hello耀里，大家好略板，今天給大家分享一些10X單細(xì)胞（10X空間轉(zhuǎn)錄組）做WGCNA分析時的一些東西疚膊，個人認(rèn)為很重要撑碴，不過不得不承認(rèn)的是，10X單細(xì)胞（10X空間轉(zhuǎn)錄組）做WGCNA分析發(fā)的文章很少捆愁，究其原因叉袍，還是無法真正的利用WGCNA分析內(nèi)容與10X單細(xì)胞（10X空間轉(zhuǎn)錄組）很好的結(jié)合塑煎，但是這個分析其實很重要，接下來我們就來分享10X單細(xì)胞（10X空間轉(zhuǎn)錄組）做WGCNA分析的智慧类浪。

WGCNA基本概念

加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析 (WGCNA, Weighted correlation network analysis)是用來描述不同樣品之間基因關(guān)聯(lián)模式的系統(tǒng)生物學(xué)方法载城，可以用來鑒定高度協(xié)同變化的基因集, 并根據(jù)基因集的內(nèi)連性和基因集與表型之間的關(guān)聯(lián)鑒定候補生物標(biāo)記基因或治療靶點。（當(dāng)然费就，在我們這里每個barcode就會使一個“樣本”）

相比于只關(guān)注差異表達的基因诉瓦，WGCNA利用數(shù)千或近萬個變化最大的基因或全部基因的信息識別感興趣的基因集，并與表型進行顯著性關(guān)聯(lián)分析力细。一是充分利用了信息睬澡，二是把數(shù)千個基因與表型的關(guān)聯(lián)轉(zhuǎn)換為數(shù)個基因集與表型的關(guān)聯(lián)，免去了多重假設(shè)檢驗校正的問題眠蚂。（表型關(guān)聯(lián)是WGCNA設(shè)計的初衷煞聪，但是到了我們這里，關(guān)聯(lián)的就是細(xì)胞類型）

理解WGCNA逝慧，需要先理解下面幾個術(shù)語和它們在WGCNA中的定義米绕。

• 共表達網(wǎng)絡(luò)：定義為加權(quán)基因網(wǎng)絡(luò)。點代表基因馋艺，邊代表基因表達相關(guān)性。加權(quán)是指對相關(guān)性值進行冥次運算 (冥次的值也就是軟閾值 (power, pickSoftThreshold這個函數(shù)所做的就是確定合適的power))迈套。無向網(wǎng)絡(luò)的邊屬性計算方式為 abs(cor(genex, geney)) ^ power捐祠；有向網(wǎng)絡(luò)的邊屬性計算方式為 (1+cor(genex, geney)/2) ^ power; sign hybrid的邊屬性計算方式為cor(genex, geney)^power if cor>0 else 0。這種處理方式強化了強相關(guān)桑李，弱化了弱相關(guān)或負(fù)相關(guān)踱蛀，使得相關(guān)性數(shù)值更符合無標(biāo)度網(wǎng)絡(luò)特征，更具有生物意義贵白。如果沒有合適的power率拒，一般是由于部分樣品與其它樣品因為某種原因差別太大導(dǎo)致的，可根據(jù)具體問題移除部分樣品或查看后面的經(jīng)驗值禁荒。

• Module(模塊)：高度內(nèi)連的基因集猬膨。在無向網(wǎng)絡(luò)中，模塊內(nèi)是高度相關(guān)的基因呛伴。在有向網(wǎng)絡(luò)中勃痴，模塊內(nèi)是高度正相關(guān)的基因。把基因聚類成模塊后热康，可以對每個模塊進行三個層次的分析：1. 功能富集分析查看其功能特征是否與研究目的相符沛申；2. 模塊與性狀進行關(guān)聯(lián)分析，找出與關(guān)注性狀相關(guān)度最高的模塊姐军；3. 模塊與樣本進行關(guān)聯(lián)分析铁材，找到樣品特異高表達的模塊尖淘。（這個地方是分析的核心部分）

• Connectivity (連接度)：類似于網(wǎng)絡(luò)中 “度” (degree)的概念。每個基因的連接度是與其相連的基因的邊屬性之和著觉。

• Module eigengene E: 給定模型的第一主成分村生，代表整個模型的基因表達譜。這個是個很巧妙的梳理固惯，這個地方梆造，很好的用一個向量代替了一個矩陣，方便后期計算葬毫。

• Intramodular connectivity: 給定基因與給定模型內(nèi)其他基因的關(guān)聯(lián)度镇辉，判斷基因所屬關(guān)系。

• Module membership: 給定基因表達譜與給定模型的eigengene的相關(guān)性贴捡。

• Hub gene: 關(guān)鍵基因 (連接度最多或連接多個模塊的基因)忽肛。

• Adjacency matrix (鄰接矩陣)：基因和基因之間的加權(quán)相關(guān)性值構(gòu)成的矩陣。

• TOM (Topological overlap matrix)：把鄰接矩陣轉(zhuǎn)換為拓?fù)渲丿B矩陣烂斋，以降低噪音和假相關(guān)屹逛，獲得的新距離矩陣，這個信息可拿來構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)或繪制TOM圖汛骂。

基本分析流程

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1. 構(gòu)建基因共表達網(wǎng)絡(luò)：使用加權(quán)的表達相關(guān)性罕模。

