- 我們用兩篇文章的篇幅大概講了一遍質(zhì)粒骨架及其各個(gè)要素的介紹：
解剖式學(xué)習(xí)一個(gè)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)--update
質(zhì)粒系列之什么是質(zhì)粒 - 再談了最傳統(tǒng)的限制性克隆：
質(zhì)粒系列之限制性克隆--restriction cloning - 前面還夾雜的講過一些piggybac、gateway、RMCE的一些內(nèi)容：
基因編輯如何換藥不換湯 -
慢病毒系列也有講過兩篇：
團(tuán)隊(duì)作案HEK293，史上最強(qiáng)搬磚細(xì)胞
不想再用慢病毒了孤荣，我還有什么別的選擇嗎？piggyBac transposon - 此外我們本還有一個(gè)CRISPR screening的專題疗韵，只有開頭慧域，未得完善：精準(zhǔn)大海撈針--5. CRISPR screening專題
每次都想要一篇文章的篇幅講完，但知識總是越學(xué)越知道自己的無知片拍，于是每次就像打補(bǔ)丁一樣這里打一下那里打一下煌集，導(dǎo)致文章都不成系列，十分松散捌省。關(guān)于Gibson assembly其實(shí)我之前也講過苫纤，只是都不記得放在哪一篇里了。這是最近學(xué)習(xí)的筆記。
限制性克隆所謂成也限制性卷拘，敗也限制性喊废，限制性克隆的最大的限制來源于其“限制性。Gibson assembly不依賴限制性內(nèi)切酶恭金，可一步完成多個(gè)DNA序列的組裝操禀，大大提升DNA組裝速率，同時(shí)還可降低載體自連的概率横腿，是多片段DNA序列連接的首選方式。下表簡單比較兩種方法的特點(diǎn)斤寂。
| 限制性克隆 | Gibson assembly | |
|---|---|---|
| 實(shí)驗(yàn)原理 | 酶切連接 | 同源重組 |
| 工具酶 | 限制性內(nèi)切酶耿焊、DNA連接酶；必要時(shí)需去磷酸化及磷酸化 | 核酸外切酶（5‘ or 3'）遍搞、DNA聚合酶罗侯、DNA連接酶 |
| 酶切位點(diǎn) | 需特異性酶切位點(diǎn) | 不依賴特異性酶切位點(diǎn) |
| 末端 | 插入片段與載體粘性末端需互補(bǔ)，平端可直連溪猿，但平端更易自連钩杰。 | 任意末端都可經(jīng)由PCR加入overlap序列，達(dá)到有“同源”可重組的效果诊县。 |
| 優(yōu)點(diǎn) | 1. 單次實(shí)驗(yàn)花費(fèi)較低讲弄，設(shè)計(jì)簡單；2. 分步進(jìn)行依痊，易于查錯(cuò)避除；3. 適用于簡單的片段插入，以及中等大小片段擴(kuò)增無法達(dá)成或易出錯(cuò)時(shí)胸嘁。 | 1. 效率高瓶摆，操作簡單，一步到位性宏；2. 不依賴酶切位點(diǎn)群井，適用于任意片段。 |
| 缺點(diǎn)和隱患 | 1. 依賴特異性酶切位點(diǎn)毫胜，需多步進(jìn)行书斜，操作復(fù)雜，耗時(shí)較長指蚁；2. 需備多種限制性內(nèi)切酶菩佑，酶存放時(shí)間過久易失活；3. 大片段（> 6 kb）連接效率不高凝化。 | 1. 需要設(shè)計(jì)引物并通過高保真PCR擴(kuò)增片段稍坯，片段過長不易擴(kuò)增且易出錯(cuò)；2. 同源重組效率依賴于同源臂的選擇，載體內(nèi)有相似序列會影響同源重組效率瞧哟，也有錯(cuò)配可能混巧。 |
1. 一覽眾山小
這查資料的時(shí)候發(fā)現(xiàn)特別有趣，原來無論是限制性克隆還是Gibson assembly勤揩，都是出自同一個(gè)實(shí)驗(yàn)室/機(jī)構(gòu)咧党。
左邊這位Hamilton Smith教授是II類限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)者之一，并因這一發(fā)現(xiàn)與Daniel Nathans和Werner Arber共同獲得了1978年的諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎陨亡。而右邊的Daniel Gibson 于2004年到 J. Craig Venter Institute(克雷格·文特爾研究所 )的 Hamilton Smith組做博后傍衡，負(fù)責(zé)細(xì)菌基因組合成的相關(guān)課題。而 J. Craig Venter則因其牽頭人類基因組計(jì)劃而聞名负蠕，創(chuàng)立了 J. Craig Venter Institute及Synthetic Genomics Inc. (SGI) 公司
2. 發(fā)現(xiàn)之初
