10x Chromium 平臺(tái)的核心 -- Next GEM 技術(shù)
Next GEM 技術(shù)的核心 -- 凝膠微珠
凝膠微珠（Gel Beads）表面上百萬(wàn)的寡核苷酸引物序列是多種建庫(kù)策略得以高效實(shí)現(xiàn)的關(guān)鍵
3' v2 Libraries
3' v2 library是在mRNA 3' 端捕獲并擴(kuò)增糊探，凝膠微珠上的 Oligo Primer 由22nt Illumina擴(kuò)增引物Read1信认，16nt 10x Barcode，10nt Unique Molecular Identifier (UMI) 和30nt Poly(dT)VN構(gòu)成齿拂。
對(duì)于10x Barcode奏赘，每個(gè)微珠上的序列相同搞监，不同微珠上的序列不同仁连，用以區(qū)分文庫(kù)的細(xì)胞來(lái)源。而對(duì)于UMI昌罩，每個(gè)微珠上的序列各異哭懈，捕獲的mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA有不同的UMI標(biāo)簽，后經(jīng)擴(kuò)增茎用，測(cè)序遣总，再數(shù)據(jù)分析時(shí)，可有效避免PCR bias轨功。Poly(dT)反轉(zhuǎn)錄引物對(duì)3' 端為Poly(A)的mRNA進(jìn)行捕獲旭斥，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，反轉(zhuǎn)錄生成cDNA古涧。
使用的反轉(zhuǎn)錄酶會(huì)在反轉(zhuǎn)錄到達(dá)mRNA 5'末端時(shí)垂券，在cDNA 3' 末端添加不依賴模板的多個(gè)C堿基，template switching oligo（TSO）的3' 端有三個(gè)非脫氧的G堿基羡滑，可與cDNA 3' 端雜交互補(bǔ)菇爪，在反轉(zhuǎn)錄酶作用下卒暂，cDNA繼續(xù)延長(zhǎng)，終止后用于下游擴(kuò)增娄帖。
GEMs隨之破裂，收集cDNA分子昙楚，進(jìn)行PCR擴(kuò)增近速。cDNA擴(kuò)增后，進(jìn)行酶切片段化堪旧，篩選尺寸合適的插入片段削葱，通過(guò)末端修復(fù)，加A尾淳梦，接頭連接Read2測(cè)序引物析砸。再經(jīng)過(guò)PCR連接上Illumina P5、P7接頭和Sample index爆袍。文庫(kù)構(gòu)建完成首繁。最終得到的3' 基因表達(dá)文庫(kù)結(jié)構(gòu)如下圖紅框所示。
V(D)J Libraries
V(D)J library是在mRNA 5' 端捕獲并擴(kuò)增陨囊，凝膠微珠上的 Oligo Primer 與3' v2 library相比弦疮，沒(méi)有了30nt Poly(dT)VN，取而代之的是13 nt Switch Oligo蜘醋。
游離的Poly(dT)引物與mRNA 3'端的Poly(A)互補(bǔ)胁塞，引起逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，與3' v2 library相同压语，使用的反轉(zhuǎn)錄酶會(huì)在反轉(zhuǎn)錄到達(dá)mRNA 5'末端時(shí)啸罢，在cDNA 3' 末端添加不依賴模板的多個(gè)C堿基，進(jìn)而與凝膠微珠上的TSO末端的rGrGrG互補(bǔ)雜交胎食，在反轉(zhuǎn)錄酶作用下扰才，cDNA繼續(xù)延長(zhǎng)，終止后用于下游擴(kuò)增斥季。
之后可作類似3' v2 library的多輪PCR训桶，構(gòu)建得到5' 基因表達(dá)文庫(kù)，如下圖紅框所示酣倾。
而同步可進(jìn)行的舵揭，是V(D)J enriched 文庫(kù)的構(gòu)建。其中TCR或者BCR的V(D)J序列通過(guò)設(shè)計(jì)在C區(qū)域的巢式PCR引物進(jìn)行富集躁锡，之后仍然是片段化午绳，加A尾，接頭連接Read2測(cè)序引物等等步驟映之，最終V(D)J enriched 文庫(kù)文庫(kù)結(jié)構(gòu)如下圖紅框所示拦焚。
