在做monocle的時(shí)候，我們最糾結(jié)的地方莫過(guò)于確定細(xì)胞的起點(diǎn)了挤渔。如果是比較明確的分析知道起點(diǎn)，或者有參考文獻(xiàn)风题，結(jié)合自己的生物學(xué)背景能夠推斷還好判导，可是如果自己一篇空白，該怎么確定起點(diǎn)呢沛硅？這里介紹一款工具R包---CytoTRACE眼刃，能夠輔助擬時(shí)單細(xì)胞推斷起點(diǎn)。其實(shí)這個(gè)包之前就有小伙伴推薦讓寫(xiě)一下摇肌，因?yàn)楹芎?jiǎn)單擂红，一直沒(méi)有寫(xiě)，最近剛好用到围小，所以出一期昵骤！
CytoTRACE包官網(wǎng)：https://cytotrace.stanford.edu/
包下載地址：https://cytotrace.stanford.edu/CytoTRACE_0.3.3.tar.gz
具體的原理感興趣的可看看作者的原文。首先需要說(shuō)的是這個(gè)包的安裝肯适。這個(gè)包有兩個(gè)功能变秦，一個(gè)是單個(gè)數(shù)據(jù)集的分析，另一個(gè)功能是多個(gè)數(shù)據(jù)集的分析框舔。第二個(gè)功能需要依賴(lài)于python包蹦玫，所以如果實(shí)在windows系統(tǒng)下赎婚，python包安裝不成功的話第二個(gè)功能則無(wú)法使用，但是一般情況下也涉及不到多個(gè)數(shù)據(jù)集樱溉，所以我們這里的例子就不瞎折騰了挣输，只需要第一個(gè)功能可以使用即可。這個(gè)包的安裝需本地安裝饺窿，在之前的鏈接中下載安裝包：https://cytotrace.stanford.edu/CytoTRACE_0.3.3.tar.gz
setwd('D:/KS項(xiàng)目/公眾號(hào)文章/CytoTRACE包推斷擬時(shí)起點(diǎn)輔助')
#CytoTRACE包
#官網(wǎng)：https://cytotrace.stanford.edu/
#包下載地址：https://cytotrace.stanford.edu/CytoTRACE_0.3.3.tar.gz
#安裝包
#包的安裝需下載安裝包歧焦、本地安裝即可
#安裝error
# ERROR: dependencies 'HiClimR', 'ccaPP', 'nnls' are not available for package 'CytoTRACE'
# * removing 'C:/Users/tq199/AppData/Local/R/win-library/4.2/CytoTRACE'
# Warning in install.packages :
#install.packages() 安裝這個(gè)幾個(gè)包
library(CytoTRACE)
# No non-system installation of Python could be found.
# Would you like to download and install Miniconda?
# Miniconda is an open source environment management system for Python.
# See https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html for more details.
#因?yàn)镃ytoTRACE依賴(lài)兩個(gè)python包scanoramaCT和numpy移斩，所以R安裝肚医，library的時(shí)候，會(huì)有上面的提醒向瓷。
#安裝conda什么的肠套。windsows下設(shè)置python環(huán)境什么的太復(fù)雜，為了一個(gè)包折騰不值得猖任，所以選擇no你稚。
#那么結(jié)果是這個(gè)包 多數(shù)據(jù)集分析的功能不能使用，不過(guò)沒(méi)關(guān)系朱躺，一般我們也都是但數(shù)據(jù)集刁赖。
#當(dāng)然，你也可以嘗試安裝python包长搀，但是不一定成功
install.packages("reticulate")
library(reticulate)
conda_create("cytoTRACE",python_version = '3.7')
use_condaenv("cytoTRACE")
conda_install("cytoTRACE", "numpy")
conda_install("cytoTRACE", "scanoramaCT")
我們測(cè)試一下宇弛，用之前作用monocle的mouse data進(jìn)行分析：CytoTRACE分析很簡(jiǎn)單，輸入用單細(xì)胞count矩陣源请，可視化結(jié)合metadata枪芒。
mouse_data <- readRDS("D:/KS項(xiàng)目/公眾號(hào)文章/monocle3擬時(shí)分析/mouse_data.rds")
exp1 <- as.matrix(mouse_data@assays$RNA@counts)
exp1 <- exp1[apply(exp1 > 0,1,sum) >= 5,]
results <- CytoTRACE(exp1,ncores = 1)
