Identification of the novel prognostic biomarker, MLLT11, reveals its relationship with immune checkpoint markers in glioma
鑒定新型預后生物標志物MLLT11，揭示其與膠質瘤中免疫檢查點標志物的關系
發(fā)表期刊：Front Oncol
發(fā)表日期：2022 Aug 12
影響因子：5.738
DOI:? 10.3389/fonc.2022.889351
一猛蔽、研究背景
????????膠質瘤分為低級別膠質瘤（WHO 2級和3級）和高級別膠質瘤（WHO 4級）宪肖，是最常見的顱內惡性腫瘤之一揭措。其中，膠質母細胞瘤（GBM）的預后最差。新的治療方法如分子靶向治療和免疫治療被納入治療策略柑潦，但真正能夠改善臨床結果的只有少數(shù)。潛在的原因是膠質瘤往往是一種多基因峻凫、多步驟的遺傳異質性疾病渗鬼，而腫瘤異質性可能是治療失敗的根源。
????????位于1q21染色體上的MLLT11基因編碼一種分子量為～9kDa的蛋白質荧琼，由270個氨基酸組成譬胎。目前，有研究表明命锄，MLLT11的表達水平與細胞分化程度有一定的相關性堰乔。在中樞神經系統(tǒng)（CNS）中，MLLT11的表達隨著神經干細胞（NSCs）分化為神經元而逐漸上調脐恩，其高表達可促進神經元的分化和成熟镐侯。此外，MLLT11還在腫瘤細胞和免疫細胞在TME的相互作用中發(fā)揮重要作用驶冒。
二苟翻、材料與方法
1、數(shù)據(jù)來源
1）從UCSC Xena下載了TCGA的共697個樣本骗污，包括LGG和GBM
2）從CGGA下載了1319份樣本崇猫。CGGA樣品包括mRNAseq_693、mRNAseq_325和CGGA_array數(shù)據(jù)集
3）從GEO數(shù)據(jù)集收集了444個批量樣本需忿，包括GSE43378诅炉、GSE16011蜡歹、GSE74187和GSE83300；GSE84465的四個原發(fā)性GBM患者的單細胞RNA測序（scRNA-seq）數(shù)據(jù)共3589個細胞
4）來自GTEx數(shù)據(jù)庫的105個正常大腦皮層樣本
5）從中南大學湘雅醫(yī)院神經外科收集了創(chuàng)傷后正常腦組織（n = 9）和膠質瘤樣本（n = 27）涕烧，其中分別包括9例2級季稳、3級和4級膠質瘤
2、分析流程
1）分組和生存分析：根據(jù)MLLT11的表達情況將患者分為MLLT11高組和MLLT11低組澈魄，并以最大選擇等級統(tǒng)計法計算的生存數(shù)據(jù)為分界線景鼠；生存分析；Cox回歸分析
2）差異基因鑒定和富集分析：R軟件包limma在每個數(shù)據(jù)集中識別差異表達的基因（DEGs）痹扇；利用R軟件包clusterProfiler對上表達的和下表達的DEGs進行了通路富集分析铛漓；使用GSVA? R軟件包中實現(xiàn)的單樣本基因集富集分析（ssGSEA）對該通路進行評分；使用主成分分析（PCA）對路徑得分矩陣進行降維鲫构。
3）免疫浸潤分析：參考LM22集和歸一化特征矩陣浓恶，引入CIBERSORT去卷積算法，分析浸潤免疫細胞的相對豐度
4）qPCR结笨、Western blotting包晰、免疫組織化學
三、實驗結果
01 - 膠質瘤中MLLT11的臨床和分子特征
