Immune metabolism in PD-1 blockade-based cancer immunotherapy
Immunometabolism in the Single-Cell Era
A novel strategy for single-cell metabolicanalysis highlights dynamic changes in immune subpopulations
Spatial metabolomics of in situ, host-microbe interactions

scRNAplus||一個通俗的解釋
單細(xì)胞時代 || 細(xì)胞身份概念的演變
單細(xì)胞時代 || 網(wǎng)絡(luò)分析應(yīng)用進展，機遇與挑戰(zhàn)
單細(xì)胞時代 || 從眾病之王到希望之光
單細(xì)胞時代 || 宿主-微生物組相互作用

這不是最好的時代恒水，也不是最壞的時代，這里是單細(xì)胞時代脓恕。靈活的單細(xì)胞系統(tǒng)隶债，高效的組織解離液迅办，開源的數(shù)據(jù)分析工具蛔添，端到端的單細(xì)胞解決方案是未來發(fā)展的趨勢。這里最主要的是開放靈活的單細(xì)胞系統(tǒng)姻报，有了這個系統(tǒng)我們就可以自主地設(shè)計反應(yīng)體系坞琴，來從不同緯度捕獲單個細(xì)胞的信息。

我們知道逗抑，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析的下游往往聚焦在pathway上，其中寒亥，代謝通路是大家關(guān)注比較多的邮府。代謝也是聯(lián)系轉(zhuǎn)錄組與表型的關(guān)鍵。單細(xì)胞代謝組學(xué)期望的是考察單個細(xì)胞的代謝水平溉奕。我們知道褂傀，活細(xì)胞無時不在與外界進行著物質(zhì)和能量的交換，那么加勤，其代謝水平應(yīng)是其生命體征的主要表現(xiàn)仙辟。如果說單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組幫我們識別出細(xì)胞的身份，代謝組將反應(yīng)細(xì)胞的即時狀態(tài)鳄梅。單細(xì)胞代謝組學(xué)至少在通量和空代（空間代謝組）兩方面帶給我們新的見解叠国。今天，我們跟著Immunometabolism in the Single-Cell Era來看看單細(xì)胞代謝組的進展與希望戴尸。

目前研究已經(jīng)確定對免疫細(xì)胞的適當(dāng)調(diào)節(jié)粟焊，可以促使我們理解其代謝途徑以及它們紊亂時如何導(dǎo)致免疫功能紊亂和疾病發(fā)展。然而由于技術(shù)上的限制，這種見解嚴(yán)重束縛于免疫細(xì)胞的體外激活项棠，還是bulk水平的悲雳。但隨著單細(xì)胞應(yīng)用的出現(xiàn)，研究人員現(xiàn)在可以估計臨床樣本中單個免疫細(xì)胞的代謝狀態(tài)香追。

在這里合瓢，我們回顧這些單細(xì)胞技術(shù)和他們驗證免疫代謝的共同原則，同時也概述免疫細(xì)胞的代謝異質(zhì)性透典。我們討論當(dāng)前技術(shù)的局限性以及未來的機會晴楔，以推動該領(lǐng)域發(fā)展，當(dāng)然也希望該領(lǐng)域的發(fā)展能提高人類診斷和治療疾病的能力掷匠。

新陳代謝是所有生物過程的核心滥崩，它可以被廣泛地細(xì)分為合成代謝過程(使用能量和構(gòu)建塊進行生物合成)和分解代謝過程(為合成代謝提供原料，并產(chǎn)生能量為生物功能提供燃料)讹语。除了這些功能钙皮，代謝酶和中間體有重要的調(diào)節(jié)作用，是主要的控制細(xì)胞行為的小分子顽决。最近在免疫代謝領(lǐng)域的研究表明短条，在健康和疾病中，代謝程序和它們所支持的特定免疫功能之間有著密切的聯(lián)系才菠。這些核心代謝功能的失調(diào)與許多現(xiàn)代疾病有關(guān)茸时，包括癌癥和慢性炎癥性代謝疾病，如糖尿病赋访、肥胖可都、動脈粥樣硬化和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。然而蚓耽，由于疾病的復(fù)雜性和所涉及的細(xì)胞表型甚多渠牲，對于發(fā)生在致病環(huán)境中的免疫代謝重塑的詳細(xì)了解還很缺乏。

營養(yǎng)水平的改變/氧氣可用性/信號因子的存在以及與鄰近細(xì)胞的相互干擾步悠，都會誘導(dǎo)代謝變化签杈，使細(xì)胞在其特定的組織微環(huán)境中發(fā)揮作用。由于每個細(xì)胞都生活在一個獨特的環(huán)境中鼎兽，我們體內(nèi)沒有一個細(xì)胞在新陳代謝答姥、表型和功能上完全相同。在單細(xì)胞分辨率下谚咬，解決免疫代謝的時空異質(zhì)性和闡明這一復(fù)雜性將推動免疫代謝領(lǐng)域向前發(fā)展鹦付，允許轉(zhuǎn)換到臨床應(yīng)用和理解體內(nèi)免疫學(xué)的基礎(chǔ)。

事實上择卦，為了充分理解細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)免疫和疾病進展的機制睁壁，研究人員需要能夠解決免疫細(xì)胞代謝轉(zhuǎn)化為效應(yīng)表型的軌跡背苦。可以說潘明，單細(xì)胞圖譜技術(shù)具有解決上述所有問題的能力行剂，即使在目前的發(fā)展?fàn)顟B(tài)下也是如此。

從這個角度出發(fā)钳降，我們將探討當(dāng)前和新興的先進技術(shù)如何有助于我們理解免疫的代謝調(diào)節(jié)厚宰，并討論從bulk到單細(xì)胞免疫代謝譜分析的轉(zhuǎn)變。

常見的bulk代謝分析

• 細(xì)胞外通量分析 （Extracellular flux analyzers）

細(xì)胞外通量分析儀遂填，如海馬裝置（Seahorse apparatus）铲觉，實時記錄細(xì)胞外酸化率(ECAR)和耗氧率(OCR)作為代謝的關(guān)鍵讀數(shù)，并以此提供糖酵解和線粒體呼吸的間接測量吓坚。雖然使用特定的底物和抑制劑可以研究細(xì)胞對葡萄糖撵幽、谷氨酰胺或脂肪酸的相對偏好，但細(xì)胞外通量分析不能提供關(guān)于糖酵解和線粒體內(nèi)TCA循環(huán)以外代謝途徑活性的詳細(xì)信息礁击。事實上盐杂，這項技術(shù)允許簡單、快速地以96孔的方式對細(xì)胞進行分析哆窿，這極大地擴展了免疫代謝的研究視野链烈。

應(yīng)用該技術(shù)的發(fā)現(xiàn)包括炎性巨噬細(xì)胞的糖酵解開關(guān)和線粒體功能障礙，效應(yīng)T細(xì)胞和活化的樹突狀細(xì)胞(DCs)的糖酵解增加以及T記憶細(xì)胞和il -4活化的巨噬細(xì)胞的線粒體呼吸增高挚躯。值得注意的是强衡，ECAR是糖酵解的替代標(biāo)記，培養(yǎng)基酸化不一定是糖酵解增強的結(jié)果码荔。實際上線粒體呼吸二氧化碳的產(chǎn)生或細(xì)胞外TCA循環(huán)中間體(如琥珀酸鹽)的釋放也會使培養(yǎng)基酸化漩勤。這一局限性可以通過對糖酵解途徑進行靶向代謝組學(xué)或通量組學(xué)來克服。

• 穩(wěn)態(tài)代謝組學(xué)

