TUNEL分析

TUNEL方法(末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP-地高辛配基切口標記)源自完整固定的細胞核DNA 裂解部位標記(如Gavrieli et

al. 1992)优幸。 該法可用于組織切片灸姊、玻片上細胞生長鹃栽、流式細胞計量術分析褪测,用于組織切片的改進程序由Naik 及其合作者提出(Naik et

al. 1996) 速警,敘述如下

1、組織切片的TUNEL 染色

1)取下組織,立即用新制備的4%甲醛固定忿墅,室溫過夜。用多聚甲醛(EM 級)制備4%的甲醛溶液沮峡,在100 ml 水中加8g 多聚甲醛疚脐,在通風櫥中加熱至50 ~ 60℃.加幾滴1 moL/L NaOH 使固體全部溶解。 多聚甲醛全部溶解后邢疙,將溶液放冰上棍弄,迅速冷卻至室溫。加100 ml 2 的2 x PBS, 過濾固定液疟游。甲醛儲存液應在每次實驗前新配呼畸。

2) 通過50% 、70%颁虐、80% 蛮原、95% 、100%乙醇和100% 二甲苯系列孵育(每步5 分鐘)使組織脫水

3) 用石蠟包埋組織另绩,制備5μm厚的切片儒陨,固定于玻片上花嘶,將石蠟切片70℃加熱10分鐘或58 ~ 60℃加熱30 分鐘去除石蠟

4) 通過以下溶液進行系列轉移水合切片:二甲苯5 分鐘2 次, 96%乙醇3 分鐘2 次蹦漠,然后90% 椭员、80% 、70% 笛园、50 %拆撼,雙蒸水各3 分鐘

5) 在冷的4%甲醛中后續(xù)固定切片5 分鐘,用pH7.2 的PBS 清洗3 次喘沿,每次5 分鐘

6) 室溫下用1 ~ 2 μg/ml 蛋白酶K 的10mmol/L Tris-HCI 溶液(pH8.0) 處理玻片10 分鐘闸度,用PBS 清洗3 次

7) 用0.5%H2O2的PBS 溶液室溫處理20 分鐘,封閉內(nèi)源過氧化物酶活性蚜印。

8) 用補充有150 mmol/L NaCl 和0.05% BSA 的TdT 反應緩沖液(GIBCO/BRL)預孵育切片莺禁。每個切片上加27 μl 溶液,用已裁成合適大小的Parafilm 膜覆蓋窄赋。

5x TdT 反應緩沖液

500 mmol/L 二甲胂酸鉀哟冬, pH7.2

l0 mmol/L CoCl2

l mmol/L DTT

9) 室溫孵育10 分鐘后,取下Parafilm 膜忆绰,用紙巾吸去水浩峡。

I0) 在用TdT 反應緩沖液制備的200 U/ml TdT 酶(GIBCO/BRL; 15 U/ml), 2 – 4

μmol/L地高辛配基偶聯(lián)的dUTP 中孵育切片,再用Parafilm 膜覆蓋切片错敢, 37℃ 濕室中30 分鐘~ 1 小時翰灾。用pH7.2

的PBS 將切片洗3 次。

11) 用5 U/ml 辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗地高辛孵育玻片稚茅,用Parafilm 膜覆蓋纸淮。37℃ 溫室中孵育30 分鐘

