原理：
凋亡blank不是最好的陰性對(duì)照劝萤，應(yīng)該是用IGg同型對(duì)照最好禁灼，所以圈門可以根據(jù)單染FITC和PI來看結(jié)果。
FITC標(biāo)記的 Annexin V 染色先于細(xì)胞凋亡或細(xì)胞壞死過程中伴隨產(chǎn)生的細(xì)胞膜完整性喪失的出現(xiàn)。因此导绷，利用FITC標(biāo)記的Annexin V染色時(shí)通常結(jié)合活體染料如碘化丙啶（PI）或7-Amino-Actinomycin（7-AAD），方便研究者鑒定出早期凋亡細(xì)胞（PI陰性屎飘，F(xiàn)ITC Annexin V陽性）妥曲。具備完整細(xì)胞膜的活細(xì)胞可以阻止PI浸入，然而細(xì)胞膜壞死或破壞后就可以浸透PI钦购。
- 活細(xì)胞檢測結(jié)果應(yīng)該是FITC Annexin V 陰性和 PI 陰性檐盟；
- 早期凋亡細(xì)胞是FITC Annexin V 陽性 and PI 陰性；
- 晚期凋亡細(xì)胞或已死亡細(xì)胞是FITC Annexin V 陽性和 PI陽性押桃。
- 此檢測不能區(qū)分出經(jīng)歷過凋亡的死細(xì)胞和經(jīng)歷其它壞死途徑的死細(xì)胞葵萎，因?yàn)槎叨紩?huì)同時(shí)被FITC Annexin V 和 PI染色。然而唱凯，持續(xù)觀察細(xì)胞凋亡都會(huì)經(jīng)歷三個(gè)階段：FITC Annexin V 和 PI 都是陰性（活細(xì)胞或沒有明顯細(xì)胞凋亡）羡忘；Annexin V陽性 和 PI 陰性（凋亡早期，具有完整細(xì)胞膜）磕昼；FITC Annexin V and PI 都是陽性（凋亡晚期或死亡）卷雕。經(jīng)歷這三個(gè)階段的細(xì)胞表明是經(jīng)歷細(xì)胞凋亡過程。相反票从，單一觀察顯示細(xì)胞FITC Annexin V和 PI都是陽性不能反映出細(xì)胞是否經(jīng)歷凋亡過程漫雕。
軟件操作：
-
圈細(xì)胞+分門
- 打開flowjo軟件，將要分析的fsc文件直接拖入軟件中
- 雙擊其中一個(gè)峰鄙，調(diào)節(jié)橫坐標(biāo)為“FSC-坐標(biāo)liner處理” 縱坐標(biāo)為“SSC-坐標(biāo)log處理”浸间，并用像“箭頭”一樣的圈出待分析的細(xì)胞群，可將細(xì)胞命名或默認(rèn)為“l(fā)ymphcytes”
- 此時(shí)可以進(jìn)行批量處理圈細(xì)胞群吟榴，將圈出的“l(fā)ymphcytes”拖到軟件上方的“all samples”发框，其他樣品自動(dòng)圈出，可以在圖片顯示屏中挨個(gè)查看其他圈群是否合理，進(jìn)行細(xì)微調(diào)整梅惯，可不將細(xì)胞碎片圈入宪拥。
- 選中圈好的細(xì)胞群，雙擊細(xì)胞群處或者點(diǎn)擊主界面的“l(fā)ymphcytes”
- 調(diào)節(jié)橫縱坐標(biāo)：調(diào)節(jié)橫坐標(biāo)為“FITC-坐標(biāo)log處理” 縱坐標(biāo)為“PI-坐標(biāo)log處理”铣减，并選擇十字架??標(biāo)識(shí)的四分門設(shè)門工具進(jìn)行分門她君。圈門后再批量處理將圈出“Q1, Q2, Q3 ,Q4”全選拖到軟件上方的“all samples”
- 微調(diào)：在批量處理后，展示細(xì)胞圖片的小窗口右上角有向左向右翻看的綠色箭頭葫哗，可以將所有的樣品查看缔刹，并個(gè)別樣品可以進(jìn)行微調(diào)處理。
-
批量處理圖片
- 第一步：在圖片顯示的小窗口打開的情況下劣针，點(diǎn)擊“edit” --- “copy to layout editor” 可以看到圖片顯示
- 第二步批量添加圖片：在“l(fā)ayout editor”界面點(diǎn)擊旁邊的螺絲標(biāo)志的“Batch”點(diǎn)擊內(nèi)部的create batch report(可選擇一下一行訪多少張圖)校镐，所有的圖片全部自動(dòng)導(dǎo)入。
- 第三步調(diào)整：雙擊圖片后點(diǎn)擊“annotation” 可對(duì)橫縱坐標(biāo)重新命名捺典，也可以隱藏本有的橫縱坐標(biāo)”hide label“; 也可以點(diǎn)擊鼠標(biāo)右鍵鸟廓，點(diǎn)擊"annotation"選擇要不要描述圖片的信息，點(diǎn)擊“backgating”可顯示圈門的情況
- 導(dǎo)出圖片：選擇“file”中的“image import”選擇圖片格式襟己，建議選擇矢量圖PDF文件引谜，進(jìn)一步可通過添加到PS再軟件次導(dǎo)出高清的300dpi的tiff文件。（弱直接導(dǎo)出tiff格式分辨率為1dpi）
-
導(dǎo)出excel表格數(shù)據(jù)
- 在軟件“flowjo”界面下的“table editor”將要分析的結(jié)果拖入
- 點(diǎn)擊右上角的螺絲標(biāo)志“create table”, 注意有時(shí)候table會(huì)出現(xiàn)在下面看不到擎浴≡毖剩可以復(fù)制到excel表中
- 此時(shí)可以將某一個(gè)養(yǎng)你的Q2（晚凋）和 Q3（早凋）一起拖入“table editor”潔面，然后將出現(xiàn)的數(shù)值復(fù)制到excel表中贮预，可以利用shift鍵（按住第一個(gè)數(shù)值和最有一個(gè)要復(fù)制的數(shù)值）贝室。
- 通過prism制作柱狀圖，縱坐標(biāo)：percentage of apoptosis cell (%)