對于一個給定的時間點缩搅，代謝組學(xué)通過液相或氣相色譜-質(zhì)譜(LC-MS或GC-MS)測量一系列代謝物的穩(wěn)態(tài)水平锯七。非靶向代謝組學(xué)測量生物樣本中的數(shù)百種代謝物，而靶向代謝組學(xué)則評估預(yù)先選擇的代謝物誉己，并產(chǎn)生具有更高靈敏度的數(shù)據(jù)，并允許對代謝物濃度進行精確的絕對定量域蜗。除了測量小的代謝物巨双，高分辨率MS-based profiling最近被應(yīng)用在“shotgun”脂質(zhì)體學(xué)中，分析不同活化的巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)體霉祸。大多數(shù)基于ms的方法仍然需要相對高水平的輸入通量(大約100,000s的細(xì)胞)筑累，然而最近的發(fā)展提供了一種以單細(xì)胞分辨率空間測量代謝物的方法。關(guān)于空間和單細(xì)胞代謝組學(xué)領(lǐng)域的最新發(fā)展的更深入的信息丝蹭，我們參考了對主要新興方法的綜述慢宗，包括基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)-質(zhì)譜成像和二次離子質(zhì)譜(SIMS)。將這種分析與本觀點中討論的單細(xì)胞方法相結(jié)合，必將有助于闡明在體內(nèi)復(fù)雜組織微環(huán)境中單細(xì)胞水平的免疫代謝镜沽。

• Fluxomics

通過給定途徑的通量改變不一定與該途徑內(nèi)代謝組學(xué)測定的特定時間點的代謝產(chǎn)物水平直接相關(guān)敏晤。通過靶向質(zhì)譜在連續(xù)時間點對底物和同位素同位素的測量，可以確定代謝通量和途徑動力學(xué)缅茉。代謝組學(xué)提供了某一特定時刻代謝物的“快照”嘴脾，而13C/15N的標(biāo)簽追蹤(或所謂的Fluxomics )可以被視為一種“快照”。在單細(xì)胞分辨率方面蔬墩，這種分析的使用仍處于起步階段译打，但在bulk方法中，如在Kibbey開發(fā)的質(zhì)量同位素多序數(shù)光譜分析(MIMOSA fluxomics)拇颅，群落可以很容易地用于量化特定代謝反應(yīng)的速率實驗室(Alves等奏司，2015)。

關(guān)鍵的免疫代謝概念

單細(xì)胞代謝譜分析方法中針對不同代謝蛋白提供了最低限度的免疫代謝背景樟插。關(guān)于免疫代謝的更多細(xì)節(jié)韵洋，我們參考了在不同的免疫細(xì)胞和疾病中關(guān)于這一主題的優(yōu)秀和更全面的評論。

• 糖酵解解析多種免疫效應(yīng)功能

免疫激活是一個需要能量的過程岸夯，通常伴隨著糖酵解通量的增加麻献。糖酵解開始于葡萄糖轉(zhuǎn)運體攝取葡萄糖(例如，GLUT1(在免疫細(xì)胞中占主導(dǎo)地位)和隨后在細(xì)胞質(zhì)中加工產(chǎn)生丙酮酸猜扮，生成ATP勉吻，并在此過程中將NAD+還原為NADH）。Elegant的研究強調(diào)了糖酵解酶己糖激酶1和2 (HK1和HK2)旅赢、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)齿桃、烯醇化酶和丙酮酸激酶同工酶M2 (PKM2)。為了在沒有線粒體氧化磷酸化(OXPHOS)的情況下維持糖酵解通量煮盼，細(xì)胞可以通過乳酸脫氫酶將丙酮酸還原為乳酸(LDH)回收NADH為NAD+短纵。

在Seahorse 分析中，當(dāng)質(zhì)子和糖酵解衍生的乳酸通過單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白MCT1從細(xì)胞中輸出時僵控，這種發(fā)酵反應(yīng)可以被稱為ECAR香到。而糖酵解在炎癥免疫效應(yīng)細(xì)胞中最為顯著(Krawczyk等，2010;(Michalek等报破，2011)悠就，它對多種免疫激活模式至關(guān)重要，包括替代巨噬細(xì)胞激活和T調(diào)節(jié)性(Treg)細(xì)胞的誘導(dǎo)充易，而且糖酵解率在B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞之間存在差異梗脾。然而，在巨噬細(xì)胞促炎活化過程中盹靴，TCA周期通過下調(diào)IDH和SDH活性而被顯著重構(gòu)(Jha et al.炸茧， 2015)瑞妇。后者是通過激活的髓細(xì)胞中ACOD1/IRG1特異性產(chǎn)生的免疫調(diào)節(jié)代謝物itaconate直接抑制而實現(xiàn)的。

• 脂肪酸代謝影響免疫細(xì)胞表型和功能

脂肪酸氧化(FAO)是一種分解代謝途徑梭冠，將脂肪酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶a辕狰、NADH和FADH2等產(chǎn)物，用于線粒體產(chǎn)生能量妈嘹。肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1和2 (CPT1和CPT2)將長鏈脂肪酸穿梭到線粒體基質(zhì)中柳琢，隨后通過羥酰基輔酶a氧化為乙酰輔酶a圖1所示润脸。免疫細(xì)胞亞型的關(guān)鍵代謝途徑(A)是調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞重要的代謝途徑柬脸，包括最近單細(xì)胞分析方法中使用的代謝靶點。cpt1抑制劑依托莫西的濃度過高表明了這一點FAO在il -4誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞毙驯、記憶T細(xì)胞和treg中尤為重要倒堕。然而，最近對CPT1和CPT2使用細(xì)胞特異性基因敲除的文獻報道爆价，F(xiàn)AO在這些過程中很少垦巴。

與FAO相反，F(xiàn)AS是一種合成代謝途徑铭段，將胞質(zhì)乙酰輔酶a轉(zhuǎn)化為脂質(zhì)骤宣。乙酰輔酶a羧化酶(ACC)首先將乙酰輔酶a羧化為丙二酰輔酶a，然后被脂肪酸合酶(FASN)拉長序愚。FAS支持效應(yīng)T細(xì)胞的增殖憔披，是配置巨噬細(xì)胞炎癥信號的質(zhì)膜的關(guān)鍵，也是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成使活化的DCs分泌細(xì)胞因子的關(guān)鍵爸吮。

• 不同的免疫細(xì)胞有著不同的氨基酸代謝途徑

T細(xì)胞的免疫激活與氨基酸代謝需求的增加有關(guān)芬膝，例如l型氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白1 (LAT1、CD98和SLC7A5)的重要性以及TCR參與后成功信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的絲氨酸途徑形娇。此外锰霜，氨基酸在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的特定方向方面發(fā)揮作用。例如桐早，兩個Th1和Th17細(xì)胞通過轉(zhuǎn)運蛋白ASCT2增加谷氨酰胺用量癣缅，以應(yīng)對抗原受體的刺激，而抗炎treg不受谷氨酰胺供應(yīng)改變的影響哄酝。谷氨酰胺酶(GLS)將谷氨酰胺轉(zhuǎn)化為谷氨酸為TCA循環(huán)提供燃料友存，該途徑促進Th17分化，同時降低Th1和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞分化炫七。

在巨噬細(xì)胞中，氨基酸也發(fā)揮著重要的功能和調(diào)節(jié)作用钾唬。谷氨酰胺代謝與抗炎極化程序有關(guān)万哪，絲氨酸代謝與IL-1b的產(chǎn)生調(diào)節(jié)有關(guān)侠驯。此外，氨基酸還可用于巨噬細(xì)胞產(chǎn)生效應(yīng)分子奕巍。LPS(+IFNg)誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞主要通過誘導(dǎo)NO合成酶(iNOS)將精氨酸轉(zhuǎn)化為一氧化氮(NO)吟策，而il -4誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞主要將精氨酸代謝為鳥氨酸和多胺。要了解更多關(guān)于氨基酸如何調(diào)節(jié)免疫的信息的止，我們參考了最近關(guān)于這個主題的一篇優(yōu)秀的綜述(Kelly和Pearce, 2020)檩坚。

重要的是，迄今為止所描述的大多數(shù)概念都是從體外培養(yǎng)和激活的免疫細(xì)胞的bulk測量中得出的诅福。如下所述匾委，技術(shù)上的限制很大程度上阻礙了現(xiàn)行方法在體內(nèi)的驗證。接下來氓润，我們描述了解決這些關(guān)鍵問題的單細(xì)胞方法赂乐，以推動免疫代謝領(lǐng)域到下一個水平。

