第一章單細胞科研：第一節(jié)备蚓，單細胞技術應用戈毒，多細胞疾病模型構建
1#導語 “
????????1.1 基因組醫(yī)學為鑒定復雜疾病的生物標志物和可治療靶標鋪平了道路顶吮，單細胞RNA測序研究（scRNA-seq）可以表征整個器官中的此類復雜變化父丰。取而代之的是威彰，在多個細胞類型的多個因果機制的分散體是通過其他一些研究出牧。這種復雜性的一個極端后果是可能需要大量的藥物才能有效治療每種疾病。為了解決這個問題歇盼，我們理想地需要表征所有與疾病相關的細胞類型和途徑舔痕，然后優(yōu)先確定相對最重要的細胞。據(jù)我們所知豹缀，這兩個挑戰(zhàn)都沒有得到系統(tǒng)解決伯复。一個原因是患者可能無法獲得許多細胞類型，另一個原因是缺乏在細胞類型和途徑之間進行優(yōu)先排序的方法邢笙。
????????1.2 作者的策略的普遍適用性通過對151例患有13種自身免疫性啸如，過敏性，感染性氮惯，惡性叮雳，內分泌性想暗，代謝性和心血管性疾病以及53個年齡和性別匹配的對照的患者進行的前瞻性診斷研究得到了支持。該策略的治療潛力得到了對這些疾病的基于網(wǎng)絡的分析以及對關節(jié)炎小鼠模型的研究的支持债鸡。綜上所述江滨，作者的結果支持我們的策略可能具有優(yōu)先考慮復雜疾病中治療和診斷目標的潛力。
2# 試驗方法
? ? ? ? 2.1 試驗設計
????????2.1.1總而言之厌均，本研究描述了構建MCDM并將其用于診斷和治療的可擴展的分步策略唬滑。該策略已通過臨床和實驗研究驗證。該策略基于應用網(wǎng)絡工具來組織和分析來自關節(jié)炎和人類類風濕性關節(jié)炎小鼠模型的scRNA-seq數(shù)據(jù)棺弊。使用來自13種疾病的前瞻性臨床研究的表達譜數(shù)據(jù)和潛在的蛋白質生物標記物進行診斷驗證研究晶密。通過對關節(jié)炎小鼠模型的治療研究，使用表型模她，免疫組織化學和細胞分析作為讀數(shù)稻艰，檢查了候選藥物。
????????2.1.2?類風濕關節(jié)炎小鼠模型
2.1.3?單細胞RNA-seq數(shù)據(jù)處理
????????使用bcl2fastq Conversion和Picard軟件將單細胞數(shù)據(jù)處理為數(shù)字基因表達矩陣侈净。從GRCh38（2017年4月尊勿，Ensembl）獲取用于人類數(shù)據(jù)（和GRCm38（2017年6月，Ensembl）用于小鼠的讀數(shù)的索引參考畜侦。使用STAR軟件獲取數(shù)據(jù)元扔。根據(jù)使用STAR軟件的作圖質量，在下游分析期間僅考慮了與參考基因組的初步比對旋膳。通過每個細胞至少有10,000個讀數(shù)澎语，400個轉錄本和少于20％的線粒體基因來評估細胞的質量。由于存在文庫重復的風險验懊，導致兩個或更多細胞共享細胞條形碼擅羞，因此，基于對轉錄物計數(shù)的高估义图，可以移除異常值减俏。結果分別獲得了7086和1333個細胞用于關節(jié)和淋巴結數(shù)據(jù)。然后使用Seurat [34]將單細胞數(shù)據(jù)歸一化以進行進一步分析碱工。為了減少數(shù)據(jù)中的噪聲娃承，對每個組織矩陣分別進行K最近鄰平滑處理，至少使用5個k痛垛，或者如果捕獲到5000個以上的單元草慧，則要占單元總數(shù)的?0.1％桶蛔。
#3試驗結果
3.1 抗原誘導性關節(jié)炎（AIA）小鼠模型的scRNA-seq分析
