hello，大家好，今天我們要繼續(xù)分享單細(xì)胞空間聯(lián)合分析的部分路幸，參考文章在High Resolution Single Cell Maps Reveals Distinct Cell Organization and Function Across Different Regions of the Human Intestine辞做，運用單細(xì)胞空間的聯(lián)合分析來解析人類的腸道莺掠，非常值得借鑒。

需要注意的分析內(nèi)容

• 空間細(xì)胞密度
• 空間細(xì)胞“社區(qū)”，也就是細(xì)胞單元
• 單細(xì)胞與ATAC的聯(lián)合分析
• 空間臨近通訊分析
• 細(xì)胞類型的距離變化

Abstract

結(jié)腸是一個復(fù)雜的器官砂心，可促進(jìn)消化懈词、提取營養(yǎng)、參與免疫監(jiān)視辩诞、與微生物群保持重要的共生關(guān)系坎弯，并影響整體健康。為了更好地了解其在單細(xì)胞水平上的組織躁倒、功能和調(diào)節(jié)荞怒，研究對四個donors的八個不同腸道部位進(jìn)行了 CODEX 多重成像，以及單核 RNA 和開放染色質(zhì)分析秧秉。通過系統(tǒng)分析褐桌，發(fā)現(xiàn)不同腸道區(qū)域的細(xì)胞組成存在顯著差異，證明上皮亞型的復(fù)雜性象迎，并發(fā)現(xiàn)相同的細(xì)胞類型被組織成不同的鄰域和群落荧嵌，突出了腸道中存在的不同免疫生態(tài)位。研究還繪制了這些細(xì)胞中暗示調(diào)節(jié)分化級聯(lián)的基因調(diào)控差異砾淌，并將腸道疾病遺傳性與特定細(xì)胞類型相關(guān)聯(lián)啦撮。這些結(jié)果描述了該器官細(xì)胞組成、調(diào)控和組織的復(fù)雜性汪厨，并作為了解人類生物學(xué)和疾病的重要參考圖譜赃春。

Introduction

成人腸道系統(tǒng)是一個復(fù)雜的器官系統(tǒng)，由大約 22 英尺的小腸和 7 英尺的大腸組成劫乱。 該系統(tǒng)完成了從口腔和胃開始的消化過程织中，首先在小腸中吸收水分和小分子營養(yǎng)物質(zhì)（如糖類、單價離子和氨基酸）衷戈，然后在大腸中積累較大的分子狭吼，如纖維， 充當(dāng)厭氧發(fā)酵室殖妇，使這些復(fù)雜分子的進(jìn)一步分解和吸收以及合成（通常通過消化道微生物群）和其他營養(yǎng)素（如維生素）的吸收刁笙。
小腸本身在表型上是異質(zhì)的，由三個形態(tài)不同的區(qū)域組成：十二指腸谦趣、空腸和回腸疲吸。大腸同樣可以劃分為包括上升區(qū)、橫向區(qū)前鹅、下降區(qū)和乙狀區(qū)在內(nèi)的區(qū)域磅氨。這些解剖區(qū)域中的每一個都包含表型和形態(tài)不同的細(xì)胞類型的巨大多樣性。上皮細(xì)胞嫡纠、基質(zhì)細(xì)胞烦租、神經(jīng)細(xì)胞和免疫細(xì)胞延赌，每一種都由多種細(xì)胞類型組成，分布在整個腸道中叉橱；免疫細(xì)胞尤其令人感興趣挫以，因為它們與腸道中存在的微生物組和外來物質(zhì)相互作用。雖然這些廣泛的細(xì)胞類型對腸道系統(tǒng)的所有部分都是常見的窃祝，但已知特定細(xì)胞類型的流行表現(xiàn)出位置差異：例如掐松，已知潘氏細(xì)胞存在于小腸中，而腸內(nèi)分泌 L 細(xì)胞主要存在于回腸和大腸中粪小。此外大磺，這些細(xì)胞類型在這些腸道區(qū)域中被空間組織成不同的“鄰域”，這些鄰域的組成和潛在細(xì)胞類型的分子表型在這些解剖區(qū)域以相對未知的方式變化探膊。功能鄰域的組成和構(gòu)成這些鄰域的細(xì)胞狀態(tài)的分子特性的這些差異有望進(jìn)一步揭示構(gòu)建人類腸道的邏輯杠愧。
下面使用單核 RNA、開放染色質(zhì)和空間蛋白質(zhì)組學(xué)成像技術(shù)以單細(xì)胞分辨率繪制腸道的許多部分逞壁。以前的研究已經(jīng)使用單細(xì)胞 RNA 測序 (scRNA-Seq) 繪制了細(xì)胞類型圖流济，并對整個腸道的細(xì)胞類型進(jìn)行了表征。這里通過使用 CODEX（通過 indEXing 的 CODetection）對細(xì)胞和蛋白質(zhì)進(jìn)行空間映射來擴(kuò)展這項工作腌闯，以在空間上表征大約 120 萬個細(xì)胞绳瘟，以及使用 snATACseq 對開放染色質(zhì)進(jìn)行單細(xì)胞分析來映射基因調(diào)控信息。分析定義了整個腸道不同細(xì)胞類型的相對豐度姿骏，包括
腸道不同區(qū)域上皮細(xì)胞的巨大復(fù)雜性糖声，以及細(xì)胞組織成不同的多細(xì)胞結(jié)構(gòu)壁龕。分析還繪制了這些細(xì)胞中的基因調(diào)控差異分瘦，暗示了調(diào)控分化級聯(lián)姨丈。這些結(jié)果為了解這一復(fù)雜器官的細(xì)胞功能、調(diào)節(jié)和組織提供了重要見解擅腰，并為了解人類生物學(xué)和疾病提供了重要參考。