當(dāng)前方法的局限性

• 需要從體外到體內(nèi)驗證

鑒于環(huán)境因素的重要性咖气，實驗室細(xì)胞培養(yǎng)的免疫細(xì)胞代謝明顯不同于體內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)挨措。事實上，Ma等人最近在小鼠中使用13c -葡萄糖輸注的方法研究了CD8+ T細(xì)胞對李斯特菌感染的代謝崩溪，并觀察到體內(nèi)活化T細(xì)胞的代謝情況有根本不同浅役。在vito激活的T細(xì)胞中，CD8+ T細(xì)胞從OXPHOS向糖酵解轉(zhuǎn)變伶唯，而在體內(nèi)激活的CD8+ T細(xì)胞顯示更高的氧化代謝率和依賴葡萄糖依賴性絲氨酸的生物合成觉既。這項工作中開發(fā)的方法需要精細(xì)的實驗操作，而且不容易擴展或適用于人類樣本抵怎。由于動物模型有其自身的局限性奋救，而且并不總是能夠復(fù)制人類免疫學(xué)和生物學(xué)特征，因此這種在人體環(huán)境中的轉(zhuǎn)換是很重要的反惕。

一般來說尝艘，利用這些和其他技術(shù)進一步發(fā)展體內(nèi)(或體外)細(xì)胞代謝評估在該領(lǐng)域具有先導(dǎo)作用。同時姿染，體內(nèi)免疫代謝研究的關(guān)鍵概念的驗證背亥，特別是在人體內(nèi)需要代謝譜的替代選擇。

• 免疫代謝的時空特征

免疫細(xì)胞非常依賴營養(yǎng)物質(zhì)的及時供應(yīng)悬赏，而營養(yǎng)物質(zhì)的及時供應(yīng)取決于細(xì)胞在腫瘤或炎癥部位微環(huán)境中的位置狡汉。分類和bulk測量不可避免地抹平了細(xì)胞種群的分布差異，這掩蓋了時間和環(huán)境的影響闽颇。因此盾戴，了解細(xì)胞在單細(xì)胞分辨率下的代謝狀態(tài)，可以解釋其在體內(nèi)復(fù)雜組織微環(huán)境中表型異質(zhì)性的分子機制兵多。這可能有助于理解它們功能背后的原因尖啡，或者它們在病理環(huán)境下無法正常工作的原因橄仆。大多數(shù)最新的轉(zhuǎn)錄和成像技術(shù)可以解決單個細(xì)胞甚至代謝物的空間排列問題，它們的進一步發(fā)展將對進一步理解人類樣本和體內(nèi)環(huán)境中的免疫代謝重構(gòu)至關(guān)重要衅斩。

時間是免疫代謝領(lǐng)域經(jīng)常被忽視的另一個方面盆顾。我們知道，大多數(shù)免疫細(xì)胞在激活后糖酵解迅速增加畏梆，這最終導(dǎo)致代謝通量增加您宪，并在其效應(yīng)狀態(tài)下大量特定代謝物(通常在24小時后)。然而奠涌，這是如何隨著時間的推移發(fā)生的宪巨，它是如何支持效應(yīng)表型的獲得和疾病的發(fā)展的？這些問題都還沒有具體的答案铣猩。解決免疫細(xì)胞通過代謝轉(zhuǎn)化為效應(yīng)表型的動力學(xué)問題揖铜，對于確定哪些事件是原因，哪些事件是果至關(guān)重要达皿√煜牛總之，理解免疫代謝的時空異質(zhì)性不僅將徹底改變我們的基礎(chǔ)生物學(xué)知識峦椰，而且也有助于合理設(shè)計新的治療方法龄寞。

• 通量的限制

免疫代謝研究中，常用分析技術(shù)（bulk）的局限性至少可以部分地解釋我們面臨的在體外到體內(nèi)的轉(zhuǎn)化和從老鼠到人的驗證的困難汤功。代謝組學(xué)和細(xì)胞外通量分析的一個主要警告是需要相對高的細(xì)胞數(shù)量物邑，而這在人類臨床樣本中通常不存在。例如滔金，Seahorse XF分析儀測量每孔中數(shù)萬到數(shù)十萬個細(xì)胞的細(xì)胞外通量色解，通常需要4-5個復(fù)制孔。對于代謝組學(xué)餐茵，研究人員通常測量每個復(fù)制的50萬個混合細(xì)胞科阎，即使有這么高的輸入，代謝的覆蓋范圍也是有限的忿族，因為我們通常測量細(xì)胞中估計存在的數(shù)千個代謝物中的幾百個锣笨。細(xì)胞外通量分析和傳統(tǒng)代謝組學(xué)的另一個缺點是，它們評估的代謝特征不是很穩(wěn)定道批。因此错英，獲得的結(jié)果可以受到長時間和苛刻的組織消化和熒光激活的細(xì)胞分選儀的影響。因此隆豹，需要新的代謝譜分析方法以及新的椭岩、優(yōu)化的細(xì)胞分離方法來測量體外少量免疫細(xì)胞的穩(wěn)定代謝特征。

間接評估細(xì)胞代謝水平

代謝組學(xué)與其他“在處理過程中更穩(wěn)定的組學(xué)數(shù)據(jù)(如轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué))”相結(jié)合，至少可以部分克服代謝物水平的不穩(wěn)定性判哥。代謝通量可以看作是代謝物水平和代謝它們的酶的存在和活性的結(jié)果氮唯。基因表達分析和蛋白質(zhì)組學(xué)已經(jīng)可以為代謝途徑的調(diào)控提供一些見解姨伟，但當(dāng)與代謝組學(xué)數(shù)據(jù)整合時，就變得特別強大豆励。利用網(wǎng)絡(luò)整合的方法夺荒，Jha等人確定了TCA周期中支持炎癥巨噬細(xì)胞反應(yīng)的一個重要代謝停滯。Baardman等人也結(jié)合代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)證明含脂巨噬細(xì)胞中良蒸，PPP與炎癥反應(yīng)的降低有關(guān)技扼。同樣，蛋白組學(xué)和代謝組學(xué)的整合揭示了T細(xì)胞活化的代謝需求嫩痰。這些獨特的“組學(xué)”方法剿吻，特別是當(dāng)整合時，可以揭示調(diào)節(jié)代謝樞紐串纺，可以使用基因工具或藥理學(xué)化合物進行功能分析丽旅。

目前單細(xì)胞代謝組學(xué)的大規(guī)模應(yīng)用還為時過早，因此免疫代謝研究進入單細(xì)胞時代需要替代方法纺棺。先前使用bulk轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)描述細(xì)胞代謝的成功表明榄笙，使用相關(guān)的單細(xì)胞組學(xué)方法是目前的發(fā)展方向。為此祷蝌，最新的單細(xì)胞RNA測序(scRNA-seq)和基于細(xì)胞的方法在單細(xì)胞分辨率繪制代謝景觀將在本文的下一部分討論茅撞。

基于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析細(xì)胞代謝

隨著scRNA-seq的出現(xiàn)，人們可以在復(fù)雜的多細(xì)胞生態(tài)系統(tǒng)中解析單個細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄譜巨朦，這在免疫學(xué)中是非常重要的米丘。如今使用 10x Genomics，scRNA-seq實驗每樣本多達1萬個細(xì)胞糊啡，常規(guī)檢測每個細(xì)胞2到4千個基因拄查。即使在免疫學(xué)背景下直接檢查scRNA-seq數(shù)據(jù)，也可以很好地說明發(fā)生在體內(nèi)的關(guān)鍵代謝過程悔橄。例如靶累，我們可以使用免疫檢查點封鎖抗體(ICB)、抗pd -1/抗ctla -4抗體或?qū)φ湛贵w癣疟。在本系統(tǒng)中反璃，ICB治療導(dǎo)致腫瘤排斥反應(yīng)慌闭，與免疫室的整體激活和髓系室內(nèi)活化細(xì)胞的出現(xiàn)。如圖2A和2B所示，我們創(chuàng)建了這個scRNA-seq數(shù)據(jù)集的可視化信息忘古，以演示免疫細(xì)胞亞群中一些關(guān)鍵代謝基因的行為，值得注意的是:

• 與糖酵解活性增加相關(guān)的基因像Glut1在ICB處理后的活化巨噬細(xì)胞中富集。
• Nos2是炎癥巨噬細(xì)胞活化的代謝基因，在ICB治療條件下特異性的巨噬細(xì)胞中富集勃教。
• Phgdh的表達與Mki67高增殖T細(xì)胞的表達相關(guān)，這與描述絲氨酸代謝在T細(xì)胞增殖中的作用的體內(nèi)外bulk分析一致匠抗。
• NRF2轉(zhuǎn)錄本(Nfe2l2)是氧化應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵因素故源，相對于T細(xì)胞，巨噬細(xì)胞中NRF2轉(zhuǎn)錄本(Nfe2l2)的水平通常富集汞贸，且似乎不依賴于治療條件绳军。然而，其直接靶點如Hmox1在炎性巨噬細(xì)胞亞群中確實增加矢腻，這與NO和itaconate潛在的氧化/親電應(yīng)激相一致门驾。總之多柑，這與NRF2主要在蛋白水平上受到調(diào)控的事實一致(Taguchi等人奶是，2011)，并強調(diào)了對這一關(guān)鍵的代謝調(diào)節(jié)因子竣灌，需要分析蛋白而不是基因表達聂沙。

直接檢測scRNA-seq數(shù)據(jù)中特定關(guān)鍵代謝基因的類似方法被證明在描述果蠅眼睛發(fā)育過程中細(xì)胞凋亡的代謝方面是有效的〕踵冢總之逐纬，這些例子說明了在研究新陳代謝方面scRNA-seq數(shù)據(jù)的潛在用途。然而削樊，在單細(xì)胞分辨率下全面繪制代謝全景的方法仍然相對缺乏豁生，并且/或處于發(fā)展的早期階段。大多數(shù)對scRNA-seq數(shù)據(jù)進行代謝分析的方法來自bulk RNAseq分析技術(shù)漫贞，在進行這一轉(zhuǎn)變時必須克服相當(dāng)大的挑戰(zhàn)甸箱。

事實上，bulk的轉(zhuǎn)錄分析提供了一個吸引人的數(shù)據(jù)迅脐，因為它產(chǎn)生關(guān)于轉(zhuǎn)錄水平在序列細(xì)胞內(nèi)的詳盡信息芍殖。因此，沒有信號通常意味著沒有相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄谴蔑。這與代謝組學(xué)分析相反豌骏，在代謝組學(xué)分析中，由于技術(shù)限制隐锭，而不是由于代謝物本身的缺乏窃躲，覆蓋范圍有限，信號缺失經(jīng)常出現(xiàn)钦睡。然而蒂窒，這種轉(zhuǎn)錄譜分析的優(yōu)勢在scRNA-seq數(shù)據(jù)中并不明顯。由于通常較低的測序深度和drop-out事件，個別基因在某些細(xì)胞中的表達水平可能出現(xiàn)零洒琢，即使這些基因?qū)嶋H上是表達的秧秉。典型的測序深度是每個細(xì)胞25000 - 50000個reads，這樣每個細(xì)胞就能準(zhǔn)確地檢測到3000 - 4000個基因衰抑。淺測序(即每個細(xì)胞1000個基因的順序)可能會檢測到大多數(shù)常見基因和家養(yǎng)基因象迎，而只有很少的亞種群特異性基因，這將導(dǎo)致在將數(shù)據(jù)與其他已發(fā)表的簽名進行比較時出現(xiàn)重大困難呛踊。然而挖帘，即使每個細(xì)胞檢測到3000 - 4000個基因，也遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于估計的12000 恋技。根據(jù)bulk RNA-seq數(shù)據(jù)，15000個基因在純化細(xì)胞群中表達逻族。在這些情況下蜻底，技術(shù)，如數(shù)據(jù)估計必須用于后處理數(shù)據(jù)和獲得平滑的轉(zhuǎn)錄概況聘鳞。例如薄辅，與T細(xì)胞或巨噬細(xì)胞相比，中性粒細(xì)胞中通常檢測到較少的總轉(zhuǎn)錄本抠璃。因此站楚，在比較不同細(xì)胞間的途徑時需要謹(jǐn)慎，因為某些簇的覆蓋率較低可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果搏嗡。大多數(shù)用于scRNA-seq數(shù)據(jù)的代謝分析方法可以大致分為兩大類窿春，簡要描述如下:

• (1)基于通路富集的分析
• (2)基于通量平衡分析(Flux Balance Analysis，F(xiàn)BA)的方法采盒。

• 基于通路富集的分析

構(gòu)成不同代謝途徑的基因被很好地注釋(Kanehisa和Goto, 2000)旧乞，并且可以使用標(biāo)準(zhǔn)的生物信息學(xué)途徑富集技術(shù)直接對基因集進行研究。這種簡單而強大的方法可以揭示新的生物學(xué)洞見磅氨。例如尺栖，根據(jù)對已發(fā)表的大量RNA-seq數(shù)據(jù)中該通路轉(zhuǎn)錄富集的初步觀察，研究了T細(xì)胞中絲氨酸代謝的作用烦租。如圖2所示延赌，在scRNA-seq數(shù)據(jù)中，該通路在增殖的T細(xì)胞簇中富集叉橱。最近挫以，Xiao等人展示了如何調(diào)整途徑富集管道進行scRNA-seq數(shù)據(jù)分析，并利用其表征腫瘤微環(huán)境內(nèi)的代謝多樣性窃祝。使用類似的分析策略屡贺，Miragaia等人(2019)強調(diào)了在不同組織中treg的代謝異質(zhì)。

• Flux Balance Analysis-Based Approaches

FBA是一種計算系統(tǒng)中代謝通量穩(wěn)態(tài)分布的方法，該系統(tǒng)將滿足給定網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的輸入和輸出通量的約束甩栈。簡單地說泻仙，F(xiàn)BA將細(xì)胞內(nèi)的代謝布線視為一個輸入輸出水龍頭數(shù)量有限的管道系統(tǒng)，要求系統(tǒng)的每個節(jié)點都建立穩(wěn)態(tài)平衡量没。換句話說玉转，進入每個反應(yīng)的代謝流量應(yīng)該等于離開那個反應(yīng)的代謝流量。因此殴蹄，單個酶的特異性表達水平并不直接參與建模究抓，透視圖的結(jié)果主要依賴于網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和模型的輸入和輸出。輸入通常是最常見的底物攝取反應(yīng)(例如袭灯，葡萄糖刺下，谷氨酰胺)，輸出(通常稱為目標(biāo)函數(shù))與被研究的特定細(xì)胞行為相關(guān)稽荧。例如橘茉，一個目標(biāo)可以是最大限度的生產(chǎn)生物量生長細(xì)胞或生產(chǎn)某些代謝物，如
活化巨噬細(xì)胞的NO姨丈。

基于FBA的方法的一個重要優(yōu)勢是畅卓，它們依賴于網(wǎng)絡(luò)分析，而不與預(yù)先定義的通路知識相關(guān)聯(lián)蟋恬，因此可以揭示新的生物學(xué)概念翁潘。因此，它提供了一個強大的工具歼争，以了解隨著網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的變化而發(fā)生的代謝通量變化拜马，例如，由于基因敲除或組織特異性表達模式沐绒。事實上一膨，Zhang等人已經(jīng)演示了使用FBA-base方法對不同組織中的NAD+生物合成進行基于scrna -seq的分析。從概念上講洒沦，這項工作遵循了基于來自不同組織的bulk RNA-seq數(shù)據(jù)研究組織特異性代謝的方法豹绪。除了觀察明顯不同的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)洌現(xiàn)BA框架允許研究在相同網(wǎng)絡(luò)內(nèi)的代謝重塑申眼，但在刺激誘導(dǎo)所需細(xì)胞輸出量變化的基礎(chǔ)上瞒津。這是可行的，當(dāng)至少一些關(guān)鍵的代謝特征是已知的時候括尸。此前巷蚪，大量數(shù)據(jù)采用這種方法揭示了itaconate作為SDH抑制劑的作用(Lampropoulou等，2016)濒翻。最近屁柏，該方法被引入到scRNA-seq數(shù)據(jù)中啦膜，以研究致病性/非致病性Th17細(xì)胞的代謝差異，以及與Tregs的差異淌喻。

