別被1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide搂抒、hydroxylamine conjugation這兩化合物所阻斷，這大大增加了TAPS技術的靈活性尿扯，如果結合市場上其他的甲基化測序技術求晶，理論上可以分別測定上面提到的幾種甲基化情況。

??做為Bisulfite-free的技術衷笋，TAPS的優(yōu)勢主要體現(xiàn)在以下幾個方面：1芳杏、實驗時間更短；2辟宗、實驗條件更溫和爵赵，室溫條件即可，而且對DNA片段的影響很小泊脐，基本不會引起DNA的降解空幻，可以保留更長的DNA片段，最長可達10kb容客。這樣構建出來的文庫具有更多的unique read秕铛，即文庫具有更高的復雜度；3缩挑、具有更好的測序質量但两，由于TAPS是將甲基化的C堿基轉換為T堿基，而甲基化的C在基因組中占比很小供置，轉劃后對文庫的堿基平衡幾乎沒有影響谨湘。從而提高堿基測序的質量。

TAPS VS WGBS

??從上面的結果可以看出TAPS技術的優(yōu)勢很明顯士袄，但只有這些優(yōu)勢可不行悲关，結果要穩(wěn)定才可以被接受。所以作者用TAPS的結果與“金標準”BS-seq做了一個對比娄柳，結果也顯示兩者甲基化結果的overlap很高。

分析

??前面介紹了技術艘绍，下面來看看如何分析TAPS的數(shù)據(jù)赤拒。作者基因用python打包了數(shù)據(jù)分析的軟件，用起來還是很方便的：

#安裝
pip install astair

#align
mkdir -p align
astair align -f genome.fa -1 sample_R1.fq.gz -2 sample_R2.fq.gz -d align

#Call methylation
mkdir methcall
astair call -i align/sample_mCtoT.cram -f genome.fa --context all -d methcall

輸出目錄結構如下：

taps
├── align
│   ├── taps_mCtoT.bam
│   └── taps_mCtoT.bam.bai
└── call
    ├── taps_mCtoT_all.mods
    └── taps_mCtoT_all.stats

*_mCtoT_all.mods：甲基化文件，內(nèi)容如下：

#CHROM  START   END     MOD_LEVEL       MOD     UNMOD   REF     ALT     SPECIFIC_CONTEXT        CONTEXT SNV     TOTAL_DEPTH
chr1    3000002 3000003 0.0     0       1       C       T       CTG     CHG     No      2
chr1    3000004 3000005 0.0     0       2       G       A       CAG     CHG     No      3
chr1    3000008 3000009 0.0     0       2       C       T       CTA     CHH     No      4
chr1    3000015 3000016 0.0     0       3       G       A       CAA     CHH     No      5
chr1    3000017 3000018 0.0     0       3       G       A       CAC     CHH     No      5
chr1    3000018 3000019 *       0       0       G       A       CCA     CHH     homozygous      5
chr1    3000022 3000023 *       0       0       C       A       CTT     CHH     homozygous      4
chr1    3000026 3000027 0.0     0       3       G       A       CAA     CHH     No      7
chr1    3000028 3000029 0.0     0       3       G       A       CTC     CHH     No      7
chr1    3000029 3000030 0.0     0       3       G       A       CCT     CHH     No      7

*_mCtoT_all.stats是所有甲基化的統(tǒng)計信息挎挖。
??雖然軟件用起來很方便这敬，但是畢竟只是用python打包了一下，真正需要調用環(huán)境中軟件蕉朵。比如align這步崔涂，會用環(huán)境中的bwa、samtools始衅。所以安裝好astair并不能直接使用冷蚂，使用時還要保證調用的軟件在環(huán)境變量里面。

碎碎念

??從文章結果來看汛闸，TAPS的結果與BS-seq有很好的一致性蝙茶，而且其優(yōu)勢也很明顯，總體來說TAPS的潛力還是很大的诸老，具體能不能成為主流隆夯，我們靜觀其變。按照慣例下面會給出參考資料别伏，方便有需要的朋友蹄衷。今天的分享到此結束~~~

Liu Y , P Siejka-Zielińska, Velikova G , et al. Bisulfite-free direct detection of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine at base resolution[J]. Nature Biotechnology, 2019.
軟件：https://bitbucket.org/bsblabludwig/astair