????????作者首先比較了TCGA和GTEX數(shù)據(jù)集中MLLT11在LGG炕吸、GBM和正常大腦皮層中的表達伐憾，發(fā)現(xiàn)正常大腦與WHO2級和WHO3級膠質瘤之間沒有明顯差異，MLLT11的表達是在GBM中最低赫模。然后树肃，探索MLLT11在膠質瘤組織學中的表達，發(fā)現(xiàn)GBM的表達量最低瀑罗，其次是星形細胞瘤胸嘴，而正常腦、少白細胞瘤和少突膠質瘤之間沒有差異（圖1A, B）斩祭。根據(jù)中位年齡劣像，患者被分為高年齡和低年齡亞組，在TCGA數(shù)據(jù)集中摧玫，高年齡亞組和低年齡亞組的MLLT11表達有明顯差異（圖1C）耳奕。同時，除GBM外席赂，在LGG中年輕組和老年組之間沒有發(fā)現(xiàn)MLLT11表達的明顯差異（圖1D）吮铭。同樣的結果也見于CGGA數(shù)據(jù)集（補充圖1A时迫，B）颅停。此外，MLLT11的表達差異也可以在高年齡組和低年齡組的不同WHO病理分級中進行分析掠拳。結果顯示癞揉，在高年齡組和低年齡組中，MLLT11的表達水平隨著腫瘤分級的增加有明顯的下降趨勢（補充圖1C，D）喊熟。值得注意的是柏肪，在CGGA數(shù)據(jù)集和TCGA數(shù)據(jù)集中，男性和女性的MLLT11表達在不同的WHO病理等級中沒有發(fā)現(xiàn)明顯的差異（補充圖1E-G）芥牌。
????????近年來烦味，隨著膠質瘤分子病理學的快速發(fā)展，IDH突變壁拉、1p/19q聯(lián)合性缺失谬俄、MGMT甲基化狀態(tài)等一系列分子標志物被認為與膠質瘤惡性腫瘤及患者預后有關。本研究對與臨床相關的分子生物標志物進行了探討弃理。在TCGA數(shù)據(jù)集中溃论，1p19q聯(lián)合性缺失狀態(tài)和非聯(lián)合性缺失狀態(tài)之間的MLLT11表達存在顯著差異。與1p19q非聯(lián)合性缺失相比痘昌，MLLT11在1p19q聯(lián)合性缺失中的表達更高（圖1E）钥勋，在LGG中也有同樣的結果（補充圖1H，I）辆苔。在非聯(lián)合性缺失的患者中算灸，MLLT11的表達隨著腫瘤分級的增加而逐漸下降（圖1F）。此外驻啤，MLLT11的表達水平在IDH突變和非突變之間有明顯差異乎婿，這在CGGA和TCGA數(shù)據(jù)集中得到驗證。在IDH突變亞型中街佑，MLLT11的表達與正常腦相似谢翎，明顯高于IDH野生型膠質瘤，在GBM中差異更為明顯（圖1G-J）沐旨。在CGGA_325森逮、CGGA_693和CGGA_array數(shù)據(jù)集中也發(fā)現(xiàn)類似的結果（補充圖1J-O）。此外磁携，還發(fā)現(xiàn)與單獨的IDH突變或1p/19q聯(lián)合性缺失相比褒侧，IDH突變合并1p/19q聯(lián)合性缺失的MLLT11表達量最高（圖1K），說明MLLT11表達的預后價值與已知的IDH突變合并1p/19q聯(lián)合性缺失一致谊迄。
????????采用qPCR闷供、Western blotting和IHC染色來檢測不同等級的膠質瘤樣本（n = 27）和正常腦組織（n = 9）中MLLT11的mRNA轉錄水平和蛋白表達。qPCR結果顯示统诺，MLLT11在腫瘤組織中的表達水平明顯低于正常腦組織歪脏，但在不同等級的膠質瘤之間沒有明顯差異（圖1L）。此外粮呢，Western blotting和IHC結果證實婿失，與GBM組織相比钞艇，MLLT11在正常腦組織和LGG中的表達更高（圖1M，N）豪硅。在上述分析中哩照，MLLT11表達水平較高的膠質瘤患者在膠質瘤患者中獲得了良好的預后±粮。基于以上信息飘弧，作者推斷MLLT11在GBM中明顯下降，并可能在膠質瘤的侵襲過程中發(fā)揮重要作用砚著。