In Silico Modeling of Metabolic State in Single Th17 Cells Reveals Novel Regulators of Inflammation and Autoimmunity

需要注意的是僧家，當(dāng)前方法通常關(guān)注兩種不同細(xì)胞群之間的差異。在這些情況下裸删，更直接的方法是簡單地執(zhí)行兩個種群之間的差異表達分析八拱，并執(zhí)行通路富集分析或代謝子網(wǎng)絡(luò)分析。我們認(rèn)為涯塔，這是至關(guān)重要的肌稻，過去的一對一比較已知細(xì)胞類型，并學(xué)習(xí)捕獲整個數(shù)據(jù)集內(nèi)的代謝多樣性匕荸。因此爹谭，下一代代謝scRNAseq分析方法有望揭示獨立于細(xì)胞身份分配的主要代謝變異。雖然目前在所有代謝基因的空間中簡單地進行這種聚類或使用注釋的代謝途徑作為主要成分是可行的榛搔，但最強大的聚類方法將在沒有單個途徑先驗知識的情況下結(jié)合基于網(wǎng)絡(luò)的分析依然是困難的诺凡。 這將允許將單個細(xì)胞作為不同的代謝實體，并將從新陳代謝的角度提供對整個細(xì)胞生態(tài)系統(tǒng)的不偏不倚的觀點药薯。

基于蛋白質(zhì)的單細(xì)胞代謝分析

• 利用Mass - Cytometry分析單細(xì)胞代謝

單個細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)仍處在起步階段(Slavov, 2020)，尚未應(yīng)用于immunometabolism研究,最近的文獻展示了使用大規(guī)模血細(xì)胞計數(shù)(飛cytometry by time of flight,CyTOF)估計單個細(xì)胞內(nèi)酶的代謝救斑。這種技術(shù)允許同時量化1- 40個參數(shù)在單細(xì)胞分辨率下童本。在免疫代謝的背景下，應(yīng)該考慮包括針對主要代謝的抗體脸候。不出意料穷娱，由三個不同的研究小組獨立設(shè)計的代謝小組顯示出相當(dāng)大的重復(fù)。

為了設(shè)計免疫代謝細(xì)胞panel运沦，Hartmann等首先篩選了超過100個商業(yè)抗體針對廣泛的代謝因素泵额，并選擇了41個代謝抗體，通過所有生物控制携添，并在人類白細(xì)胞的概念驗證研究中產(chǎn)生了穩(wěn)健的可重復(fù)的結(jié)果嫁盲。根據(jù)譜系標(biāo)記表達模式識別出不同的免疫細(xì)胞亞群后，無需預(yù)先分類就可以估計和比較所有免疫細(xì)胞亞群的代謝狀態(tài)烈掠。通過mass cytometry獲得的代謝狀態(tài)圖譜與它們在特異性免疫功能中所描述的角色一致羞秤，例如漿細(xì)胞樣dc中與葡萄糖和脂肪酸代謝相關(guān)的靶點高表達，以及中性粒細(xì)胞中高水平的限制率的PPP酶G6PD左敌。此外瘾蛋，哈特曼等人已經(jīng)證明了海馬測量的T細(xì)胞代謝變化與單細(xì)胞蛋白水平上觀察到的變化之間高度一致。這強調(diào)了基于細(xì)胞的單細(xì)胞代謝譜是一個強大的工具矫限。

Single-cell metabolic profiling of human cytotoxic T cells

• CyTOF在臨床中的應(yīng)用（代謝方向）

Hartmann等人(2020)通過比較結(jié)直腸癌患者的腫瘤和健康鄰近組織哺哼，以及健康供體外周血單核細(xì)胞和淋巴結(jié)佩抹，發(fā)現(xiàn)了富含腫瘤相關(guān)CD8+ T細(xì)胞的特定代謝表型。這些細(xì)胞表現(xiàn)出大的中性氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白1 (LAT1取董，CD98)和多種酶在不同代謝途徑上的表達降低棍苹。這些所謂的metalow細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的T細(xì)胞衰竭跡象，包括PD1和CD39表達增加甲葬，線粒體容量減少廊勃，TCF1水平低。值得注意的是经窖，一小部分metalow亞群不表達PD1或CD39坡垫，這表明結(jié)合代謝和免疫細(xì)胞標(biāo)記提供了額外的維度，在表型和功能上定義與人類疾病相關(guān)的腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞画侣。

• 使用基于細(xì)胞的代謝譜的動物模型研究

除了人體樣本冰悠，代謝細(xì)胞板也可以用于解剖動物體內(nèi)的代謝重塑。Levine等人利用單核增生李斯特菌感染期間T細(xì)胞反應(yīng)的基于細(xì)胞的代謝譜作為CD8 T細(xì)胞分化的良好模型配乱。這里主要是基于早期的bulk代謝和之前的文獻溉卓，因此，獲得的mass cytometry數(shù)據(jù)很好地概括了該領(lǐng)域的概念搬泥。事實上桑寨，效應(yīng)T細(xì)胞顯示了預(yù)期的糖酵解活性的增加(Michalek)
CyTOF分析中GLUT1和GAPDH的誘導(dǎo)也證明了這一點，海馬分析中增加的ECAR同樣證實了這一點忿檩。相反尉尾，記憶T細(xì)胞表現(xiàn)出CPT1a的誘導(dǎo)，CPT1a在FAO中起關(guān)鍵作用燥透，之前認(rèn)為與CD8記憶T細(xì)胞相關(guān)沙咏。這種代謝重組是以一種循序漸進的方式發(fā)生的，可以在單細(xì)胞分辨率下隨時間推移而進行班套。這種代謝變化包括激活后早期的均勻糖酵解轉(zhuǎn)換肢藐，激活2天后GAPDH的異質(zhì)表達。這兩個GAPDH群體表現(xiàn)出功能上的差異吱韭，這在bulk的方法中是無法發(fā)現(xiàn)的吆豹。

此外，該方法還發(fā)現(xiàn)了一個過渡的效應(yīng)T細(xì)胞池理盆，僅使用針對譜系標(biāo)記和T細(xì)胞亞群的普通抗體無法檢測到瞻讽。這個新發(fā)現(xiàn)的亞群在感染后4天出現(xiàn)，具有高度增殖能力熏挎，糖酵解和線粒體氧化標(biāo)記物均被強烈誘導(dǎo)表達速勇，并分別受到CTP1a和CD98表達的脂肪酸和氨基酸的刺激。通過CyTOF檢測到這一未知的過渡細(xì)胞子集后坎拐，作者接下來將這些細(xì)胞分類為CD62Llo CD44hi CD25hi烦磁，通過胞外通量分析證實其糖酵解和氧化代謝的增加养匈。這是一個很好的例子，說明單細(xì)胞技術(shù)如何提供新的見解以及如何利用已建立的bilk分析來驗證這些新發(fā)現(xiàn)都伪。