Results

Mapping the human intestine at single cell resolution

使用單核 RNA-Seq (snRNA-seq) 繪制了多個供體腸道中單細(xì)胞的細(xì)胞組成翁潘、調(diào)節(jié)信息和空間分布圖趁冈，測量單個細(xì)胞核中的核 RNA 轉(zhuǎn)錄物，單核 ATAC-Seq (snATAC-seq)拜马，測量單個細(xì)胞中的開放染色質(zhì)渗勘，以及 CODEX，用多達(dá) 54 個針對不同蛋白質(zhì)的抗體探針對同一組織切片進(jìn)行染色俩莽⊥梗總共分析了四個人的八個部分。 年齡范圍為 24 至 78 歲扮超。 八個區(qū)域（從胃開始的軌跡順序）是：十二指腸取刃、近端空腸蹋肮、中空腸和小腸回腸，以及大腸的升璧疗、橫坯辩、降和乙狀結(jié)腸區(qū)域。 The organs were procured from organ donors and were deemed to be of high quality by RNA quality measures崩侠。

CODEX Multiplexed Imaging of the Small Intestine and Colon

為了創(chuàng)建跨越八個不同區(qū)域的腸道空間圖漆魔，使用了 CODEX 多路成像。 CODEX 數(shù)據(jù)保留了細(xì)胞類型的空間坐標(biāo)却音，從而能夠洞察細(xì)胞相互作用改抡、多細(xì)胞組織單位的組成以及與腸道整體功能的空間關(guān)系。 這里首先針對一個受試者 (B001) 驗證并優(yōu)化了新鮮冷凍樣品的 CODEX 染色系瓢、成像和圖像處理阿纤。 將結(jié)腸和小腸的四個不同區(qū)域組合在同一張蓋玻片上，以最大限度地減少批次效應(yīng)八拱。

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• 注：CODEX multiplexed imaging of 8 regions from the small intestine and colon to create a single-cell map of the healthy human intestine. A) Schematic for how CODEX multiplexed imaging was performed on arrays of 4 different sections of either colon and small intestine from the same donor simultaneously. Image processing steps done to extract single-cell spatial data

使用 44 個標(biāo)記抗體panel染色并檢測了大約 16 mm² 切片的免疫細(xì)胞阵赠、基質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞以及多細(xì)胞鄰域。 確定了三種上皮細(xì)胞肌稻、六種免疫細(xì)胞和六種基質(zhì)細(xì)胞類型——導(dǎo)致腸道特征的兩種上皮細(xì)胞清蚀、三種免疫細(xì)胞和五種基質(zhì)多細(xì)胞鄰域.
已知上皮細(xì)胞亞型在空間上受到限制并且是腸道整體功能的關(guān)鍵； 因此爹谭，通過添加和驗證 17 種腸道特異性標(biāo)記物來擴(kuò)展我們的 CODEX 抗體panel枷邪。 類似地使用此更新的 54 抗體盤對來自三個額外供體的八個區(qū)域樣本進(jìn)行了成像，這使得能夠識別額外的 10 種細(xì)胞類型诺凡，例如 Paneth 和杯狀細(xì)胞东揣。 We propagated these cell type labels to two additional donors using the geometric deep learning method STELLAR that we developed for multiplexed spatial data.