l2) 應用快速DAB 底物(Sigma) ,用DAB 和H2O2處理檢測標記細胞亚享。用過量水清洗切片咽块。可用甲基綠復染切片30 秒欺税。用過量水清洗侈沪。

13) 通過用二甲苯終洗2 次的系列乙醇使切片脫水。 用Permount 或Entallan介質固定晚凿,用光學顯微鏡分析

注意事項

TUNEL 陽性核被染成深棕色亭罪。如需要,在DAB 反應中可加人硫酸鎳(3 mg/ml) 晃虫〗粤茫可以增強染色扣墩,陽性核將呈現(xiàn)紫/黑色哲银。

TUNEL 染色的流式細胞計量術分析

1) 凋亡誘導之后扛吞, 200 g 離心5 分鐘收集1×106 懸浮細胞,用冷的PBS 洗2次荆责,重復離心

2) 用2 ml 2 %的甲醛PBS 溶液(pH7.2滥比,用多聚甲醛新配)固定細胞沉淀,室溫下在水平搖床上孵育30 分鐘做院。

3) 200 g 離心5 分鐘沉淀細胞盲泛,用PBS 洗1 次。重復離心键耕。

4) 用500 μl 0.1 % Triton X-100, 0.1 %檸檬酸鈉溶液4℃ 孵育2 分鐘透化細胞寺滚,用PBS 洗2次。

5) 在溫室中于TdT 緩沖液(30 mmol/L Tris-HCl, pH7.2 ,140 mmol/L 二鉀胂酸鈉)中用0. 3 nmol/LFITC-12-dUTP (Boehringer Mannheim) 屈雄、3 nmol/L dATP, 25 mmol/L CoCl2村视、25 U TdT (Boehringer Mannheim) 37℃孵育1 小時,進行TUNEL 反應酒奶,終體積50 μl

6) 37℃孵育1 小時后蚁孔,加人2μl 0.5 mol/L EDTA 終止反應,用pH7.2 的PBS 將細胞洗2次惋嚎。用帶有氬激光(488

run) 的流式細胞計量儀(FACScan, Becton Dickinson) 分析數(shù)據(jù)杠氢。或者另伍,可將細胞重懸于50μl

液體固定介質如FluoroGuard (Bio-Rad) 中鼻百,移到載玻片上,蓋上蓋玻片摆尝、用熒光顯微鏡分析愕宋。

注意事項

FACSsean 對TUNEL 標記的定量分析最好用于淋巴細胞,對貼壁細胞如成纖維細胞效果不夠好

貼壁細胞的TUNEL 染色

1) 用無菌鑷子將一無菌蓋玻片放入35 mm 培養(yǎng)皿中

2) 將大約1×104細胞接種于無菌蓋玻片上结榄,培養(yǎng)24 ~ 48 小時中贝。凋亡誘導時,細胞鋪滿不超過80% 臼朗,如細胞貼壁不太好邻寿,可以用纖連蛋自、聚賴氨酸或血清預處理蓋玻片视哑,以使細胞更好地貼壁生長

3) 誘導凋亡后绣否,用pH7.2 的PBS 輕輕洗細胞1 次,不要除去垂死細胞挡毅,用冰冷的甲醇(- 20℃) 固定10 分鐘

4) 室溫空氣干燥玻片5 分鐘蒜撮,在pH7.2 的PBS 中溫育10 分鐘重新水合

5) 按上述方法進行TUNEL 反應。將合適的Parafilm 膜放入溫室,膜上加50μl TdT反應混合液段磨,放蓋玻片取逾,細胞朝下在反應液上。37℃ 孵育1 小時