02 - MLLT11表達水平顯示膠質母細胞瘤的亞型偏好
????????基于TCGA中批量表達的研究表明眯牧，GBM可分為四種亞型，即經典型（TCGA-CL）赖草、間質型（TCGA-ME）学少、原神經型（TCGA-PN）和神經型（TCGA-NE），其中PN亞型的預后相對較好秧骑，但CL和ME亞型更具侵略性版确，預后差。在這項研究中乎折，作者從TCGA和GTEx數(shù)據(jù)集中檢測了LGG绒疗、GBM樣本和正常組織中的MLLT11表達，發(fā)現(xiàn)在TCGA和CGGA數(shù)據(jù)集中骂澄，MLLT11表達的增加與NE和PN亞型有關（圖2A-D）吓蘑。
????????為了探索MLLT11在膠質瘤中的作用，進一步從單細胞的角度分析了MLLT11在膠質瘤中的表達坟冲。從四個膠質瘤樣本中發(fā)現(xiàn)了七個細胞簇磨镶，主要包括星形膠質細胞、少突膠質細胞健提、少突膠質細胞前體細胞（OPCs）琳猫、腫瘤細胞、神經元私痹、血管內皮細胞和免疫細胞（圖2E）脐嫂。MLLT11的表達主要集中在腫瘤細胞、免疫細胞和OPCs中（圖2F）紊遵。此外账千，根據(jù)Neftel等人在2019年提出的GBM的四種類型進行scRNA-seq聚類，主要包括AC樣暗膜、NPC樣匀奏、OPC樣和MES樣四個細胞群，其中TCGA-PN亞型對應NPC樣細胞狀態(tài)桦山。本研究結果顯示攒射，MLLT11主要在NPC樣細胞中表達醋旦，這與其他三組細胞亞型明顯不同（圖2G-I）恒水。這與批量腫瘤測序的表達一致会放，即MLLT11主要在TCGA-NE和TCGA-PN中上調。這表明MLLT11可以作為GBM亞型的標志物钉凌。
03 - MLLT11的表達水平與膠質瘤患者的預后有關
????????從上述生物信息學分析結果來看咧最，作者認為MLLT11的表達與膠質瘤的惡性程度有明顯的相關性，即在膠質瘤中御雕，MLLT11的表達隨著腫瘤惡性程度的增加呈下降趨勢矢沿。為了進一步測試和驗證這一結果的可靠性，在TCGA酸纲、CGGA和GEO的八個數(shù)據(jù)集中評估了MLLT11的預后價值捣鲸。在這些數(shù)據(jù)集中，患者被分為低表達亞組和高表達亞組闽坡，并使用對數(shù)秩檢驗分析進行生存分析栽惶。結果發(fā)現(xiàn)，在TCGA疾嗅、CGGA_array和CGGA_RNAseq_325數(shù)據(jù)集中外厂，MLLT11表達量較高的患者（LGG和GBM）的預后明顯好于低表達亞組（圖3A-C）。在GSE43378數(shù)據(jù)集中代承，雖然在MLLT11高表達組和低表達組之間沒有發(fā)現(xiàn)明顯的統(tǒng)計學意義汁蝶，但它們之間仍有類似的趨勢（圖3D）。另外论悴，在GBM患者中掖棉，也發(fā)現(xiàn)MLLT11高表達的患者在CGGA_RNAseq_693數(shù)據(jù)集、GSE16011數(shù)據(jù)集膀估、GSE74187數(shù)據(jù)集和GSE83300數(shù)據(jù)集中表現(xiàn)出更好的預后（圖3E-H）啊片。