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• 注：B) An example CODEX fluorescent image of one region of the small bowel (SB) for CODEX with 6/54 markers shown for one donor with C) accompanying cell type map following cell segmentation and unsupervised clustering.

使用這個結(jié)果數(shù)據(jù)集來比較不同組織區(qū)域的細(xì)胞組成和組織。 細(xì)胞類型由免疫腹泌、基質(zhì)和上皮分組分隔嘶卧，因為組織切片具有不均等的上皮或基質(zhì)成分代表。

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• 注： Cell type percentages from CODEX data averaged across 3 donors stained with an updated CODEX antibody panel. Cell types are normalized by stromal, immune, and epithelial compartments. Asterix indicates p-value less than 0.05 difference in cell type percentage from the SB to the colon (CL)

觀察到基質(zhì)區(qū)室中細(xì)胞的表示沒有統(tǒng)計差異凉袱，這里不希望在我們的細(xì)胞類型分辨率內(nèi)看到血管化芥吟、神經(jīng)支配或肌肉層的重大差異。 在免疫區(qū)室中专甩，我們觀察到從小腸到結(jié)腸的 CD8⁺ T 細(xì)胞減少钟鸵，這與之前基于流式細(xì)胞術(shù)的觀察結(jié)果一致。 類似地涤躲，我們觀察到吸收性腸細(xì)胞減少棺耍，分泌性腸細(xì)胞（杯狀細(xì)胞和未成熟的杯狀細(xì)胞）增加，并且在從小腸移動到結(jié)腸時缺乏 Paneth 細(xì)胞种樱。 小腸和結(jié)腸不同區(qū)域的細(xì)胞類型組成比不同供體（同一區(qū)域）的差異更大蒙袍，providing confidence in the reproducibility of multiplexed imaging results.
細(xì)胞密度反映細(xì)胞是否在大范圍內(nèi)具有廣泛的功能俊卤，是否在空間上受限于特定的功能，或者是否需要特定的細(xì)胞間相互作用左敌。 此外瘾蛋，細(xì)胞密度的異常與炎癥性腸病 (IBD) 等疾病狀態(tài)有關(guān)。 由于腸道是體內(nèi)最大的免疫器官矫限，評估腸道中免疫細(xì)胞的定位和細(xì)胞相互作用對于理解口服疫苗設(shè)計哺哼、調(diào)節(jié)腸道微生物群的相互作用、調(diào)節(jié)過敏性食物反應(yīng)叼风、對傷口修復(fù)至關(guān)重要的軸和免疫系統(tǒng)至關(guān)重要取董。 癌癥的系統(tǒng)反應(yīng)和免疫療法.
三種免疫細(xì)胞類型（CD4⁺ T、CD8⁺ T 和漿細(xì)胞）的檢查顯示細(xì)胞密度存在明顯差異

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• 注： One representative cell type map with only plasma cells, CD4⁺ T cells, and CD8⁺ T cells shown无宿。

目視檢查表明茵汰，漿細(xì)胞具有最高的同種細(xì)胞類型密度，其次是 CD4⁺ T 細(xì)胞孽鸡，然后是 CD8⁺ T 細(xì)胞蹂午，它們通過黏膜區(qū)域最廣泛地擴(kuò)散。 我們通過計算給定細(xì)胞類型與其相同細(xì)胞類型的五個最近鄰居的平均距離并除以所有相同細(xì)胞在組織中均勻排列時的預(yù)期距離來量化這一觀察結(jié)果彬碱。

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• 注：Quantification of the same-cell density that is measured as an average distance of its 5 nearest same-cell neighbors divided by the most diffuse same-cell distance.

因此豆胸，接近 1 的分?jǐn)?shù)代表較低的相同細(xì)胞密度。 量化證實了我們的定性觀察巷疼，表明漿細(xì)胞密度最高 (~0.2)晚胡，其次是 CD4+ T 細(xì)胞 (~0.3)，然后是 CD8+ T 細(xì)胞 (~0.37)嚼沿。 CD4+ T 細(xì)胞的支持功能主要限于免疫細(xì)胞間相互作用估盘，而對于 CD8+ T 細(xì)胞的免疫監(jiān)視，我們預(yù)計分布會更廣泛骡尽。 有趣的是遣妥，這些密度在相似細(xì)胞類型之間的腸道中很大程度上是保守的。 這些結(jié)果表明免疫細(xì)胞亞型沿腸道長度的空間限制的重要作用攀细。