從2004年Gibson入職到2008年蛙埂，不到4年時(shí)間，Gibson和Smith在Science上共同發(fā)表了酵母細(xì)胞完成支原體基因組組裝的文章遮糖，而這篇文章用到的DNA片段組裝方法則在2009年發(fā)表于Nature Methods
從上圖Nature Methods文章的摘要可看到绣的，Gibson使用5‘核酸外切酶，DNA聚合酶和DNA連接酶完成了多DNA片段的一步連接欲账，而這就是我們現(xiàn)在常用的Gibson assembly屡江。
3. 實(shí)驗(yàn)過程示意
一般實(shí)驗(yàn)室都直接購買配好的Gibson assembly mixture，但也可自行購買T5 核酸外切酶赛不、DNA聚合酶以及DNA連接酶配置惩嘉。Gibson操作簡單，具體過程和步驟都寫在下圖中：
需要注意的事項(xiàng)有：
(1) 一般說明書推薦所有片段都用PCR手段獲得俄删，但長片段會有因PCR而引入突變宏怔，因此，骨架大片段可采用限制性內(nèi)切酶處理后獲取畴椰。
(2) 如果兩端序列中有多個(gè)同源序列臊诊，則會有錯(cuò)誤同源重組的可能，例如Loxp序列等等斜脂。
4. 核酸內(nèi)切酶 vs 核酸外切酶
對比限制性克隆和Gibson assembly抓艳，最大的區(qū)別是無需特定的酶切位點(diǎn)，然而實(shí)際上還是需要overlap的懸端帚戳，只是這個(gè)懸端可以由PCR帶來玷或，同時(shí)核酸外切酶的末端修整，使得overlap序列暴露片任，從而完成同源重組偏友。那么核酸內(nèi)切酶和核酸外切酶的差別和分類我們可以簡單來學(xué)習(xí)一下：
從名字來看，內(nèi)切酶切的是序列內(nèi)部对供，外切酶切的則為外部（5’或3‘末端）位他，具體的比較可如下表：
| Basis for Comparison | Endonuclease | Exonuclease |
|---|---|---|
| 定義 | 切割多核苷酸內(nèi)部磷酸二酯鍵的酶類 | 可以一次從5 '或3 '端切割多核苷酸鏈中的DNA序列的酶類 |
| 分類 | 3類：I型和III型是大型多亞基復(fù)合物氛濒，包括內(nèi)切酶和甲基化酶活性； I型可以切割距離識別序列大約1000個(gè)堿基對或更遠(yuǎn)的位點(diǎn)鹅髓，它需要ATP作為能量來源 舞竿；III型則可 可識別短的不對稱序列，切割距離識別序列外約25個(gè)堿基對的位點(diǎn)窿冯，在這個(gè)過程中也需要ATP 骗奖；而II型則由Hamilton發(fā)現(xiàn)， 它們是內(nèi)切酶的簡單版本醒串，通常識別短回文序列并直接切割該序列执桌，在降解過程中不需要ATP | 真核生物和原核生物有三種類型的外切酶參與mRNA的正常轉(zhuǎn)換: （I型）5’ - 3‘外切酶 (Xrn1)，這是一個(gè)依賴的脫殼蛋白; （II型 ）非依賴性 3′ - 5′ 核酸外切酶厦凤；（III型）poly(A)特異性3’ - 5‘外切酶鼻吮。 |
| 活性遲滯期 | 由于某些核酸內(nèi)切酶是限制性內(nèi)切酶，因此在該酶類識別到特定位點(diǎn)之前较鼓，該酶不具活性，此為活性遲滯期违柏。 | 無 |
| 切割結(jié)果 | 由于切割的是序列內(nèi)部博烂，因此產(chǎn)物也是多核苷酸 | 裂解DNA序列，產(chǎn)生單個(gè)核苷酸或核苷 |
| 末端 | 可以是平端或粘性末端 | 粘性末端 |
| 特異性 | 限制性內(nèi)切酶可用于切割DNA序列中的特定位點(diǎn)漱竖。 | 一般無特異性 |
| 防御屬性 | 部分可防御外來病原體 | 并無防御外來病原體的屬性 |
| 對環(huán)狀DNA的效果 | 可切割 | 對環(huán)狀DNA的活性低于現(xiàn)狀DNA |
| 可抑制性 | 內(nèi)切酶硫代磷酸酯鍵連接的核苷酸仍具有活性禽篱，除非整個(gè)序列都是這個(gè)鍵。 | 對硫代磷酸酯連接的核苷酸不具活性 |
結(jié)語
兩種方法自是各有優(yōu)缺馍惹，雖目前多用Gibson assembly躺率，但限制性克隆仍然常用。限制性內(nèi)切酶種類繁多万矾，其中Type IIS克隆更是被稱為Golden Gate cloning悼吱。從操作時(shí)間來看，Golden Gate是最簡單的方法之一良狈，單管內(nèi)酶切和連接可在30分鐘內(nèi)完成后添。由于Type IIS酶切不保留酶的識別位點(diǎn)，因此連接產(chǎn)物的形成是不可逆的薪丁，連接效率幾近100%遇西。且Golden Gate 克隆限制性克隆需分步完成的缺點(diǎn)，在同一管內(nèi)可完成多達(dá)10個(gè)片段的連接严嗜，果子老師稱之為--質(zhì)粒改造的王者粱檀。下周，我們將會聊聊這Golden Gate cloning漫玄，敬請期待茄蚯。
