前幾天的CVR (23.2.2)

活化的CD4+ T細(xì)胞介導(dǎo)自身免疫性心肌炎發(fā)病套媚，其中Th17細(xì)胞是最主要的致病細(xì)胞缚态。Th17細(xì)胞分泌例如IL-17A、IL-17F等細(xì)胞因子堤瘤，促進(jìn)病毒復(fù)制玫芦、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、抗心肌自身抗體分泌和心肌纖維化本辐。在T細(xì)胞受體被刺激后桥帆，幼稚的T細(xì)胞進(jìn)行糖酵解代謝重編程，促進(jìn)T細(xì)胞的激活慎皱、增殖老虫、分化和遷移。Th17細(xì)胞分化依賴糖酵解滿足其高能量和生物合成需求茫多，而Treg則優(yōu)先依賴氧化磷酸化和脂肪酸氧化祈匙。
磷酸甘油酸激酶1(PGK1)是糖酵解途徑中必不可少的酶，可催化磷酸基團(tuán)從1,3-BPG轉(zhuǎn)移到ADP天揖，以產(chǎn)生3-PG和ATP夺欲，是糖酵解途徑中第一個(gè)ATP生成步驟。過(guò)去報(bào)道PGK1通過(guò)介導(dǎo)糖酵解來(lái)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖今膊、遷移和侵襲些阅。然而，PGK1是否通過(guò)糖酵解調(diào)控CD4+ T細(xì)胞從而介導(dǎo)心肌炎的發(fā)病尚不清楚。

1. The expression of PGK1 is increased in T cells and Th17 cells during myocarditis

Fig 1A-C：作者對(duì)此前發(fā)表的自免心肌炎單細(xì)胞數(shù)據(jù)進(jìn)行重分析，發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞富集到了glycolytic process pathways图呢，且特異性的表達(dá)Aldoa, Eno1, Ldha, Pgk1, Tpi1等glycolytic genes。
Fig 1D-E：作者主要關(guān)注了PGK1 (磷酸甘油酸激酶1,the first ATP-producing enzyme in the glycolytic pathway)腰素，這個(gè)基因在Th17細(xì)胞中顯著比其他T細(xì)胞高，在EAM組織中也是高的雪营。
Fig 1F-G：對(duì)EAM小鼠和心肌炎患者心臟的免疫組化染色也顯示PGK1的高表達(dá)弓千。
Fig 1H-J：免疫熒光染色也提示PGK1和CD4及IL-17A存在共定位。

Fig 1

復(fù)習(xí)一下

2. PGK1 inhibition reduces the severity of EAM

為了明確PGK1在心肌炎中的作用献起，作者首先使用了PGK1抑制劑NG52 (100 mg/kg/day)干預(yù)小鼠洋访，在21天收取組織。結(jié)果顯示治療后小鼠心臟體重比下降谴餐，炎癥浸潤(rùn)情況和纖維化情況均減輕姻政，心功能也出現(xiàn)改善。

Fig 2

3. PGK1 inhibition regulated cardiac CD4+ T cells infiltration

PGK1抑制劑治療顯著降低了自免心肌炎小鼠心臟中的Cd4⁺ Th細(xì)胞和Il17A⁺ Th17細(xì)胞的比例岂嗓，對(duì)Foxp3⁺Treg細(xì)胞則影響不大汁展。
除此之外PGK1抑制劑治療組的Cd8⁺ T細(xì)胞、產(chǎn)IFN-γ 和 GZMB的Cd8⁺ T細(xì)胞以及促炎性Ly6C^highCD11b⁺單核細(xì)胞數(shù)量也下降（附件）

Fig 3

The above results suggest that NG52 reduced the infiltration of cardiac CD4+ T subsets and other immune cells, and suppressed the expression of pro-inflammatory cytokines.

