TUNEL方法（末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP-地高辛配基切口標記）源自完整固定的細胞核DNA 裂解部位標記（如Gavrieli et
al. 1992)优幸。 該法可用于組織切片灸姊、玻片上細胞生長鹃栽、流式細胞計量術分析褪测，用于組織切片的改進程序由Naik 及其合作者提出(Naik et
al. 1996) 速警，敘述如下
1、組織切片的TUNEL 染色
1）取下組織，立即用新制備的4％甲醛固定忿墅，室溫過夜。用多聚甲醛(EM 級）制備4％的甲醛溶液沮峡，在100 ml 水中加8g 多聚甲醛疚脐，在通風櫥中加熱至50 ~ 60℃．加幾滴1 moL/L NaOH 使固體全部溶解。 多聚甲醛全部溶解后邢疙，將溶液放冰上棍弄，迅速冷卻至室溫。加100 ml 2 的2 x PBS, 過濾固定液疟游。甲醛儲存液應在每次實驗前新配呼畸。
2) 通過50% 、70%颁虐、80% 蛮原、95% 、100％乙醇和100% 二甲苯系列孵育（每步5 分鐘）使組織脫水
3) 用石蠟包埋組織另绩，制備5μm厚的切片儒陨，固定于玻片上花嘶，將石蠟切片70℃加熱10分鐘或58 ~ 60℃加熱30 分鐘去除石蠟
4) 通過以下溶液進行系列轉移水合切片：二甲苯5 分鐘2 次， 96％乙醇3 分鐘2 次蹦漠，然后90% 椭员、80% 、70% 笛园、50 ％拆撼，雙蒸水各3 分鐘
5) 在冷的4％甲醛中后續(xù)固定切片5 分鐘，用pH7.2 的PBS 清洗3 次喘沿，每次5 分鐘
6) 室溫下用1 ~ 2 μg/ml 蛋白酶K 的10mmol/L Tris-HCI 溶液(pH8.0) 處理玻片10 分鐘闸度，用PBS 清洗3 次
7) 用0.5%H2O2的PBS 溶液室溫處理20 分鐘，封閉內(nèi)源過氧化物酶活性蚜印。
8) 用補充有150 mmol/L NaCl 和0.05% BSA 的TdT 反應緩沖液(GIBCO/BRL）預孵育切片莺禁。每個切片上加27 μl 溶液，用已裁成合適大小的Parafilm 膜覆蓋窄赋。
5x TdT 反應緩沖液
500 mmol/L 二甲胂酸鉀哟冬， pH7.2
l0 mmol/L CoCl2
l mmol/L DTT
9) 室溫孵育10 分鐘后，取下Parafilm 膜忆绰，用紙巾吸去水浩峡。
I0) 在用TdT 反應緩沖液制備的200 U/ml TdT 酶(GIBCO/BRL; 15 U/ml), 2 – 4
μmol／L地高辛配基偶聯(lián)的dUTP 中孵育切片，再用Parafilm 膜覆蓋切片错敢， 37℃ 濕室中30 分鐘～ 1 小時翰灾。用pH7.2
的PBS 將切片洗3 次。
11) 用5 U/ml 辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗地高辛孵育玻片稚茅，用Parafilm 膜覆蓋纸淮。37℃ 溫室中孵育30 分鐘
l2) 應用快速DAB 底物(Sigma) ，用DAB 和H2O2處理檢測標記細胞亚享。用過量水清洗切片咽块。可用甲基綠復染切片30 秒欺税。用過量水清洗侈沪。
13) 通過用二甲苯終洗2 次的系列乙醇使切片脫水。 用Permount 或Entallan介質固定晚凿，用光學顯微鏡分析
注意事項
TUNEL 陽性核被染成深棕色亭罪。如需要，在DAB 反應中可加人硫酸鎳(3 mg/ml) 晃虫〗粤茫可以增強染色扣墩，陽性核將呈現(xiàn)紫／黑色哲银。
TUNEL 染色的流式細胞計量術分析
1) 凋亡誘導之后扛吞， 200 g 離心5 分鐘收集1×106 懸浮細胞，用冷的PBS 洗2次荆责，重復離心
2) 用2 ml 2 ％的甲醛PBS 溶液(pH7.2滥比，用多聚甲醛新配）固定細胞沉淀，室溫下在水平搖床上孵育30 分鐘做院。
3) 200 g 離心5 分鐘沉淀細胞盲泛，用PBS 洗1 次。重復離心键耕。
4) 用500 μl 0.1 % Triton X-100, 0.1 ％檸檬酸鈉溶液4℃ 孵育2 分鐘透化細胞寺滚，用PBS 洗2次。
5) 在溫室中于TdT 緩沖液(30 mmol/L Tris-HCl, pH7.2 ,140 mmol/L 二鉀胂酸鈉）中用0. 3 nmol/LFITC-12-dUTP (Boehringer Mannheim) 屈雄、3 nmol/L dATP, 25 mmol/L CoCl2村视、25 U TdT (Boehringer Mannheim) 37℃孵育1 小時，進行TUNEL 反應酒奶，終體積50 μl
6) 37℃孵育1 小時后蚁孔，加人2μl 0.5 mol/L EDTA 終止反應，用pH7.2 的PBS 將細胞洗2次惋嚎。用帶有氬激光(488
run) 的流式細胞計量儀(FACScan, Becton Dickinson) 分析數(shù)據(jù)杠氢。或者另伍，可將細胞重懸于50μl
液體固定介質如FluoroGuard (Bio-Rad) 中鼻百，移到載玻片上，蓋上蓋玻片摆尝、用熒光顯微鏡分析愕宋。
注意事項
FACSsean 對TUNEL 標記的定量分析最好用于淋巴細胞，對貼壁細胞如成纖維細胞效果不夠好
貼壁細胞的TUNEL 染色
1) 用無菌鑷子將一無菌蓋玻片放入35 mm 培養(yǎng)皿中
2) 將大約1×104細胞接種于無菌蓋玻片上结榄，培養(yǎng)24 ~ 48 小時中贝。凋亡誘導時，細胞鋪滿不超過80% 臼朗，如細胞貼壁不太好邻寿，可以用纖連蛋自、聚賴氨酸或血清預處理蓋玻片视哑，以使細胞更好地貼壁生長
3) 誘導凋亡后绣否，用pH7.2 的PBS 輕輕洗細胞1 次，不要除去垂死細胞挡毅，用冰冷的甲醇（- 20℃） 固定10 分鐘
4) 室溫空氣干燥玻片5 分鐘蒜撮，在pH7.2 的PBS 中溫育10 分鐘重新水合
5) 按上述方法進行TUNEL 反應。將合適的Parafilm 膜放入溫室，膜上加50μl TdT反應混合液段磨，放蓋玻片取逾，細胞朝下在反應液上。37℃ 孵育1 小時
6) 從溫室中取出蓋玻片苹支，放回35 mm 培養(yǎng)皿中砾隅。用PBS 洗細胞3 次，用固定液(Bio-Rad) 固定到載玻片上
