##Single-Cell Sequencing of the Healthy and Diseased Heart Reveals Cytoskeleton Associated Protein 4 as a New Modulator of Fibroblasts Activation

摘要：

背景：全基因組轉(zhuǎn)錄組分析極大地促進了對基礎(chǔ)心臟生物學和疾病驅(qū)動機制的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的理解默辨。然而敏释，到目前為止什往，研究成人心臟基因表達模式的分辨率僅限于整個組織提取物的水平。組織勻漿的使用固有地導致基因表達中細胞起源或細胞類型特異性變化的任何信息的丟失座咆。RNA擴增策略的最新發(fā)展為使用少量輸入RNA進行單細胞全基因組測序提供了獨特的機會诀姚。

方法：提出一種從成年小鼠消化的心臟組織中獲得高質(zhì)量RNA的方法疮茄，用于健康和患病心臟的自動單細胞測序吝梅。

結(jié)果：優(yōu)化后，能夠在穩(wěn)態(tài)條件下和缺血損傷后對成年心臟組織進行單細胞測序妆兑』昀梗基于差異基因表達的聚類分析揭示了所有主要心臟細胞類型的已知和新標記毛仪。基于基因表達的差異芯勘，可以在某一細胞類型中識別多個亞群箱靴。此外，對健康和受傷的心臟應用單細胞測序表明存在疾病特異性細胞亞群荷愕。因此衡怀，鑒定了細胞骨架相關(guān)蛋白4（CKAP4）作為活化成纖維細胞的新標記物，其與小鼠和人類心臟組織中已知的肌成纖維細胞標記物呈正相關(guān)路翻。與對照組相比狈癞，用轉(zhuǎn)化生長因子β處理的活化成纖維細胞中的細胞骨架相關(guān)蛋白4的抑制引發(fā)了與活化成纖維相關(guān)基因表達的更大增加茄靠，這表明細胞骨架相關(guān)蛋白質(zhì)4在調(diào)節(jié)受損心臟中成纖維細胞活化中的作用茂契。

結(jié)論：對健康和患病成人心臟進行單細胞測序，可以研究心臟細胞之間的轉(zhuǎn)錄組差異慨绳，以及心臟病期間基因表達的細胞類型特異性變化掉冶。這一新方法為與心臟生物學和病理生理學相關(guān)的細胞過程中的分子變化提供了豐富的新見解。應用這項技術(shù)可能會發(fā)現(xiàn)與心臟病相關(guān)的新治療靶點脐雪。

實驗動物：C57BL/6J小鼠厌小，缺血再灌注（IR）手術(shù)。術(shù)后3天收集并分析心臟战秋。

取樣區(qū)域：梗死區(qū)（梗死區(qū)和邊緣區(qū)）或?qū)φ招呐K的相應區(qū)域

FIG 1

結(jié)果：

1.Isolation of High-Quality RNA From Digested Hearts From Adult Mice

為了創(chuàng)建所有心臟細胞類型的可靠基因表達圖譜璧亚，首先確定組織消化和RNA提取的最佳方法，以從心臟的單細胞懸浮液中獲得高質(zhì)量RNA脂信。處死小鼠癣蟋，然后用冷灌注緩沖液灌注心臟。收集左心室前壁后狰闪，將組織在冰冷的灌注緩沖液中清洗疯搅，保存在冰上，切碎成小塊埋泵，并轉(zhuǎn)移到裝有冷消化緩沖液的玻璃瓶中幔欧。消化組織后，將細胞懸浮液輕輕地上下吸移丽声，然后將裂解物通過100μm的細胞過濾器礁蔗。然后用DMEM沖洗過濾器，收集細胞用于隨后的RNA提取或流式細胞術(shù)（圖1A和1B）雁社≡【基于細胞形態(tài)和RNA質(zhì)量，在Trizol RNA分離之前歧胁，使用游離酶在37°C搖動水浴中消化成年心臟組織15分鐘滋饲，是獲得心臟單細胞懸浮液的最佳方法厉碟。

2.Single-Cell Sorting Strategy

酶法分散心臟組織后，用流動比色法分離細胞屠缭。使用大噴嘴尺寸（130μm）可以分選所有范圍的心臟細胞箍鼓，而不會損傷更大的心肌細胞。后續(xù)實驗證明心肌細胞大多完好呵曹。

3.Single-Cell Sequencing to Identify Gene Expression Signatures in All Main Cardiac Cell Types

