產(chǎn)品特點(diǎn)

◎基因工程優(yōu)化的TdT酶街氢，卓越的脫氧核糖核苷轉(zhuǎn)移活性伞插，可以在凋亡細(xì)胞斷裂的DNA 3’-OH端催化摻入更多的FITC-12-dUTP号阿；

◎特別配方的標(biāo)記緩沖液斟珊，有效縮小FITC-12-dUTP摻入DNA鏈的空間位阻写妥，使FITC標(biāo)記效應(yīng)達(dá)到最大化拳球；

◎熒光信號清晰，背景干凈珍特，特別適用于細(xì)胞涂片祝峻、爬片、石蠟切片和冰凍切片等次坡。

產(chǎn)品介紹

TUNEL (TdT mediated dUTP Nick End Labeling)是檢測細(xì)胞凋亡的經(jīng)典方法呼猪。本試劑盒采用TUNEL法，采用高活性的基因重組末端脫氧核糖核苷轉(zhuǎn)移酶（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT）砸琅，在凋亡細(xì)胞斷裂的DNA 3’-羥基（3’-OH）末端催化摻入FITC-12-dUTP宋距，通過檢測FITC-12-dUTP標(biāo)記的DNA片段來檢測細(xì)胞凋亡。FITC-12-dUTP標(biāo)記的DNA可以用熒光顯微鏡直接觀察症脂，也可用流式細(xì)胞儀檢測谚赎。試劑盒經(jīng)反復(fù)多次優(yōu)化，F(xiàn)ITC-12-dUTP標(biāo)記和未標(biāo)記dNTP處于最佳搭配比例诱篷，這樣在進(jìn)行3’-OH末端核苷酸摻入時(shí)壶唤，同一個(gè)斷裂的DNA片段末端可以有更多的FITC-12-dUTP摻入，從而大大提高了檢測的靈敏度棕所，減少了背景反應(yīng)闸盔。再加上我們高活性的TdT酶，使得本試劑盒的檢測信噪比得以大幅提升琳省，顯著優(yōu)于部分同類試劑盒迎吵。

方法步驟:

1.?樣品預(yù)處理方案

A.?石蠟包埋組織切片

1) 室溫下將石蠟組織切片放入二甲苯中浸泡5分鐘。更換新的二甲苯再浸泡5分鐘以徹底脫掉石蠟针贬；

2) 用100%乙醇浸泡5分鐘击费，更換新的100%乙醇再浸泡5分鐘；

3) 用梯度乙醇（90桦他、80蔫巩、70%）將切片各浸洗一次，每次3分鐘，逐漸增加水分圆仔；

4) 用PBS輕輕潤洗切片垃瞧，并用濾紙吸干玻片上樣本周圍多余的液體。這時(shí)可用石蠟筆或疏水筆在樣品周圍描繪樣品分布的輪廓荧缘，便于下游透性處理和平衡標(biāo)記操作皆警。在實(shí)驗(yàn)過程中，切勿讓樣品干燥截粗。處理好的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤信姓；

5) 用PBS稀釋2mg/ml的蛋白酶K溶液，使其終濃度為20μg/ml绸罗；

6) 每個(gè)樣本上滴加100μl稀釋后的蛋白酶K溶液意推，使其被全部覆蓋，室溫孵育20分鐘珊蟀；

7) 用PBS溶液潤洗樣品菊值。輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體育灸。處理好的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤腻窒。

注意：為得到最好的結(jié)果，蛋白酶K孵育時(shí)間可能需要優(yōu)化磅崭。

B.組織冰凍切片

1) 將破片浸沒在4%多聚甲應(yīng)溶液(溶于PBS)中儿子，室溫孵育15分鐘；

2) 去掉多余液體砸喻，并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體柔逼；

3) 將玻片浸沒在PBS溶液中，室溫孵育15分鐘割岛；

4) 去掉多余液體愉适，并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體。用石蠟筆或指甲油在樣品周圍描繪樣品分布的輪廓癣漆，便于下游透性處理和平衡標(biāo)記操作维咸。在實(shí)驗(yàn)過程中，切勿讓樣品干燥惠爽。處理好的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤癌蓖；

5) 用PBS稀釋2mg/ml的蛋白酶K溶液，使其終濃度為 20μg/ml疆股；

6) 每個(gè)樣本上滴加100μl稀釋的Proteinase K溶液，使其被全部覆蓋倒槐，室溫孵育10分鐘旬痹；

7) 在盛有PBS溶液的敞口燒杯中浸沒清洗樣本2-3次；

8) 去掉多余液體，并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體两残。處理好的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤永毅。