????????為了探索對膠質瘤患者生存的影響，評估了TCGA數(shù)據(jù)集隊列中MLLT11的預后價值玖像。應用多變量Cox回歸分析來研究該簽名的預后能力紫谷，結果發(fā)現(xiàn)，在調整了年齡捐寥、性別笤昨、IDH、MGMT啟動子握恳、端粒酶逆轉錄酶（TERT）啟動子和1p19q聯(lián)合性缺失狀態(tài)后瞒窒，MLLT11的表達是膠質瘤患者的獨立預后生物標記（圖3I）。此外乡洼，TCGA數(shù)據(jù)集的ROC曲線分析被用來全面評估該模型的敏感性和特異性崇裁。在泛膠質瘤隊列中匕坯，MLLT11的AUC為68%（圖3J）。
04 - MLLT11高表達組和低表達組之間的差異
????????作者分析了TCGA中MLLT11低表達和高表達組之間的DEGs拔稳，得到301個DEGs（230個上調葛峻，71個下調）（圖4A）。KEGG富集分析表明巴比，MLLT11上調的DEGs參與了與神經活性配體-受體相互作用术奖、突觸囊泡循環(huán)、cAMP信號通路轻绞、谷氨酸突觸和GABA能突觸有關的通路（圖4B）采记，而MLLT11下調的DEGs則參與了與補體和凝血級聯(lián)以及花生四烯酸代謝有關的通路（圖4C）。同樣政勃，在CGGA_325數(shù)據(jù)集和CGGA_array數(shù)據(jù)集中唧龄，MLLT11上調的基因也主要富集在GABA能突觸、逆行性內脂蛋白信號傳導奸远、突觸囊泡循環(huán)和谷氨酸突觸既棺。MLLT11下調的基因主要富集在細胞外基質（ECM）-受體相互作用、蛋白質消化和吸收然走、補體和凝血級聯(lián)的途徑中援制。在生物過程類別中，在TCGA數(shù)據(jù)集中芍瑞，發(fā)現(xiàn)了MLLT11上調的DEG富集的GO術語晨仑，主要涉及突觸結構的發(fā)展和調節(jié)、膜電位的調節(jié)和突觸后膜電位等途徑（圖4D）拆檬。MLLT11下調的DEGs主要富集在ECM和細胞外結構組織以及對傷口反應的調節(jié)和對傷口愈合的調節(jié)途徑中（圖4E）洪己，同樣的結果也出現(xiàn)在CGGA數(shù)據(jù)集中【构幔基于這些分析答捕，MLLT11可能通過ECM組織影響膠質瘤微環(huán)境，并可能促進突觸信息以影響膠質瘤的進展屑那。
05 - MLLT11相關生物過程與免疫療法的關系
????????為了進一步研究與MLLT11表達相關的生物學過程拱镐，作者根據(jù)MLLT11的表達，進行了PCA研究低表達亞組和高表達亞組之間的代謝狀況差異持际。PCA結果顯示沃琅，在TCGA數(shù)據(jù)集中，PCA1(Dim1)和PCA2(Dim2)對總變異的貢獻分別占55.5%和15.1%（圖5A）蜘欲。同樣益眉，在CGGA數(shù)據(jù)集中，Dim1和Dim2分別占總方差的66.4%和7%（圖5B）。此外郭脂，對DEGs進行了KEGG富集分析年碘，以探索TCGA和CGGA中MLLT11低表達和高表達子組之間的代謝狀態(tài)差異。發(fā)現(xiàn)在低表達亞組中展鸡，DEGs明顯參與了多個腫瘤和免疫相關的途徑屿衅，如白細胞跨內皮遷移、細胞因子-細胞因子受體相互作用娱颊、腸道免疫網絡的IgA產生傲诵、移植物抗宿主疾病凯砍、原發(fā)性免疫缺陷箱硕、自身免疫性甲狀腺疾病、糖胺聚糖降解悟衩、溶酶體剧罩、ECM-受體相互作用和谷胱甘肽代謝（圖5C，D）座泳。然而惠昔，在MLLT11低表達亞組中，泛素介導的蛋白分解挑势、耪蚍溃磺酸和次牛磺酸代謝潮饱、WNT信號通路来氧、哺乳動物/雷帕霉素機械靶標（mTOR）信號通路。包括ERB-B1（EGFR香拉，HER1）啦扬、ERB-B2（HER2）、ERB-B3（HER3）和ERB-B4（HER4）（ERBB）信號通路凫碌，以及磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)被富集起來扑毡。這些結果在CGGA的其他數(shù)據(jù)集中也有類似的發(fā)生。這些表明盛险，膠質瘤的侵襲性與異常的免疫狀態(tài)有關瞄摊。