4. PGK1 regulates CD4 T cell maturation and Th17 responses in the periphery

由于Cd4⁺ T細(xì)胞在外周血中（進(jìn)入心臟前）就成熟了，因此作者進(jìn)一步探究了NG52是否影響了外周血CD4⁺ T 和 Th17細(xì)胞的development食绿。
Fig 3D：NG52組外周血的CD4⁺Tn (CD44^-CD62L⁺)有增加的趨勢(shì)侈咕， 效應(yīng)CD4⁺T (CD44⁺CD62L^-) 則有下降趨勢(shì)（統(tǒng)計(jì)學(xué)無(wú)意義）
Fig 3E-F：NG52治療后，外周血Th17細(xì)胞下降器紧，Treg細(xì)胞上升耀销。
外周血Ly6C^highCD11b⁺單核細(xì)胞和 Ly6G⁺CD11b⁺中性粒細(xì)胞比例也下降（附件）。

Fig 3

This suggests that PGK1 inhibition prevents the maturation and development of CD4⁺ T cells, Th17 cells, and myeloid cells in the periphery, while promoting the formation of Treg cells.

5. PGK1 regulates CD4+ T cell activation and Th17 cell differentiation in vitro

為了探究PGK1對(duì)pathogenic CD4⁺ T細(xì)胞活化的直接作用铲汪，作者從EAM小鼠分離了CD4⁺ T細(xì)胞熊尉，給予了CD3/CD28抗體刺激，同時(shí)給了NG53治療掌腰。
Fig 4A-B：NG53治療顯著降低了CD4⁺ T細(xì)胞CD25的表達(dá)(A)帽揪，抑制了CD4⁺ T細(xì)胞的增殖(B)。提示PGK1 directly mediates the activation of pathogenic CD4⁺ T cells辅斟。

細(xì)胞增殖檢測(cè)：CSFE

Fig 4C：QPCR結(jié)果顯示PGK1治療后Th17相關(guān)基因如Il17a, Il17f, 和 Il23r表達(dá)顯著下降，提示PGK1可能更主要調(diào)控Th17反應(yīng)芦拿。

Fig 4D：為了進(jìn)一步探究PGK1對(duì)Th17分化的作用士飒，作者在Th17-polarizing cytokines存在的情況下對(duì)Tn細(xì)胞進(jìn)行了NG52干預(yù)，發(fā)現(xiàn)NG52干預(yù)下蔗崎，Tn細(xì)胞向Treg分化增加酵幕，向Th17分化減少。
Fig 5E：QPCR的結(jié)果也提示NG52干預(yù)降低了Th17相關(guān)基因如Il17a, Il17f 和 Il23r的表達(dá)缓苛，Il21, Il22 和 Csf2 則沒(méi)有顯著變化芳撒。
Fig 4F：在調(diào)控Th17分化發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子中，NG52干預(yù)特異性的影響了Rora和Ahr未桥。其他轉(zhuǎn)錄因子如Rorc, Batf, Irf4則未受影響笔刹。
此外，Treg分化相關(guān)基因出現(xiàn)上調(diào)冬耿，提示NG52可以影響Th17/Treg平衡舌菜。

腫瘤微環(huán)境中的Th17/Treg平衡

6. PGK1 regulates the glycolytic metabolism of Th17 cells

隨后作者想要去進(jìn)一步探究PGK1調(diào)控Th17細(xì)胞分化的機(jī)制。PGK1是糖酵解途徑的關(guān)鍵酶亦镶。糖酵解在Th17分化發(fā)育中起到重要作用日月，因此作者推測(cè)NG52可以通過(guò)limiting the engagement of glycolysis來(lái)調(diào)節(jié)Th17細(xì)胞分化。因此作者分析了NG52對(duì)Th17細(xì)胞glycolytic capacity的影響缤骨。
Fig 5A：fluorescent-glucose analogue uptake assay提示NG52治療的Th17細(xì)胞爱咬，葡萄糖攝取下降。
Fig 5B：QPCR的結(jié)果也顯示NG52顯著阻斷了多種 glycolytic genes 如Aldoa, Pkm, Pgk1, Lhda和Gapdh的表達(dá)绊起。
Fig 5C：Seahorse結(jié)果也顯示NG52顯著降低了Th17的糖酵解精拟，accompanied by a relative increase in the mitochondrial respiration ratio。