使用SORT-Seq協(xié)議款咖，平均每個細胞檢測到5個原始唯一讀取。在質(zhì)控后奄喂，來自3個不同對照心臟的426個細胞用于下游的分析铐殃。使用RaceID2算法識別和分析所有主要的心臟細胞類型，1-Pearson相關(guān)系數(shù)的K-medoids聚類顯示成年心臟中有14個不同的細胞簇（圖2A）跨新。t-SNE圖表明存在心肌細胞（圖2D）富腊、成纖維細胞（圖2E）、內(nèi)皮細胞（圖2AF）和巨噬細胞（圖2G）域帐。

FIG 2

3.Contribution of Mitochondrial Transcripts Differ for Individual Cell Types

在研究所有主要心臟細胞類型中的基因表達特征時赘被，觀察到線粒體和基因組轉(zhuǎn)錄物的貢獻在不同細胞中不同。與其他心肌細胞類型相比肖揣，所有心肌細胞的線粒體轉(zhuǎn)錄物百分比更高（占總轉(zhuǎn)錄物的58%至86%）民假。由于線粒體轉(zhuǎn)錄物非常豐富，將其排除在聚類分析之外龙优，只關(guān)注基因組基因的差異表達羊异。

4.Single-Cell Sequencing Identifies Cell Type-Specific Subpopulations in the Healthy Heart

根據(jù)標記基因的基因表達，識別了4個不同的心肌細胞簇彤断、2個內(nèi)皮細胞簇野舶、2個成纖維細胞簇、2個巨噬細胞簇瓦糟、1個平滑肌細胞簇和1個紅細胞簇筒愚。在心肌細胞4中，該簇表達心肌細胞標記物菩浙，如心肌肌鈣蛋白t巢掺、Tnnt2（圖4A）。然而劲蜻，它是唯一富含Myozen2（Myoz2）表達的心肌細胞亞群（圖3和4B）陆淀。在小鼠中也同樣檢測到了富含Myoz2的心肌細胞簇，且富含Myoz2的心肌細胞簇確實不同于其他心肌細胞簇先嬉。

FIG 3

免疫組織化學顯示轧苫，MYOZ2在位于心臟心外膜表面的一層心肌細胞（與TNNT2共染色）中富集（圖4C）。與其他心肌細胞相比，富含Myoz2的簇中最受差異調(diào)節(jié)的基因的基因本體分析表明含懊，高檢測基因與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的退行性疾病有關(guān)（圖4D）身冬，而低表達基因似乎與心臟疾病相關(guān)（圖4E）。Myoz2岔乔，也稱為Calsarcin-1酥筝，是病理性促肥大磷酸酶鈣調(diào)素的抑制劑。

FIG 4

5.Single-Cell Sequencing of the Injured Heart

將小鼠暴露于缺血損傷（IR）中雏门，并在IR后3天收集樣品嘿歌。從心臟梗死區(qū)域分離了509個單獨的細胞。將這些細胞與先前從對照心臟相應區(qū)域獲得的426個細胞合并茁影，用于RaceID2的計算機分析宙帝。1-Pearson相關(guān)性的K-medoids聚類顯示對照組和IR心臟后3天的所有匯集細胞中有17個不同的細胞簇。

6.Inter- and Intracellular Gene Expression Changes Induced by Ischemic Injury

損傷引發(fā)了疾病富集細胞簇的出現(xiàn)募闲，識別到3個不同的成纖維細胞簇（7步脓、13和15）（圖5B至5D）。簇13和簇15中的細胞主要來源于受傷的心臟蝇更，而簇7包含來自兩種情況的細胞（圖5C和5D）沪编。來自簇13和簇15的細胞的特征是Postn、Wisp1和Tnc的相對高表達年扩，先前與成纖維細胞活化相關(guān)，t-SNE圖譜再次證實了這些基因在疾病富集的成纖維細胞簇中的富集表達访圃。通過對對照或受傷心臟的心臟組織進行qPCR驗證了這些基因的疾病特異性誘導（圖5F）

FIG 5

7.Ckap4 Expression Is Specifically Increased in Activated Fibroblasts

在確定了來自健康和患病心臟的成纖維細胞群體（簇7）和主要來自患病心臟的群體（簇13和簇15）后厨幻，接下來確定了這些群體之間的差異表達基因。疾病富集的成纖維細胞群體中有11個基因上調(diào)腿时，20個基因下調(diào)（圖5G）况脆。發(fā)現(xiàn)205個基因在健康和來自簇1、3批糟、4和8的缺血心肌細胞格了，而來自健康或缺血心臟的巨噬細胞中差異表達191個基因，形成簇5徽鼎、9盛末、14和16。這些疾病富集簇中的上調(diào)基因與細胞外基質(zhì)沉積和膠原沉積相關(guān)的各種過程有關(guān)（圖5H）否淤，這是心臟缺血損傷后纖維化反應的標志悄但。根據(jù)這一觀察，在富集的基因中石抡，檢測到已知在活化的成纖維細胞中表達的各種膠原基因和標記物檐嚣，如Postn（圖5I）。對缺血性心臟中富含疾病相關(guān)基因的聚類的鑒定進一步強調(diào)了我們聚類方法的有效性啰扛。