????????為了研究MLLT11的高表達有助于改善預后的機制，作者通過CIBERSORT算法探討了MLLT11表達與22種免疫細胞的免疫浸潤水平之間的相關性苦掘。在CGGA和TCGA測序數(shù)據(jù)集中换帜，皮爾遜相關分析被用來識別與MLLT11表達密切相關的免疫細胞。TCGA數(shù)據(jù)集的結果顯示鸟蜡，MLLT11的表達與幼稚CD4 T細胞和CD8 T細胞的浸潤水平呈正相關膜赃，與巨噬細胞，尤其是M2巨噬細胞的浸潤水平呈負相關（圖6A揉忘，B）跳座。在CGGA陣列和CGGA 325數(shù)據(jù)集中也發(fā)現(xiàn)了類似的結果端铛。此外，通過qPCR疲眷、IHC和Western blotting禾蚕，在不同病理級別的膠質瘤組織中，發(fā)現(xiàn)隨著腫瘤級別的增加狂丝，M2型巨噬細胞特異性標記物的表達水平明顯增加换淆，包括CD206、CD163几颜、ARG1倍试、CD115和IL-10（圖7）。這可能是在腫瘤進展過程中蛋哭，隨著MLLT11表達水平的降低和免疫浸潤水平的提高县习，產生的M2免疫細胞可能會促進腫瘤的侵襲過程。
????????最近谆趾，免疫療法在治療癌癥方面取得了巨大的進展躁愿。考慮到免疫檢查點分子對免疫反應和免疫治療的重要性沪蓬，分析了幾個常見的免疫檢查點成員彤钟，并評估了MLLT11和這些免疫檢查點之間的相關性，如HAVCR2（TIM-3）跷叉、CD274（PD-L1）逸雹、CD276（B7-H3）、CD80性芬、PDCD1LG2（PD-L2）峡眶、PDCD1（PD-1）和IDO1。在CGGA數(shù)據(jù)集和TCGA數(shù)據(jù)集中植锉，對MLLT11的表達水平和七個免疫檢查點之間的關系進行了Pearson相關分析辫樱。在TCGA數(shù)據(jù)集中，在WHO 3級膠質瘤中俊庇，MLLT11與PD-1狮暑、PD-L1、TIM3（HAVCR2）和PD-L2（PDCD1LG2）呈現(xiàn)高度負相關關系（圖6）辉饱。同樣搬男，在GBM中發(fā)現(xiàn)MLLT11和PD-L1、TIM3（HAVCR2）和PD-L2（PDCD1LG2）之間存在強烈的負相關關系（圖6）彭沼。在CGGA_325和CGGA_array數(shù)據(jù)集中也可以看到類似的趨勢缔逛。這些發(fā)現(xiàn)表明，MLLT11可能在免疫反應中具有關鍵作用；特別是當MLLT11表達較低時褐奴，免疫治療可能更有效按脚。
四、結論
? ? ? ? 基于上述生物信息學分析和膠質瘤的實驗驗證敦冬，根據(jù)膠質瘤的臨床病理特征辅搬、分子亞類和預后，系統(tǒng)地探討了MLLT11的表達模式脖旱。同時堪遂，還分析了MLLT11與TME中免疫細胞之間的關系。這些結果初步闡明了MLLT11在膠質瘤進展中的關鍵作用萌庆。需要進一步研究探討MLLT11作為膠質瘤的新型生物標志物或治療介質溶褪，針對MLLT11的相關藥物研究將有很大的潛力。