2. 識別基因集：基于加權(quán)相關(guān)性，進行層級聚類分析帘瞭，并根據(jù)設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)切分聚類結(jié)果淑掌，獲得不同的基因模塊，用聚類樹的分枝和不同顏色表示蝶念。

3. 如果有表型信息抛腕，計算基因模塊與表型的相關(guān)性，鑒定性狀相關(guān)的模塊媒殉。

4. 研究模型之間的關(guān)系担敌，從系統(tǒng)層面查看不同模型的互作網(wǎng)絡(luò)。

5. 從關(guān)鍵模型中選擇感興趣的驅(qū)動基因廷蓉，或根據(jù)模型中已知基因的功能推測未知基因的功能全封。

6. 導(dǎo)出TOM矩陣，繪制相關(guān)性圖桃犬。

上面部分的介紹大家都應(yīng)該很熟悉了售貌，關(guān)鍵在于這個方法在10X單細(xì)胞和10X空間轉(zhuǎn)錄組上是如何運用的。我們首先來看10X單細(xì)胞的部分：

前面的部分很常規(guī)疫萤，都是在計算基因表達的一個相關(guān)性和基因模塊

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簡單說一下灰度模塊的基因颂跨，分析的時候我們?nèi)コ?/h4>

當(dāng)然，也可以做一下常規(guī)的下游分析

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圖片.png

主要的內(nèi)容點在于和10X單細(xì)胞數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)扯饶，當(dāng)然我們這里展示和cluster相關(guān)聯(lián)

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我們這里需要注意的是恒削，整合樣本做WGCNA分析池颈，分析得到的模塊主要和細(xì)胞類型有關(guān)聯(lián)，因為此時的cluster代表不同的細(xì)胞類型钓丰，此時做WGCNA感覺作用不大躯砰，因為不同的細(xì)胞類型本身就應(yīng)該有獨特的一套基因列表，那什么時候該用呢携丁？琢歇？

很簡單，當(dāng)我們在做同一細(xì)胞類型再分群的時候梦鉴，這個分析的用處就會很大李茫，因為得到的模塊與同一細(xì)胞類型不同的subcluster相關(guān)聯(lián)，得到的就是一些在各個亞群高度協(xié)調(diào)的模塊基因肥橙，這個時候把得到的模塊基因全部做下游分析魄宏，意義非常大，從另外一個側(cè)面表現(xiàn)了細(xì)胞類型內(nèi)部的異質(zhì)性存筏，如果是多樣本整合的關(guān)系（比如正常和疾渤杌ァ），同一細(xì)胞類型的不同樣本關(guān)聯(lián)得到的gene模塊列表椭坚，就可以得到處理組和對照組關(guān)聯(lián)度高的模塊列表予跌，新的角度來看待疾病的發(fā)生。

但是我個人最喜歡的是第三個角度善茎，就是馬上要講的這個匕得，我們在做分析的時候，同樣是多個樣本（正常和疾病兩組）巾表，同一細(xì)胞類型，我們先做正常組（或者疾病組）的WGCNA略吨，得到的基因模塊反映到疾病組（正常組）集币，這個時候就會看出來明顯的差異，本應(yīng)該高度關(guān)聯(lián)的模塊可能就消失了翠忠，這個高度關(guān)聯(lián)的模塊的功能也隨之產(chǎn)生了變化鞠苟；還有就是同一細(xì)胞類型，兩組樣本先分別做WGCNA秽之，得到的基因模塊進行平行對比当娱，那么得到的，就是對疾病發(fā)生新的認(rèn)識考榨，很重要跨细，注意留心~~~

WGCNA與10X空間轉(zhuǎn)錄組相關(guān)聯(lián)（更加重要）

關(guān)于10X空間轉(zhuǎn)錄組分析的重要性，已經(jīng)講了很多了河质，這里不再贅述冀惭，但是10X空間轉(zhuǎn)錄組做重要的分析點WGCNA卻鮮有提及震叙，為什么呢？更多還是對深入認(rèn)識的缺乏散休，做WGCNA可以讓我們得到一下認(rèn)識：

• 1媒楼、模塊的空間分布特點，既然是10X空間轉(zhuǎn)錄組戚丸，我們當(dāng)然是和空間位置相關(guān)聯(lián)划址，一些高度關(guān)聯(lián)的模塊在空間上的分布特點是要告訴我們什么呢？限府？夺颤？
  
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這個地方大家對比空間差異基因的分析方法，可參考文章10X空間轉(zhuǎn)錄組之基因的空間表達模式谣殊，這個地方價值極高拂共。

• 2、一樣的思路姻几，正常組的模塊的空間位置宜狐，在疾病組發(fā)生了怎么樣的變化呢？蛇捌？抚恒？
  
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  此時我們分開樣本做WGCNA，得到的模塊進行平行分析络拌，又會得到什么樣的結(jié)果呢俭驮？？春贸？大家不妨自己好好想一想混萝。

總之，核心部分還是模塊在不同樣本的差異萍恕，10X空間轉(zhuǎn)錄組就是空間分布的差異逸嘀，當(dāng)然，還有很多分析的組合允粤，在這里不可能一一敘述完全崭倘，大家要根據(jù)自己的實際情況，安排方案設(shè)計类垫，完成自己的分析目的司光。

生活很好，等你超越