除了已知的活化成纖維細胞標記物外，還發(fā)現(xiàn)Ckap4在這群活化成纖維纖維細胞中上調(diào)本冲。Ckap4是一種跨膜蛋白赎懦，可以作為不同細胞中各種配體的受體。然而暑刃，其在心臟成纖維細胞中的功能仍然未知。通過bulk-RNA測序來確認缺血損傷后整個心臟中Ckap4的上調(diào)（圖5J）膜眠。單細胞測序數(shù)據(jù)檢測到Ckap4在活化的成纖維細胞中的特異性上調(diào)岩臣，而不是在任何其他細胞類型中的上調(diào)(t-SNE)（圖5K和5L）。通過免疫組織化學宵膨，驗證缺血損傷后心臟中CKAP4的誘導架谎，其與表達成纖維細胞標記物波形蛋白的細胞重疊（圖6A）。為了研究活化成纖維細胞中Ckap4表達的功能相關(guān)性辟躏，抑制了成纖維細胞的Ckap2表達谷扣，然后將其暴露于TGFβ中（圖6B）。與對照組相比捎琐，TGFβ能夠誘導Ckap4表達会涎。siRNA介導的Ckap4抑制導致了mRNA和蛋白質(zhì)水平上的Ckap4的劑量依賴性降低（圖6C）（圖6D）。qPCR分析表明瑞凑，TGFβ治療導致活化成纖維細胞標記物表達的增加末秃，并且在這種條件下抑制Ckap4進一步增強了這種作用（圖6E）。盡管這一發(fā)現(xiàn)值得進一步研究籽御，但這似乎意味著活化成纖維細胞中的CKAP4能夠抑制與活化成纖維相關(guān)基因的表達练慕。同樣，在來自缺血性心臟病患者的心臟樣品中技掏，我們能夠確認CKAP4和已知在激活的心臟成纖維細胞中誘導的基因之間的表達正相關(guān)（圖7A至7C）铃将。此外，免疫組織化學顯示哑梳，人類缺血心臟中CKAP4表達與各種成熟的成纖維細胞標記物之間存在強烈重疊（圖8D）劲阎，這表明CKAP4在人類活化的成纖維纖維細胞中也有作用。

FIG 6

FIG 7

DISCUSSION

一部分心肌細胞表達Myoz2鸠真，一種屬于肌聚蛋白家族的蛋白悯仙。Myoz2已被證明能將α-肌動蛋白與鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（一種眾所周知的心肌細胞肥大誘導物）連接，從而抑制心肌細胞的病理性肥大反應弧哎。Myoz2的表達僅限于心肌細胞的一個子集雁比，提示主要位于心臟的心外膜區(qū)域的心肌細胞亞群對鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶介導的肥大反應不同，其中一些細胞比其他細胞更具抵抗力撤嫩。

對健康和受傷心臟的單細胞測序數(shù)據(jù)集進行比較表明偎捎，疾病會產(chǎn)生已知細胞類型的新亞群，這些亞群似乎對來自患病心臟的細胞具有特異性或富集性。盡管已知心臟的細胞組成在病理應激期間發(fā)生變化茴她，但在檢測心臟應激期間每種細胞類型內(nèi)特異性表達的全基因組變化方面的能力有限寻拂。單細胞測序數(shù)據(jù)現(xiàn)在允許識別不同條件下所有主要心臟細胞類型的轉(zhuǎn)錄組差異。通過定義與疾病相關(guān)的細胞亞群和基因表達的相關(guān)變化丈牢，確定與心臟病潛在細胞變化相關(guān)的新分子機制祭钉。本研究發(fā)現(xiàn)Ckap4在與Postn、Ctrc1和Fn1相同的細胞群中表達己沛，Postn是心臟肌成纖維細胞的已知標志物慌核。對照組和對照組的免疫組織化學缺血性心臟證實CKAP4的表達對應激心臟是特異性的，并且與波形蛋白重疊申尼，波形蛋白是缺血性心臟中成纖維細胞的標志物垮卓。體外Ckap4功能的喪失表明，在TGFβ刺激前后师幕，肌成纖維細胞相關(guān)基因過度激活粟按，這表明Ckap1在成纖維細胞激活過程中起作用。此外霹粥，在缺血性心臟病患者的心臟活檢中觀察到CKAP4和成纖維細胞標記物之間的正相關(guān)灭将。