phenot <- mouse_data$celltype
phenot <- as.character(phenot)
names(phenot) <- rownames(mouse_data@meta.data)
emb <- mouse_data@reductions[["umap"]]@cell.embeddings
plotCytoTRACE(results, phenotype = phenot, emb = emb, outputDir = './')
plotCytoGenes(results, numOfGenes = 30, outputDir = './')
從結(jié)果上可以看到，PMN0和7的CytoTRACE評(píng)分最高谁尸，代表分化程度低舅踪，推斷為這個(gè)細(xì)胞數(shù)據(jù)集中細(xì)胞的起點(diǎn)。CytoTRACE分析也返回了CytoTRACE評(píng)分文件良蛮，我們可以讀取這個(gè)文件抽碌，然后自己做圖（這里我標(biāo)注的反了，不想改了）决瞳。
cyto <- read.table("CytoTRACE_plot_table.txt");head(cyto)
cutoff <- quantile(cyto$CytoTRACE, 0.75)
cyto$diff <- "low"
cyto[cyto$CytoTRACE > cutoff, ]$diff <- "high"
ggplot(cyto, aes(Component1, Component2, color = diff)) +
geom_point(size = 1.5, alpha = 1.0)
當(dāng)然了咬展，很多時(shí)候，我們已經(jīng)做完了monocle分析瞒斩，例如已經(jīng)完成了ordercell這一步驟破婆，那么我們可以直接將CytoTRACE分析及可視化應(yīng)用在monocle對(duì)象上，看起來(lái)更加直觀胸囱。首先我們看看monocle默認(rèn)的結(jié)果祷舀。可以看到，擬時(shí)軌跡與CytoTRACE是相反的裳扯，這和之前有人說(shuō)的抛丽，一般情況下，monocle2的擬時(shí)軌跡是反的饰豺，這里不謀而合了亿鲜。
mouse_monocle <- readRDS("D:/KS項(xiàng)目/公眾號(hào)文章/monocle2擬時(shí)結(jié)果個(gè)性化作圖/mouse_monocle.rds")
p1=plot_cell_trajectory(mouse_monocle,color_by='Pseudotime')
p2=plot_cell_trajectory(mouse_monocle,color_by='celltype')
p1+p2
后面的分析和之前在seurat對(duì)象上的一樣。
monocle_meta <- data.frame(t(mouse_monocle@reducedDimS),
mouse_monocle$Pseudotime,
mouse_monocle$State,
mouse_monocle$celltype)
colnames(monocle_meta) <- c("C1", "C2", "Pseudotime", "State", "celltype")
phenot1 <- monocle_meta$celltype
phenot1 <- as.character(phenot1)
names(phenot1) <- rownames(monocle_meta)
emb_monocle <- monocle_meta[,1:2]
plotCytoTRACE(results, phenotype = phenot, emb = emb_monocle, outputDir = './monocle/')
既然這個(gè)CytoTRACE包有很多高分文章使用冤吨，那么我們檢測(cè)一下可信度蒿柳。我們使用之前一篇Nature文章中的數(shù)據(jù)。這篇文章進(jìn)行了monocle軌跡分析漩蟆，但是沒(méi)有使用CytoTRACE包垒探，作者按照自己的生物學(xué)背景和實(shí)際數(shù)據(jù)推斷的起點(diǎn)，所以我們用他的數(shù)據(jù)tset一下他的結(jié)果怠李。一方面test Nature的結(jié)果圾叼，一方面test CytoTRACE包的結(jié)果。
#提取亞群
load("D:/KS項(xiàng)目/公眾號(hào)文章/CytoTRACE包推斷擬時(shí)起點(diǎn)輔助/sce.RData")
sce_sub <- sce1[,sce1$cluster %in% c("YSMP","GMP","Myeloblast","Monocyte")]
#直接用CytoTRACE分析看一下這幾個(gè)細(xì)胞它推斷的起點(diǎn)
sce_subExp <- as.matrix(sce_sub@assays$RNA@counts)
results <- CytoTRACE(sce_subExp,ncores = 1)
sce_subphenot <- sce_sub$cluster
sce_subphenot <- as.character(sce_subphenot)