6) 從溫室中取出蓋玻片苹支,放回35 mm 培養(yǎng)皿中砾隅。用PBS 洗細胞3 次,用固定液(Bio-Rad) 固定到載玻片上

?著作權歸作者所有,轉載或內(nèi)容合作請聯(lián)系作者
  • 序言:七十年代末债蜜,一起剝皮案震驚了整個濱河市晴埂,隨后出現(xiàn)的幾起案子,更是在濱河造成了極大的恐慌寻定,老刑警劉巖儒洛,帶你破解...
    沈念sama閱讀 222,681評論 6 517
  • 序言:濱河連續(xù)發(fā)生了三起死亡事件,死亡現(xiàn)場離奇詭異狼速,居然都是意外死亡晶丘,警方通過查閱死者的電腦和手機,發(fā)現(xiàn)死者居然都...
    沈念sama閱讀 95,205評論 3 399
  • 文/潘曉璐 我一進店門唐含,熙熙樓的掌柜王于貴愁眉苦臉地迎上來浅浮,“玉大人,你說我怎么就攤上這事捷枯」鲋龋” “怎么了?”我有些...
    開封第一講書人閱讀 169,421評論 0 362
  • 文/不壞的土叔 我叫張陵淮捆,是天一觀的道長郁油。 經(jīng)常有香客問我,道長攀痊,這世上最難降的妖魔是什么桐腌? 我笑而不...
    開封第一講書人閱讀 60,114評論 1 300
  • 正文 為了忘掉前任,我火速辦了婚禮苟径,結果婚禮上案站,老公的妹妹穿的比我還像新娘。我一直安慰自己棘街,他們只是感情好蟆盐,可當我...
    茶點故事閱讀 69,116評論 6 398
  • 文/花漫 我一把揭開白布。 她就那樣靜靜地躺著遭殉,像睡著了一般石挂。 火紅的嫁衣襯著肌膚如雪。 梳的紋絲不亂的頭發(fā)上险污,一...
    開封第一講書人閱讀 52,713評論 1 312
  • 那天痹愚,我揣著相機與錄音,去河邊找鬼。 笑死拯腮,一個胖子當著我的面吹牛窖式,可吹牛的內(nèi)容都是我干的。 我是一名探鬼主播疾瓮,決...
    沈念sama閱讀 41,170評論 3 422
  • 文/蒼蘭香墨 我猛地睜開眼脖镀,長吁一口氣:“原來是場噩夢啊……” “哼飒箭!你這毒婦竟也來了狼电?” 一聲冷哼從身側響起,我...
    開封第一講書人閱讀 40,116評論 0 277
  • 序言:老撾萬榮一對情侶失蹤弦蹂,失蹤者是張志新(化名)和其女友劉穎肩碟,沒想到半個月后,有當?shù)厝嗽跇淞掷锇l(fā)現(xiàn)了一具尸體凸椿,經(jīng)...
    沈念sama閱讀 46,651評論 1 320
  • 正文 獨居荒郊野嶺守林人離奇死亡削祈,尸身上長有42處帶血的膿包…… 初始之章·張勛 以下內(nèi)容為張勛視角 年9月15日...
    茶點故事閱讀 38,714評論 3 342
  • 正文 我和宋清朗相戀三年,在試婚紗的時候發(fā)現(xiàn)自己被綠了脑漫。 大學時的朋友給我發(fā)了我未婚夫和他白月光在一起吃飯的照片髓抑。...
    茶點故事閱讀 40,865評論 1 353
  • 序言:一個原本活蹦亂跳的男人離奇死亡,死狀恐怖优幸,靈堂內(nèi)的尸體忽然破棺而出吨拍,到底是詐尸還是另有隱情,我是刑警寧澤网杆,帶...
    沈念sama閱讀 36,527評論 5 351
  • 正文 年R本政府宣布羹饰,位于F島的核電站,受9級特大地震影響碳却,放射性物質發(fā)生泄漏队秩。R本人自食惡果不足惜,卻給世界環(huán)境...
    茶點故事閱讀 42,211評論 3 336
  • 文/蒙蒙 一昼浦、第九天 我趴在偏房一處隱蔽的房頂上張望馍资。 院中可真熱鬧,春花似錦关噪、人聲如沸迷帜。這莊子的主人今日做“春日...
    開封第一講書人閱讀 32,699評論 0 25
  • 文/蒼蘭香墨 我抬頭看了看天上的太陽戏锹。三九已至,卻和暖如春火诸,著一層夾襖步出監(jiān)牢的瞬間锦针,已是汗流浹背。 一陣腳步聲響...
    開封第一講書人閱讀 33,814評論 1 274
  • 我被黑心中介騙來泰國打工, 沒想到剛下飛機就差點兒被人妖公主榨干…… 1. 我叫王不留奈搜,地道東北人悉盆。 一個月前我還...
    沈念sama閱讀 49,299評論 3 379
  • 正文 我出身青樓,卻偏偏與公主長得像馋吗,于是被迫代替她去往敵國和親焕盟。 傳聞我的和親對象是個殘疾皇子,可洞房花燭夜當晚...
    茶點故事閱讀 45,870評論 2 361

推薦閱讀更多精彩內(nèi)容