• Met-Flow:通過Flow進行單細(xì)胞代謝分析

使用熒光標(biāo)記的抗體代替重金屬偶聯(lián)抗體呕乎，“常規(guī)”流式細(xì)胞術(shù)也可以進行單細(xì)胞代謝分析(有一些優(yōu)點和缺點;見后)≡删В基于流式細(xì)胞術(shù)的方法稱為Met-Flow猬仁，使用10個氟鉻偶聯(lián)抗體靶向不同代謝途徑中的限速酶和關(guān)鍵蛋白，結(jié)合表型標(biāo)記生成27色流式細(xì)胞術(shù)面panel先誉，以查詢免疫細(xì)胞的代謝狀態(tài)湿刽。作者使用了BD公司的X30 FACSymphony流式細(xì)胞儀。利用10個代謝標(biāo)記的表達譜褐耳，Ahl等人可以聚類和分離血液白細(xì)胞亞群到不同的代謝诈闺。類似于Hartmann等人的CyTOF分析，CD4+和CD8+T細(xì)胞亞群不能單獨在代謝蛋白上分離铃芦，但大多數(shù)其他免疫細(xì)胞亞群都能非常有效地單獨基于它們的代謝概況來定義雅镊。這表明，使用與特異性免疫效應(yīng)功能相結(jié)合的關(guān)鍵代謝酶抗體來擴展傳統(tǒng)的流式細(xì)胞儀面板可能更有益刃滓，而不是染色額外的免疫細(xì)胞表面標(biāo)記仁烹，因為其實際功能通常未知。即使使用相對較小的細(xì)胞檢測面板咧虎，包括一些代謝性抗體卓缰，進一步解剖免疫細(xì)胞的表型、功能和代謝老客，使用幾乎在每個研究所都存在的設(shè)備僚饭，也可能是非常有用的震叮。這也支持了波茲南斯基和阿什卡爾的觀點胧砰，他們之前提出的問題:

‘If an NK Cell Cannot be Defined by How It Looks, Could
It be Defined by How It Is Fueled

獨特的代謝指紋，而不是表型苇瓣，表征NK細(xì)胞的功能命運：

值得注意的是尉间，Met-Flow僅用10種代謝蛋白鑒定了血液白細(xì)胞亞群，其分辨率與500個基因的scRNA-seq分析相當(dāng)击罪，而單獨分析相同的10個基因的表達不能區(qū)分免疫人群的差異哲嘲。此外，Met-Flow證實了在T細(xì)胞激活時糖酵解媳禁、OXPHOS和FAS的上調(diào)眠副，并且這種代謝重組被大量細(xì)胞外通量分析證實。后續(xù)的單細(xì)胞Met-Flow分析表明竣稽，大多數(shù)細(xì)胞依賴葡萄糖來進行代謝轉(zhuǎn)換囱怕，但也發(fā)現(xiàn)有一部分CD4中央記憶細(xì)胞使用替代代謝途徑霍弹。因此，單細(xì)胞(而bulk)的代謝譜能夠識別單個T細(xì)胞亞群的特定代謝特征和需求娃弓。

單細(xì)胞代謝組技術(shù)的優(yōu)點和缺點

• 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組與Cytometry

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)和多顏色細(xì)胞計數(shù)術(shù)在獲取信息和建立分析所需的實驗裝置方面是互補的方法典格。因此，它們可以同時用于獲得最大的分辨率台丛，但同時耍缴，任何一種方法都可以更容易獲得或提供更多信息。在這里挽霉，我們描述了選擇最優(yōu)方法的一些基本考慮事項防嗡。

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組通常每個細(xì)胞捕獲3000-5000個基因。這允許無偏見的聚類數(shù)據(jù)和潛在的識別新的亞種群炼吴。從新陳代謝的角度來看本鸣，它允許跨許多途徑同時檢測多個基因，因此產(chǎn)生新陳代謝變化的全局圖硅蹦。另一方面荣德，cytometry 一次只能做0-40個蛋白，因此童芹，利用流式細(xì)胞術(shù)方法設(shè)計抗體panel需要合理的設(shè)計涮瞻。

與此同時，兩種方法所描繪的典型細(xì)胞數(shù)量是非常不同的假褪，因為目前scRNA-seq每個樣本只能處理約10,000個細(xì)胞署咽，而流式細(xì)胞術(shù)可以常規(guī)處理數(shù)百萬個細(xì)胞，如果需要生音，可以隨時擴大規(guī)模宁否。當(dāng)需要考慮先天淋巴樣細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞等少數(shù)細(xì)胞群時，這種區(qū)別就變得至關(guān)重要缀遍。此外慕匠，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄分析的成本幾乎是一個數(shù)量級的流式細(xì)胞術(shù)運行，因此域醇，它是不可行的分析大量的復(fù)制或增加統(tǒng)計能力的分析台谊，從相同的樣本。此外譬挚，與流式細(xì)胞術(shù)相比锅铅，scRNA-seq對細(xì)胞形態(tài)更敏感。由于細(xì)胞形狀和儀器設(shè)計的不兼容性减宣，許多細(xì)胞類型盐须，如肌細(xì)胞或神經(jīng)元，不能被可靠地描繪漆腌。在其他情況下贼邓，如中性粒細(xì)胞姨蟋，轉(zhuǎn)錄譜是復(fù)雜的脆弱的細(xì)胞和整體較低的RNA含量的細(xì)胞，這引入了顯著的偏差立帖。

另一方面眼溶，轉(zhuǎn)錄譜的一個顯著優(yōu)勢是基于利用單核RNA-seq。在這種方法中晓勇，我們可以分離單個細(xì)胞核并描繪相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄堂飞。這種方法有幾個重要的優(yōu)點，盡管由于大多數(shù)RNA定位于細(xì)胞質(zhì)而不是細(xì)胞核绑咱，檢測到的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量通常要少得多绰筛。首先，這種方法避免了形態(tài)學(xué)影響描融。但最重要的是铝噩，這種方法允許對冷凍樣本進行定性分析，包括那些多年前已經(jīng)進行過生物標(biāo)記的樣本窿克。這開啟了從臨床樣本中研究組織群的能力骏庸，而這些臨床樣本通常需要長時間收集。

盡管有這些優(yōu)勢年叮，轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)只提供了代謝測量的“兩次移除”模式具被，在這方面，細(xì)胞檢測是一個更直接的方法只损，產(chǎn)生蛋白質(zhì)水平的測量一姿。基于抗體的方法直接測量酶的水平跃惫，包括它們的翻譯后修飾(及其關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子的修飾)叮叹。使用基于細(xì)胞的方法的另一個好處是，它允許包含非基于蛋白的細(xì)胞表型標(biāo)記爆存。例如蛉顽，通過包括標(biāo)記的IdU、BrU和嘌呤霉素底物终蒂，代謝譜和細(xì)胞表型可以功能性地連接到合成代謝過程蜂林，如DNA遥诉、RNA和蛋白質(zhì)合成拇泣。

總之，在受控實驗設(shè)計的背景下矮锈，我們將提倡一種組合方法霉翔，其中scRNA-seq在有限的規(guī)模上運行以探索變化的廣闊前景，然后使用假設(shè)驅(qū)動的抗體panle進行大規(guī)模的細(xì)胞分析以在蛋白水平上進行驗證苞笨。

• Cytometry 與流式細(xì)胞術(shù)比較

流式細(xì)胞術(shù)仍是最常用的免疫細(xì)胞圖譜分析方法债朵，但由于熒光技術(shù)的存在子眶，可同時檢測的參數(shù)數(shù)量相對有限溢出。當(dāng)一種氟鉻的熒光發(fā)射被另一種氟鉻的探測器探測到時序芦，就會發(fā)生這種情況臭杰。因此，流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)需要仔細(xì)補償谚中，這對大的面板尤其具有挑戰(zhàn)性渴杆。
然而，在流式細(xì)胞術(shù)中使用的顏色和抗體的數(shù)量正在快速增長宪塔，20個或更多的標(biāo)記板現(xiàn)在很常見磁奖。與熒光檢測器不同的是，CyTOF使用mass cytometer來檢測每一種金屬的TOF某筐，而TOF是由其質(zhì)量決定的(Spitzer和Nolan, 2016)比搭。因此，檢測重疊和背景(流式細(xì)胞術(shù)中的自體熒光)在細(xì)胞分析中都很低南誊，因為重金屬不會自然地出現(xiàn)在細(xì)胞中身诺。設(shè)計理想的面板細(xì)胞仍然是減少由于金屬標(biāo)簽的雜質(zhì)造成的“溢出”，并考慮不同金屬信號強度的差異的關(guān)鍵抄囚。此外戚长，在流式細(xì)胞術(shù)中，細(xì)胞中沒有質(zhì)量通道與PE等亮熒光色一樣敏感怠苔。