names(sce_subphenot) <- rownames(sce_sub@meta.data)
sce_subemb <- sce_sub@reductions[["umap"]]@cell.embeddings
plotCytoTRACE(results, phenotype = sce_subphenot, emb = sce_subemb, outputDir = './test/')
（reference：Deciphering human macrophage development at single-cell resolution）
等等等等。髓介。惕鼓。。還沒(méi)有結(jié)束（彩蛋）：我們之前發(fā)布完monocle2終結(jié)版之后呢版保，我測(cè)試過(guò)分析不會(huì)有問(wèn)題了呜笑，可是很多小伙伴依然有問(wèn)題，這里我們干脆測(cè)試一下彻犁，不論是ordercell還是BEAM都沒(méi)有問(wèn)題叫胁。前面的分析我們就直接利用函數(shù)一鍵跑完分析！
run_monocle2 <- function(
inputobj,
assay,
slot
){
requireNamespace("Seurat")
data <- GetAssayData(inputobj, assay = assay, slot = slot)
data <- data[rowSums(as.matrix(data)) != 0,]
pd <- new("AnnotatedDataFrame", data = inputobj@meta.data)
fData <- data.frame(gene_short_name = row.names(data), row.names = row.names(data))
fd <- new("AnnotatedDataFrame", data = fData)
monocds <- newCellDataSet(data,
phenoData = pd,
featureData = fd,
expressionFamily=negbinomial.size())
monocds <- estimateSizeFactors(monocds)
monocds <- estimateDispersions(monocds)
monocds <- detectGenes(monocds, min_expr = 0.1)
print(head(fData(monocds)))
expressed_genes <- row.names(subset(fData(monocds), num_cells_expressed >= 50)) # nolint
monocds <- monocds[expressed_genes, ]
disp_table <- dispersionTable(monocds)
unsup_clustering_genes <- subset(
disp_table, mean_expression >= 0.05 &
dispersion_empirical >= 2 * dispersion_fit
) #
monocds <- setOrderingFilter(monocds, unsup_clustering_genes$gene_id)
monocds <- reduceDimension(
monocds,
max_components = 2,
method = "DDRTree"
)
monocds <- orderCells(monocds)
return(monocds)
}
cds = run_monocle2(sce_sub, assay = 'RNA', slot = 'counts')
plot_cell_trajectory(cds, color_by = 'cluster')
plot_cell_trajectory(cds, color_by = 'Pseudotime')
分析是沒(méi)有任何問(wèn)題的汞幢，結(jié)果因?yàn)榕c原文參數(shù)不一致驼鹅，有些出入，總體是一致的森篷。接下來(lái)输钩，我們做一下分支的BEAM分析。
BEAM_res <- BEAM(cds, branch_point = 1, cores = 2)
BEAM_res <- BEAM_res[order(BEAM_res$qval),]
BEAM_res <- BEAM_res[,c("gene_short_name", "pval", "qval")]
plot_genes_branched_heatmap(cds[row.names(subset(BEAM_res, qval < 1e-20)),],
branch_point = 1,
num_clusters = 4,
cores = 1,
use_gene_short_name = T,
show_rownames = T)
總之仲智，分析是不會(huì)有任何錯(cuò)誤的买乃，如果你安裝了monocle2終結(jié)解決版，還是出錯(cuò)钓辆，那么你需要考慮你是否正確安裝使用剪验，文件是否正確肴焊，或者有些R包版本的問(wèn)題。最后功戚，覺(jué)得分享對(duì)您有用的娶眷，點(diǎn)個(gè)贊再走唄！碼字不易啸臀！