7. PGK1 regulates ROS generation in Th17 cells through PDHK1 phosphorylation

PGK1除了是糖酵解途徑的關(guān)鍵酶，還是PDHK1活化的激酶串前。它可以降低丙酮酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)瘫里，因此降低線粒體ROS產(chǎn)生。此前有研究顯示抑制PDHK1可以通過(guò)促進(jìn)ROS產(chǎn)生抑制Th17分化荡碾，因此作者推測(cè)PGK1的抑制可以增加ROS的累積谨读，過(guò)量的ROS可以抑制Th17的分化。
Fig 5D：首先作者探究了在Th17分化過(guò)程中PGK1是否可以磷酸化PDDHK1坛吁。免疫熒光顯示在Th17細(xì)胞中PGK1與PDHK1存在共定位劳殖。
Fig 5E：NG52治療降低了PDHK Thr338位點(diǎn)的磷酸化，而PDHK1蛋白表達(dá)則沒(méi)有受影響拨脉。p-PDHK1/PDHK1同樣降低哆姻。提示PGK1確實(shí)引起了PDHK1的磷酸化。
Fig 5F：隨后作者檢測(cè)了NG52對(duì)Th17細(xì)胞ROS水平的影響玫膀。DCFDA染色發(fā)現(xiàn)給予NG52治療的Th17細(xì)胞矛缨，ROS水平更高。MitoSOX染色（線粒體ROS指標(biāo)）也發(fā)現(xiàn)NG52治療提高了Th17線粒體ROS水平帖旨。
Fig 5G：最后作者同時(shí)給予了Th17細(xì)胞ROS scavenger NAC 和 NG52箕昭，發(fā)現(xiàn)NAC治療恢復(fù)了被NG52抑制的Th17分化。

8. PGK1 inhibition prevents progression of myocarditis to DCM

隨后作者探究了NG52治療是否可以阻斷心肌炎向擴(kuò)心病的進(jìn)展解阅。因此作者在EAM小鼠造模后給予NG52治療到day 21落竹，在day 42收小鼠。結(jié)果顯示小鼠心臟體重比下降货抄，纖維化減輕述召，心功能改善。

9. PGK1 regulates CD4+ T cell activation and Th17 cell differentiation in myocarditis patients

最后作者在患者樣本上做了一下驗(yàn)證蟹地。
作者首先分離了心肌炎患者外周血單個(gè)核細(xì)胞积暖。
Fig 7A, B：免疫熒光顯示PGK1與CD4和IL-17A共定位。
Fig 7C, D：隨后作者分離了心肌炎患者外周血CD4T細(xì)胞怪与。NG52治療降低了T細(xì)胞活化marker HLA-DR的表達(dá)呀酸。同時(shí)，細(xì)胞增殖也出現(xiàn)下降琼梆。
Fig 7E：最重要的是性誉，PGK1抑制在Th17 polarization conditions下依然阻斷了Th17分化。

Overall, these results suggest that the modulation of PGK1 might represent a valuable approach to limit CD4⁺ T and Th17 cells activation in myocarditis patients.

綜上所述茎杂，該研究發(fā)現(xiàn)错览，PGK1通過(guò)調(diào)節(jié)糖酵解和PDHK1-ROS軸來(lái)充當(dāng)Th17細(xì)胞分化的關(guān)鍵代謝調(diào)節(jié)劑，促進(jìn)心肌炎的炎癥浸潤(rùn)和心肌損傷煌往。該研究揭示了PGK1在心肌炎中的重要作用倾哺，為心肌炎的治療提供新的思路與潛在靶點(diǎn)轧邪。