流式細(xì)胞術(shù)需要快速獲取染色細(xì)胞以防止光漂白同廉，而金屬標(biāo)記的樣本可以(cryo)保存數(shù)周，并在臨床試驗過程中柑司，當(dāng)所有樣本隨時間采集時同時獲得迫肖。或者攒驰，細(xì)胞可以被分離蟆湖、固定、儲存一段時間玻粪，并在臨床試驗或?qū)嶒炌瓿珊笠黄鹛幚碛缃颉Ｊ聦嵣希梢詫Χ噙_20個樣品進行獨特的條形碼編碼劲室，使我們能夠?qū)⑺鼈兘M合起來伦仍，然后染色、處理很洋，并作為一個多路復(fù)用的樣品獲得它們充蓝。這些優(yōu)勢帶來了成本，因為CyTOF抗體比熒光偶聯(lián)抗體更昂貴，而且用于獲取標(biāo)記細(xì)胞的儀器在大規(guī)模細(xì)胞術(shù)中更昂貴和先進谓苟。雖然多色流式細(xì)胞儀幾乎是每個實驗室的主要設(shè)備官脓，但大規(guī)模流式細(xì)胞儀卻不那么常見，而且僅限于高端核心設(shè)備涝焙。

如今卑笨，光譜分析儀正在推動流式細(xì)胞術(shù)的發(fā)展。使用5個激光器探測64個通道的全部發(fā)射光譜仑撞，像Cytek aurora這樣的儀器現(xiàn)在能夠以一種靈敏湾趾、快速和可接受的方式探測30多種顏色。這對于(免疫)代謝研究特別有價值派草，因為它可以將針對代謝蛋白和mune譜系標(biāo)記的氟鉻標(biāo)記抗體與熒光代謝工具結(jié)合搀缠，以提供額外的代謝信息。例如近迁，葡萄糖轉(zhuǎn)運體glut1的表達可以直接與熒光標(biāo)記2NBDG的攝取相關(guān)艺普。類似地，提示線粒體氧化增加的蛋白表達增加可以直接與線粒體質(zhì)量和膜電位相關(guān)(見表2)鉴竭。該技術(shù)的優(yōu)點和缺點強力流汗細(xì)胞外通量分析(間接)功能reads細(xì)胞數(shù)目和復(fù)制需要儀器的可用性限制糖酵解和線粒體呼吸負(fù)擔(dān)得起和快速受到細(xì)胞分離和分類代謝組學(xué)的影響歧譬。因此，基于熒光的流式細(xì)胞術(shù)的一個明顯優(yōu)勢是熒光代謝染料的適用性搏存，而大規(guī)模細(xì)胞術(shù)的最大優(yōu)勢是細(xì)胞板的大小瑰步、信號的穩(wěn)定性和條形碼的可能性，允許在臨床試驗中獲得免疫細(xì)胞住院活檢的深入的單細(xì)胞代謝分析璧眠。

免疫代謝的空間解決方案

目前列出的所有方法的一個主要缺點是它們需要懸浮的細(xì)胞缩焦，因此缺乏空間信息≡鹁玻空間方面是特別重要的袁滥，因為特定的微環(huán)境因素，包括復(fù)雜的混合刺激灾螃，營養(yǎng)物質(zhì)的可用性和與鄰近細(xì)胞的相互作用题翻，是關(guān)鍵的驅(qū)動細(xì)胞代謝概況在組織和決定性的形狀免疫和疾病進展。傳統(tǒng)的單細(xì)胞分析方法的另一個缺點是腰鬼，用于將組織分解成單細(xì)胞的特定協(xié)議會導(dǎo)致一些細(xì)胞死亡嵌赠，但不是所有細(xì)胞，并且可能有利于與相關(guān)代謝分離特定的免疫細(xì)胞亞群熄赡。

綜上所述姜挺，這些局限性強調(diào)了將細(xì)胞在組織微環(huán)境中的免疫代謝特征的關(guān)鍵觀察值進行驗證的必要性，并考慮到細(xì)胞的空間組織本谜，避免細(xì)胞分選相關(guān)的問題初家。即時捕獲空間環(huán)境和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組譜的新方法正在被應(yīng)用偎窘，但它們在免疫代謝研究中的應(yīng)用還沒有被描述乌助。然而溜在，最近的出版物強調(diào)了如何在蛋白質(zhì)水平上以一種高度復(fù)雜的方式評估單細(xì)胞在其微環(huán)境中的代謝構(gòu)型。

• MIBI-TOF作為基于蛋白質(zhì)的空間單細(xì)胞免疫/代謝分析

Hartmann等人通過將他們建立的代謝細(xì)胞面板轉(zhuǎn)移到多路復(fù)用離子束成像(MIBI-TOF)平臺他托，在空間代謝分析方面邁出了重要一步掖肋。這種最近發(fā)展起來的方法將單細(xì)胞代謝譜、免疫細(xì)胞表型和功能狀態(tài)與細(xì)胞間的相互作用和組織內(nèi)的位置結(jié)合起來赏参。為此志笼，組織切片用重金屬偶聯(lián)抗體(也用于Cy-TOF)染色，然后用離子束掃描把篓，從識別特定代謝和免疫靶點的抗體中釋放重金屬纫溃。對于每個獲得的像素點，釋放的離子通過TOF-MS進行量化韧掩，就像在CyTOF中一樣紊浩，重要的優(yōu)點是mibi - tof獲得的高維數(shù)據(jù)也包含空間信息。

染色結(jié)直腸癌和控制組織部分細(xì)胞系標(biāo)記結(jié)合廣泛的代謝抗體疗锐，緊隨其后的是單個細(xì)胞的分割取得圖像和隨后的細(xì)胞到細(xì)胞系亞群坊谁。代謝概況空間組織在具有相似代謝特征的環(huán)境中，而與細(xì)胞類型無關(guān)滑臊。細(xì)胞表達與糖酵解口芍、線粒體呼吸或氨基酸代謝相關(guān)的高水平代謝因子，經(jīng)常被表達相同代謝目標(biāo)的鄰近細(xì)胞所包圍雇卷。這種微環(huán)境驅(qū)動的代謝極化在比較靠近腫瘤邊界的細(xì)胞和遠(yuǎn)離邊界的細(xì)胞的免疫代謝譜時尤為明顯鬓椭。典型的是，代謝抑制細(xì)胞離腫瘤邊緣較遠(yuǎn)关划，而代謝活性細(xì)胞則位于腫瘤免疫邊緣膘融。由于mibi - tof方法可以對從生物銀行獲得的現(xiàn)有FFPE材料進行，它提供了將免疫代謝特征和位置與臨床結(jié)果和標(biāo)致治療成功聯(lián)系起來的機會祭玉。因此氧映，單細(xì)胞代謝譜是將免疫代謝研究轉(zhuǎn)化為病房臨床診斷和治療的重要一步。然而脱货，應(yīng)該指出的是岛都，特定酶的存在并不總是與其活性相關(guān)的，當(dāng)從這些基于抗體的研究中得出結(jié)論時振峻，應(yīng)該考慮到這一點芹务。