Multicellular Neighborhood Analysis of the Intestine

為了提供有關(guān)腸道細(xì)胞間相互作用箫踩、細(xì)胞密度和整體多細(xì)胞結(jié)構(gòu)的全局視圖，我們進(jìn)行了細(xì)胞鄰域分析 辨图。 簡而言之，該分析涉及 (i) taking windows of cells across the entire cell type map of a tissue with each cell as the center of a window, (ii) calculating the percentage of each cell type within this window, (iii) clustering these vectors, and (iv) assigning overall structure based on the average composition of the cluster肢藐。 對腸道 CODEX 數(shù)據(jù)的細(xì)胞鄰域分析揭示了 18 個重要的多細(xì)胞結(jié)構(gòu)故河，具有主要的上皮、基質(zhì)和基于免疫的鄰域吆豹。

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• 注：Multicellular neighborhood analysis of intestine. A) Neighborhood analysis was done by taking a window across cell type maps and vectorizing the percentage of cell types in each window, clustering windows, and assigning clusters as cellular neighborhoods of the intestine. B) 18 unique intestinal multicellular neighborhoods (y axis of heatmap) were defined by enriched cell types (x axis of heatmap) as compared to overall percentage of cell types in the samples鱼的。

與觀察到的漿細(xì)胞相同細(xì)胞密度高一致理盆，我們觀察到漿細(xì)胞密度增加驅(qū)動的漿細(xì)胞富集鄰域。 這種富含漿細(xì)胞的鄰域還表現(xiàn)出 CD4+ T 細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞（如樹突細(xì)胞和巨噬細(xì)胞）的共同富集凑阶。 這些觀察結(jié)果與最近的工作一致猿规，表明 CD28 與骨髓內(nèi)抗原呈遞細(xì)胞的漿細(xì)胞結(jié)合可以維持在血漿特異性壁龕中的長期存活。 此外宙橱，抗原呈遞細(xì)胞是 APRIL 的來源姨俩，在炎癥的情況下，APRIL 會促進(jìn)異位生發(fā)中心的形成和漿細(xì)胞浸潤师郑。 總的來說环葵，這些觀察結(jié)果表明抗原呈遞細(xì)胞在管理腸道漿細(xì)胞的上皮下生態(tài)位中的作用。

有趣的是宝冕，盡管與腸道中的其他細(xì)胞相比张遭，CD8+ T 細(xì)胞的相同細(xì)胞密度較低，但 CD8+ T 細(xì)胞在兩個主要區(qū)域中得到保守和富集地梨。這些鄰域之一（CD8+ T 富集的 IEL）表現(xiàn)出上皮細(xì)胞類型和 CD8+ T 細(xì)胞的富集菊卷。這些 CD8+ T 細(xì)胞通常被稱為上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞 (IEL)，它們是“前線士兵”宝剖，對于快速免疫反應(yīng)洁闰、防止感染（通過 MHCI 結(jié)合和細(xì)胞毒性）和維持上皮完整性（通過調(diào)節(jié)）至關(guān)重要上皮細(xì)胞增殖）。這些細(xì)胞的失調(diào)與 IBD 和乳糜瀉有關(guān)诈闺。然而渴庆，由于分離這些 T 細(xì)胞的挑戰(zhàn)，它們一直難以研究雅镊。這個富含 CD8+ T 的 IEL 社區(qū)是少數(shù)幾個從小腸 (~30%) 到結(jié)腸 (~3%) 流行率發(fā)生變化的社區(qū)之一襟雷。這種變化可能反映了抗原暴露的差異，因為小腸中的細(xì)胞暴露于膳食抗原的次數(shù)增加仁烹，而結(jié)腸中的細(xì)胞可能更多地暴露于腸道微生物群耸弄。

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• 注：an example of where neighborhoods are mapped back to the tissue to show overall tissue structures.

