TUNEL方法(末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP-地高辛配基切口標記)源自完整固定的細胞核DNA 裂解部位標記(如Gavrieli et
al. 1992)优幸。 該法可用于組織切片灸姊、玻片上細胞生長鹃栽、流式細胞計量術分析褪测,用于組織切片的改進程序由Naik 及其合作者提出(Naik et
al. 1996) 速警,敘述如下
1、組織切片的TUNEL 染色
1)取下組織,立即用新制備的4%甲醛固定忿墅,室溫過夜。用多聚甲醛(EM 級)制備4%的甲醛溶液沮峡,在100 ml 水中加8g 多聚甲醛疚脐,在通風櫥中加熱至50 ~ 60℃.加幾滴1 moL/L NaOH 使固體全部溶解。 多聚甲醛全部溶解后邢疙,將溶液放冰上棍弄,迅速冷卻至室溫。加100 ml 2 的2 x PBS, 過濾固定液疟游。甲醛儲存液應在每次實驗前新配呼畸。
2) 通過50% 、70%颁虐、80% 蛮原、95% 、100%乙醇和100% 二甲苯系列孵育(每步5 分鐘)使組織脫水
3) 用石蠟包埋組織另绩,制備5μm厚的切片儒陨,固定于玻片上花嘶,將石蠟切片70℃加熱10分鐘或58 ~ 60℃加熱30 分鐘去除石蠟
4) 通過以下溶液進行系列轉移水合切片:二甲苯5 分鐘2 次, 96%乙醇3 分鐘2 次蹦漠,然后90% 椭员、80% 、70% 笛园、50 %拆撼,雙蒸水各3 分鐘
5) 在冷的4%甲醛中后續(xù)固定切片5 分鐘,用pH7.2 的PBS 清洗3 次喘沿,每次5 分鐘
6) 室溫下用1 ~ 2 μg/ml 蛋白酶K 的10mmol/L Tris-HCI 溶液(pH8.0) 處理玻片10 分鐘闸度,用PBS 清洗3 次
7) 用0.5%H2O2的PBS 溶液室溫處理20 分鐘,封閉內(nèi)源過氧化物酶活性蚜印。
8) 用補充有150 mmol/L NaCl 和0.05% BSA 的TdT 反應緩沖液(GIBCO/BRL)預孵育切片莺禁。每個切片上加27 μl 溶液,用已裁成合適大小的Parafilm 膜覆蓋窄赋。
5x TdT 反應緩沖液
500 mmol/L 二甲胂酸鉀哟冬, pH7.2
l0 mmol/L CoCl2
l mmol/L DTT
9) 室溫孵育10 分鐘后,取下Parafilm 膜忆绰,用紙巾吸去水浩峡。
I0) 在用TdT 反應緩沖液制備的200 U/ml TdT 酶(GIBCO/BRL; 15 U/ml), 2 – 4
μmol/L地高辛配基偶聯(lián)的dUTP 中孵育切片,再用Parafilm 膜覆蓋切片错敢, 37℃ 濕室中30 分鐘~ 1 小時翰灾。用pH7.2
的PBS 將切片洗3 次。
11) 用5 U/ml 辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗地高辛孵育玻片稚茅,用Parafilm 膜覆蓋纸淮。37℃ 溫室中孵育30 分鐘
l2) 應用快速DAB 底物(Sigma) ,用DAB 和H2O2處理檢測標記細胞亚享。用過量水清洗切片咽块。可用甲基綠復染切片30 秒欺税。用過量水清洗侈沪。
13) 通過用二甲苯終洗2 次的系列乙醇使切片脫水。 用Permount 或Entallan介質固定晚凿,用光學顯微鏡分析
注意事項
TUNEL 陽性核被染成深棕色亭罪。如需要,在DAB 反應中可加人硫酸鎳(3 mg/ml) 晃虫〗粤茫可以增強染色扣墩,陽性核將呈現(xiàn)紫/黑色哲银。
TUNEL 染色的流式細胞計量術分析
1) 凋亡誘導之后扛吞, 200 g 離心5 分鐘收集1×106 懸浮細胞,用冷的PBS 洗2次荆责,重復離心
2) 用2 ml 2 %的甲醛PBS 溶液(pH7.2滥比,用多聚甲醛新配)固定細胞沉淀,室溫下在水平搖床上孵育30 分鐘做院。
3) 200 g 離心5 分鐘沉淀細胞盲泛,用PBS 洗1 次。重復離心键耕。
4) 用500 μl 0.1 % Triton X-100, 0.1 %檸檬酸鈉溶液4℃ 孵育2 分鐘透化細胞寺滚,用PBS 洗2次。
5) 在溫室中于TdT 緩沖液(30 mmol/L Tris-HCl, pH7.2 ,140 mmol/L 二鉀胂酸鈉)中用0. 3 nmol/LFITC-12-dUTP (Boehringer Mannheim) 屈雄、3 nmol/L dATP, 25 mmol/L CoCl2村视、25 U TdT (Boehringer Mannheim) 37℃孵育1 小時,進行TUNEL 反應酒奶,終體積50 μl
6) 37℃孵育1 小時后蚁孔,加人2μl 0.5 mol/L EDTA 終止反應,用pH7.2 的PBS 將細胞洗2次惋嚎。用帶有氬激光(488
run) 的流式細胞計量儀(FACScan, Becton Dickinson) 分析數(shù)據(jù)杠氢。或者另伍,可將細胞重懸于50μl
液體固定介質如FluoroGuard (Bio-Rad) 中鼻百,移到載玻片上,蓋上蓋玻片摆尝、用熒光顯微鏡分析愕宋。
注意事項
FACSsean 對TUNEL 標記的定量分析最好用于淋巴細胞,對貼壁細胞如成纖維細胞效果不夠好
貼壁細胞的TUNEL 染色
1) 用無菌鑷子將一無菌蓋玻片放入35 mm 培養(yǎng)皿中
2) 將大約1×104細胞接種于無菌蓋玻片上结榄,培養(yǎng)24 ~ 48 小時中贝。凋亡誘導時,細胞鋪滿不超過80% 臼朗,如細胞貼壁不太好邻寿,可以用纖連蛋自、聚賴氨酸或血清預處理蓋玻片视哑,以使細胞更好地貼壁生長
3) 誘導凋亡后绣否,用pH7.2 的PBS 輕輕洗細胞1 次,不要除去垂死細胞挡毅,用冰冷的甲醇(- 20℃) 固定10 分鐘
4) 室溫空氣干燥玻片5 分鐘蒜撮,在pH7.2 的PBS 中溫育10 分鐘重新水合
5) 按上述方法進行TUNEL 反應。將合適的Parafilm 膜放入溫室,膜上加50μl TdT反應混合液段磨,放蓋玻片取逾,細胞朝下在反應液上。37℃ 孵育1 小時
6) 從溫室中取出蓋玻片苹支,放回35 mm 培養(yǎng)皿中砾隅。用PBS 洗細胞3 次,用固定液(Bio-Rad) 固定到載玻片上