• 利用脫氫酶活性測定在微環(huán)境中繪制代謝圖譜

Miller等人先前配置了一種替代方法來評估細(xì)胞在其組織微環(huán)境中的代謝配置。他們的方法依賴于飽和底物和輔助因子利用率的酶活性測量履植，并結(jié)合連續(xù)組織切片的多種免疫細(xì)胞馬克森染色瞬雹。測定了催化主要元bolic途徑的五種酶的脫氫酶活性:PPP中的G6PD，糖酵解中的GAPDH，乳酸不乳酸發(fā)酵中的LDH鸽斟，以及TCA循環(huán)中的IDH和SDH拔创。當(dāng)這些脫氫酶被激活時，硝基藍(lán)四唑氯(NBT)被NAD(P)H還原為一種強烈的彩色狀態(tài)富蓄，這種狀態(tài)可以被量化剩燥，并與連續(xù)切片上獲得的免疫細(xì)胞標(biāo)記表達相關(guān)。作者利用這一技術(shù)研究了人類癌性和對照性結(jié)腸中巨噬體和T細(xì)胞亞群的代謝特征立倍。與TME內(nèi)的非炎性巨噬細(xì)胞相比灭红，腫瘤內(nèi)產(chǎn)生IL-6和TNF的巨噬細(xì)胞顯示糖酵解GADPH活性增加，但與健康組織中的巨噬細(xì)胞相比口注，總體腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞出現(xiàn)代謝抑制变擒。因此，人們很容易推測寝志，巨噬菌在腫瘤中的代謝適應(yīng)能力受損可能會阻止它們的抗腫瘤活性赁项。此外，在健康組織中澈段，與Tregs相比悠菜，Tregs表現(xiàn)出癌癥特異性代謝特征，糖酵解GAPDH活性受到抑制败富，線粒體SDH升高悔醋。識別免疫細(xì)胞亞群的這種腫瘤特異性代謝特性可以幫助開發(fā)新的治療方法。值得注意的是兽叮，這些不同脫氫酶的活性是在飽和底物濃度下測量的芬骄，因此是對最佳脫氫酶活性的估計，而不是在特定環(huán)境下(如細(xì)胞競爭營養(yǎng)物質(zhì)的缺氧環(huán)境)對其活性的精確反映鹦聪。

結(jié)論與未來方向

很明顯账阻，理解單細(xì)胞水平上的免疫代謝的技術(shù)轉(zhuǎn)變是不可避免的，盡管還沒有完成泽本。在單細(xì)胞分辨率下的轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組分析顯示了建立當(dāng)前免疫代謝領(lǐng)域前沿的成熟水平淘太，即對臨床樣本和炎癥反應(yīng)中的代謝景觀進行初始評估和集中探測。如上所述规丽，特定的代謝特征可以通過scRNA-seq分析或混合細(xì)胞培養(yǎng)/體外活體擴增的體積觀察得知蒲牧，然后通過專門的蛋白質(zhì)靶向板進行解剖。例如赌莺，基于最近于面板之間的重疊冰抢，可以用代謝panle組成的10代謝抗體，也適用于多色流式細(xì)胞術(shù)和一組更大的panle包括一個額外的10個抗體艘狭。

盡管諸如CyTOF和scRNA-seq等方法對于不同細(xì)胞亞群內(nèi)的代謝重構(gòu)具有重要意義挎扰，但這些方法獲得的原始數(shù)據(jù)仍然是間接的或有限的翠订。因此，能夠解決這些挑戰(zhàn)的技術(shù)進步將為下一代免疫代謝研究奠定基礎(chǔ)遵倦。兩個關(guān)鍵的方向是:

(1)提高單細(xì)胞數(shù)據(jù)的深度和質(zhì)量
(2)提高我們解決代謝特征空間分布的能力(例如尽超，在組織切片內(nèi))。

下一代方法將包括直接單細(xì)胞代謝物分析(Duncan et al.骇吭， 2019)橙弱，這將伴隨著穩(wěn)健方法的發(fā)展歧寺，以分離單個細(xì)胞燥狰，而不受顯著的代謝干擾(圖3)。這種方法不僅可以直接評估代謝物水平斜筐，而且還可以在單細(xì)胞水平上提供通量組學(xué)龙致，當(dāng)細(xì)胞混合物，甚至動物和人顷链，被標(biāo)記的底物支持時目代。考慮到代謝物的不穩(wěn)定性以及細(xì)胞分離會影響讀數(shù)的事實嗤练，單細(xì)胞代謝組學(xué)的未來很可能不是在懸浮分離細(xì)胞中測量代謝物榛了，而是在基于ms的成像方法中在其組織微環(huán)境中空間解決單細(xì)胞的代謝配置。要了解諸如用于單細(xì)胞甚至亞細(xì)胞分析的MALDI-MS等新興技術(shù)的詳細(xì)信息煞抬，我們請讀者參閱最近的優(yōu)秀評論霜大。

以單細(xì)胞分辨率解決免疫代謝當(dāng)然不是終末階段，因為細(xì)胞不均勻革答，而是高度分區(qū)的結(jié)構(gòu)战坤，具有不同功能的代謝物在不同亞細(xì)胞位置的異質(zhì)分布。例如残拐，乙酰輔酶a促進線粒體內(nèi)的三羧酸循環(huán)途茫，同時促進細(xì)胞核內(nèi)細(xì)胞質(zhì)和組蛋白乙酰化中的脂肪酸和膽固醇生物合成溪食。因此囊卜，改善代謝讀數(shù)的亞細(xì)胞表達將為免疫代謝領(lǐng)域和遺傳學(xué)領(lǐng)域的科學(xué)提供額外的一層視野。

在互補組學(xué)分析的背景下错沃，沿著CITE-seq方法實現(xiàn)的路線進行的蛋白融合和轉(zhuǎn)錄組水平測量在免疫自代謝領(lǐng)域具有重大前景边败。特別的是，擴展基于cite序列的方法捎废，用于細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的粗獷測量笑窜，將允許測量大量的酶和它們的轉(zhuǎn)運后修飾，因為抗體與核酸條形碼結(jié)合登疗，因此100-200個蛋白質(zhì)可以同時測量排截。這將大大提高分辨率比目前0-40 抗體可能帶有CyTOF嫌蚤，尤其是考慮到幾乎一半的面板都是典型的細(xì)胞類型特異性標(biāo)記。

此外断傲，采用新的數(shù)據(jù)生成技術(shù)將需要開發(fā)一系列新的計算應(yīng)用程序脱吱，這些應(yīng)用程序可以將基于網(wǎng)絡(luò)的數(shù)據(jù)與相應(yīng)的技術(shù)輸出集成在空間分配或免疫反應(yīng)的潛在時間方面。利用諸如SCORPIUS這樣的計算算法认罩，有希望推斷出偽時間序列箱蝠，以研究代謝重組的假定時間序列。理解表型垦垂、功能和代謝變化的動力學(xué)可以揭示哪些代謝事件是因果關(guān)系宦搬，哪些只是特定免疫狀態(tài)的旁觀者。理解代謝的時空方面可以幫助合理地設(shè)計新的治療方法劫拗，因為人們將有一個更好的理解疾病的驅(qū)動因素和旁觀者效應(yīng)间校。特別是，靶向代謝變化页慷，這些變化在運動前可能也調(diào)表型改變憔足，在免疫細(xì)胞可以改善免疫細(xì)胞功能和疾病的結(jié)果。此外酒繁，生理免疫反應(yīng)發(fā)生在空間上高度組織化的多分子環(huán)境中滓彰。

我們設(shè)想，理解多細(xì)胞免疫代謝重構(gòu)的基本原理州袒，將為從關(guān)鍵的細(xì)胞內(nèi)通路的干擾演繹過渡到成功的全身范圍的異常反應(yīng)通路揭绑。但很明顯，我們需要額外的分析工具來全面掌握免疫代謝的時空信息稳析，以及在單細(xì)胞水平上進行代謝聚類等任務(wù)洗做。

總之，免疫代謝正在迅速成為一個系統(tǒng)水平的科學(xué)彰居，其中需要多學(xué)科專家充分利用新技術(shù)诚纸。因此，為了成功地過渡到單細(xì)胞免疫代謝時代陈惰，計算技術(shù)的進步不僅在數(shù)據(jù)分析本身方面畦徘，而且在實驗免疫學(xué)家的可用性和可交互性方面都很重要。

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