a?AIA鼠標模型的概述匙头。b蘇木精和曙紅（H＆E）染色后，來自幼稚小鼠和關節(jié)炎關節(jié)的代表性關節(jié)圖像仔雷。B蹂析，骨髓舔示；S，滑膜腔电抚；C惕稻，軟骨。箭頭指示（1）炎性細胞向滑膜的浸潤蝙叛，（2）軟骨/骨破壞俺祠，和（3）滑膜內膜的增生。c使用參考成分分析（RCA）對seq-well scRNA-seq和細胞類型進行鑒定的示意圖借帘。d?t-SNE圖顯示7086個健康和RA關節(jié)細胞（n?= 4個健康小鼠樣品和5個患病小鼠樣品）以及1333個健康和AIA淋巴結細胞（n?= 4個健康小鼠樣品和5個患病小鼠樣品）蜘渣，由RCA簇著色
3.1來自AIA小鼠模型的多細胞疾病模型（MCDM）
????通過將每種細胞類型中差異表達的基因與所有其他細胞類型中預測的上游調節(jié)子相連接，基于scRNA-seq數(shù)據(jù)構建MCDM肺然。像元類型大小對應于中心性得分蔫缸。節(jié)點指示的數(shù)字表示已識別的特定類型的細胞數(shù)（例如，在RA關節(jié)中际起，我們已識別出4258個粒細胞）拾碌。一個從關節(jié)炎小鼠的淋巴結的MCDM。b來自關節(jié)炎關節(jié)的MCDM街望。c健康小鼠關節(jié)的多細胞模型（未顯示淋巴結模型校翔，因為只有一種預測的相互作用）。預測的上游調節(jié)子的基因名稱顯示在箭頭上它匕。Treg展融，T調節(jié)細胞。d?細胞類型的中心性評分與通過GWAS鑒定的具有遺傳變異的基因的富集和差異表達基因之間專家管理的存儲庫之間的相關性（這些基因來自DisGeNet并基于人類基因的小鼠直向同源物進行了分析）
?3.3疾病相關細胞類型的網(wǎng)絡模型
? ??a24個細胞類型和亞群均顯著富集與RA相關GWAS富集后生標記豫柬。像元類型大小對應于關聯(lián)-ln（p值）告希。b與類風濕關節(jié)炎（RA）相關的細胞類型的網(wǎng)絡模型。節(jié)點對應于細胞類型烧给，節(jié)點大小對應于關聯(lián)的重要性（-log10 RA GWAS-表觀遺傳標記富集p值）燕偶。具有潛在空間相互作用的單元格類型被鏈接在一起，并且單元格類型的位置取決于中心得分础嫡，如背景中的圓環(huán)所示指么。C按與175種人類疾病的關聯(lián)的重要性排序的細胞類型類別的條形圖（Fisher結合了富含GWAS的表觀遺傳標記–為每種細胞類型類別計算的疾病關聯(lián)p值）。d基于與b中相同的參數(shù)的與175種疾病相關的細胞類型的網(wǎng)絡模型（有關詳細信息榴鼎，請參閱結果）
3.4根據(jù)13種疾病的臨床概況研究伯诬，CD4 + T細胞具有診斷潛力。
????疾病模塊的玩具模型。疾病相關基因（紅色）被映射到人蛋白質-蛋白質相互作用網(wǎng)絡中的蛋白質（藍色）上平项。共定位的疾病相關基因形成一個模塊赫舒。b基于模塊的分析概述悍及。第一步是在前瞻性CD4 + T細胞微陣列研究中確定的13種疾病中的每一種的疾病模塊的識別。對于每種疾病模塊接癌，基因將患者與健康對照區(qū)分開心赶。為了成對比較疾病，將兩個模塊的結合中的基因分開患有不同疾病的患者缺猛。例如缨叫，流感和哮喘模塊中的基因將流感患者與患有AUC為0.99的哮喘患者區(qū)分開，p?= 3.3×10?-5荔燎，如c所示弯汰。c使用彈性網(wǎng)基于模塊相交基因在13種疾病分類的曲線下面積（AUC）值上顯示熱圖。d?基于在CD4 + T細胞中測得的預先選擇的生物標志物（基因）湖雹，對乳腺癌患者（n?= 24）和健康受試者（n?= 14）的分類準確性進行的獨立驗證研究咏闪。用彈性網(wǎng)進行分類，保留與原始研究相同的λ（λ）值摔吏。e?–?j根據(jù)在潰瘍性結腸炎（UC）和克羅恩哺肷（CD）模塊相交處鑒定出的六種分泌血漿蛋白，對IBD患者進行潛在的診斷分類征讲。這些蛋白質可以將患者與健康對照（HCs）分開据某。e?CXCL11;?f?CCL25；g?CXCL1;?h?CXCL8诗箍；i?IL1B癣籽；??TNF。k克羅恩病和潰瘍性結腸炎患者根據(jù)CXCL1和CXCL8的標準化蛋白質水平進行分類滤祖。UC筷狼，潰瘍性結腸炎；CD匠童，克羅恩补〔摹；HC汤求，健康對照俏险。星號表示p值<0.05。d?–?k方框中的條形圖代表中位數(shù)扬绪，第25和第75個百分位數(shù)竖独，而晶須延伸到±?2.7σ（請參見“方法”部分）