C. 細(xì)胞片

1) 固定細(xì)胞，將細(xì)胞片浸入裝有4%新鮮配制于PBS中的多聚甲醛的染色缸中人弓，在4℃放置 25分鐘沼死；

2) 洗滌載玻片，將其浸入PBS中崔赌，室溫放置5分鐘意蛀。重復(fù)用PBS洗一次；

3) 輕輕去掉多余液體健芭，并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體县钥。這時(shí)可用石蠟筆或指甲油在樣品周圍描繪樣品分布的輪廓，便于下游透性處理和平衡標(biāo)記操作慈迈。在實(shí)驗(yàn)過程中若贮，切勿讓樣品干燥。處理好的樣本放在混盒中保榜樣本的濕潤痒留；

4) 用PBS稀釋2 mg/ml的蛋白酶K溶液谴麦，使其終濃度 為20μg/ml；

5) 每個(gè)樣本上滴加100μl稀釋的蛋白酶 K溶液伸头，使其被全部覆蓋匾效，室溫孵 育5分鐘(也可浸于0.2%配制于PBS中的Triton? X -100溶液中，室溫孵育5分鐘進(jìn)行通透處理)熊锭；

6) 在盛有PBS溶液的敞口燒杯中浸沒清洗樣本2-3次弧轧；

7) 輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體碗殷。處理好的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤精绎。

2.?標(biāo)記及檢測

1) 用去離子水將5×Equilibration Buffer稀釋成1×Equilibration Buffer。

2) 滴加100ul 1×Equilibration Buffer使其全部覆蓋待檢樣本區(qū)域锌妻，室溫孵育10-30分鐘代乃。同時(shí)，在冰上解凍FITC-12-dUTP Labeling Mix仿粹，并且依照表1搁吓，準(zhǔn)備足夠量的用于所有實(shí)驗(yàn)和陽性對照反應(yīng)的TdT孵育緩沖液。對于面積小于5cm2的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)吭历，其體積是50μl堕仔，用50μl乘以實(shí)驗(yàn)和陽性對照反應(yīng)的數(shù)目來確定所需TdT孵育緩沖液的總體積。對于表面積更大的樣本晌区，可成比例的增大試劑體積摩骨。

3) 在平衡后的區(qū)域周圍用吸水紙吸掉多余的 Equilibration Buffer通贞，不要讓組織或細(xì)胞發(fā)干， 然后在組織或細(xì)胞上加50ulTdT孵育緩沖液恼五。

4) 把塑料蓋玻片蓋在細(xì)胞上以保證試劑的平均分布昌罩，在濕盒的底部放上用水浸濕的紙巾，將載玻片置于濕盒內(nèi)灾馒，再將濕盒用鋁箔紙包裹以避免光照, 37℃孵育60分鐘茎用。

5) 移除蓋玻片，并將切片置于PBS溶液中室溫孵育5分鐘睬罗。

6) 輕輕去掉多余液體轨功，換用新鮮的PBS溶液室溫孵育5分鐘。重復(fù)該步驟1次傅物。

7) 用濾紙輕輕擦掉樣本周圍及背面的PBS溶液夯辖。

注意：為了降低背景，可以嘗試載玻片在步驟5用PBS洗一遍之后董饰，再用含0.1% Triton? X-1 00和5mg/ml BSA的PBS洗三次（取代步驟6）蒿褂，每次5分鐘，這樣游離的未反應(yīng)的標(biāo)記物可以清除較干凈卒暂。

8) 將載玻片浸入裝有PI溶液的染色缸啄栓，暗室室溫放置5分鐘，此 處PI溶液是用PBS新配稀釋到1μg/ml的也祠。

9) 洗滌樣本昙楚，將載玻片浸入去離子水中，室溫放置5分鐘诈嘿，共洗三次堪旧。

10) 將載玻片上多余的水吸干，但組織或細(xì)胞保持濕潤奖亚。

11) 立即在熒光顯微鏡下分析樣本淳梦，用標(biāo)準(zhǔn)的熒光過濾裝置在520 ± 20 nm的熒光下觀察綠 色熒光。在>620 nm下觀察PI的紅色熒光昔字。如有必要爆袍，載玻片可在4℃ 黑暗條件下存放過夜。

3. 陽性對照制備：如有必要作郭，可按下述制備陽性對照陨囊。

1) 在樣本預(yù)處理之后，加100ul DNA酶I緩沖液到固定的細(xì)胞上夹攒，室溫孵育5分鐘蜘醋；

2) 輕去液體，加入100μl 20U/ml DNA酶I稀釋液咏尝，室溫孵育10分鐘压语；

3) 輕叩載玻片去掉多余的液體闲先，并將載玻片在裝有去離子水的染色缸中徹底洗3-4次。

注意事項(xiàng)：

陽性對照載波片必須使用單獨(dú)的染色缸无蜂。否則來自陽性對照載玻片上殘余的DNA酶I活性可能會在實(shí)驗(yàn)載玻片上引入高的背景。