3.5苯扎貝特可預防抗原誘發(fā)的關節(jié)炎（AIA）
????用苯扎貝特（n?= 4）或模擬（AIA對照，n?= 5）腹膜內（ip）治療mBSA誘導的關節(jié)炎的雌性小鼠挤牛。一個基于在兩個組的組織病理學第28天的關節(jié)炎嚴重性評分（H＆E染色莹痢，垂直條表示中值，使用曼-惠特尼評估組間差異的ü測試，*?p?<0.05）格二。b來自苯扎貝特治療的小鼠的代表性H＆E聯(lián)合圖像。c從模擬（AIA對照竣蹦，n?= 5）或苯扎貝特治療（n）分離的脾和淋巴結細胞中顶猜，CD4 +輔助性T細胞的抗原召回反應?= 4）小鼠；豎線表示平均值±SEM痘括，使用雙面Mann-Whitney?U檢驗評估的組間差異*?p?<0.05）
##4總結和個人啟發(fā)
????????4.1由于成千上萬的基因參與了許多不同的細胞類型长窄，因此了解復雜疾病中的致病機制和確定藥物靶標是一項艱巨的挑戰(zhàn)。諸如GWAS和scRNA-seq等無偏倚的全基因組方法表明纲菌，多種致病機制分散在許多細胞類型中挠日。
????????4.2藥物發(fā)現(xiàn)的困難以及為什么許多患者對治療無反應。盡管如此翰舌，疾病相關細胞類型的系統(tǒng)表征和優(yōu)先級以及用于診斷和治療的機制仍未解決嚣潜。一種明顯的方法是識別并確定最重要的途徑。在作者對AIA的scRNA-seq研究中椅贱，發(fā)現(xiàn)涉及T細胞分化的途徑最為重要懂算。這與對RA發(fā)病機理的當前理解是一致的，并已導致靶向此類途徑的藥物庇麦。但是计技，效果是可變的。作者對scRNA-seq數(shù)據(jù)的系統(tǒng)分析提出了一種可能的解釋山橄，該數(shù)據(jù)揭示了每種細胞類型中的大量其他途徑和治療靶標垮媒，以及細胞類型之間的重疊有限。
????????4.3結果支持基于網(wǎng)絡的原理可以同時應用于兩者航棱。將來自AIA和人類RA的scRNA-seq數(shù)據(jù)整理成MCDM睡雇。取代任何具有明顯關鍵調節(jié)作用的獨特細胞類型或機制，MCDM中的大多數(shù)細胞類型都相互作用饮醇，形成了多向網(wǎng)絡入桂，其中多種細胞類型可能導致了發(fā)病機理。盡管一種細胞類型和機制可能發(fā)揮關鍵作用驳阎，但對遺傳和表觀遺傳學數(shù)據(jù)的分析支持致病機制分散在多種細胞類型中抗愁。
? ? ?4.4作者發(fā)現(xiàn)支持MCDM和網(wǎng)絡原理可能具有優(yōu)先考慮細胞類型以及生物標志物和藥物發(fā)現(xiàn)機制的潛力。提供了所有提供的數(shù)據(jù)和方法以促進此類研究呵晚。
-----在讀博士蜘腌，代謝，組學研究 王平寫作
5 #參考文獻
Gawel, Danuta R et al. “A validated single-cell-based strategy to identify diagnostic and therapeutic targets in complex diseases.”?Genome medicine?vol. 11,1 47. 30 Jul. 2019, doi:10.1186/s13073-019-0657-3