CD4+ T 細(xì)胞有助于腸道的 5 個不同的多細(xì)胞鄰域，包括內(nèi)濾泡卓缰、先天免疫富集计呈、漿細(xì)胞富集、適應(yīng)性免疫富集和外濾泡征唬。鑒于 CD4+ T 細(xì)胞協(xié)調(diào)先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)捌显，這種廣泛的社區(qū)成員資格是合適的。 CD4+ T 細(xì)胞总寒、B 細(xì)胞和 DC（樹突細(xì)胞）成員定義了兩種不同的基于濾泡的結(jié)構(gòu)扶歪。這些結(jié)構(gòu)中的第一個存在于毛囊的外部區(qū)域，表現(xiàn)出更高的 CD4+ T 細(xì)胞富集摄闸，而毛囊的內(nèi)部區(qū)域則富集了 B 細(xì)胞善镰。內(nèi)濾泡（即生發(fā)中心）鄰域的存在取決于完全成熟的淋巴濾泡妹萨，如圖像中的 Peyer 斑塊。然而炫欺，外卵泡鄰域在整個腸道中是恒定的富稻，并由富含外卵泡鄰域的 B 細(xì)胞慕淡、DC 和 CD4+ T 細(xì)胞定義躺屁，與內(nèi)卵泡結(jié)構(gòu)相比冤今。這些數(shù)據(jù)與之前定義腸道內(nèi)淋巴組織連續(xù)體的工作一致，其中較小的結(jié)構(gòu)（如隱斑）有可能發(fā)展成較大的卵泡毫别，尤其是在炎癥的情況下

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先前的研究還表明娃弓，小腸與結(jié)腸的淋巴濾泡發(fā)育存在差異。 通過比較小腸和結(jié)腸中的外濾泡鄰近細(xì)胞類型組成岛宦，我們觀察到台丛，雖然兩者都是由 CD4+ T 細(xì)胞的富集驅(qū)動的，但結(jié)腸的 B 細(xì)胞和 DC 的富集程度更高砾肺，而小腸則富集了 用于 CD8+ T 細(xì)胞挽霉、神經(jīng)和漿細(xì)胞。 這種結(jié)構(gòu)相似性由鄰域分析識別变汪，但也可以識別這些相似鄰域內(nèi)細(xì)胞組成的主要差異侠坎。

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• 注：Heatmap of enriched cell types for just the outer follicle neighborhood compared between SB and CL

我們接下來比較了小腸和結(jié)腸中所有鄰域組成的relative fold enrichment ，以創(chuàng)建鄰域差異的熱圖裙盾。該熱圖根據(jù)鄰域和細(xì)胞類型類別中的最大總差異進(jìn)行排名实胸，表明整個腸道具有最大保守性的鄰域，以及跨鄰域最保守的細(xì)胞類型番官。整個腸道的多細(xì)胞結(jié)構(gòu)保守表明一組細(xì)胞類型具有所需的功能庐完，而較少的保守表明核心功能以及基于解剖位置的組成靈活性的需要。我們發(fā)現(xiàn)內(nèi)部和外部卵泡結(jié)構(gòu)都不太保守徘熔，而基質(zhì)鄰域則更加保守门躯。我們還觀察到早期分泌上皮鄰域，在小腸中而不是在結(jié)腸中包含潘氏細(xì)胞酷师，是最不保守的鄰域——表明整個腸道有不同的隱窩微環(huán)境

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• 注：Difference in composition in neighborhood by cell type for all neighborhoods based on subtracting the fold enrichment in SB from CL.

Hierarchical Structural Analysis of Intestine and Mucosal Epithelial Compartment

多細(xì)胞鄰域分析揭示了整個腸道的結(jié)構(gòu)組成以及這些鄰域的組成的關(guān)鍵差異讶凉。 然而，這項分析并沒有揭示這些多細(xì)胞鄰域如何相互作用山孔，或者它們在組織中的空間結(jié)構(gòu)如何懂讯。 了解多細(xì)胞群之間的關(guān)系是定義組織組織層次和定義關(guān)鍵功能組織界面的關(guān)鍵。

使用多種方法研究了高階結(jié)構(gòu)組織台颠。 首先褐望，我們以類似于我們從細(xì)胞類型定義鄰域的方法的方式對鄰域組合的windows進(jìn)行聚類； 這產(chǎn)生了社區(qū)和社區(qū)的主要社區(qū)this generated and major of neighborhoods，并揭示了腸道的空間分層譬挚，從平滑肌、基質(zhì)和上皮區(qū)域內(nèi)移動酪呻。 有趣的是减宣，比較小腸和結(jié)腸之間免疫主要群落的定位顯示，與位于頂點的大腸相比玩荠，定位于上皮底部的差異定位可能反映了不同的微生物負(fù)荷漆腌。 此外，細(xì)胞鄰域向量的 tSNE 表示概括了整個組織結(jié)構(gòu)阶冈； 例如闷尿，主要的社區(qū)地圖顯示平滑肌和間質(zhì)鄰域非常接近，與位于上皮結(jié)構(gòu)之間的免疫鄰域相鄰
為了將空間組織的各個層次相互聯(lián)系起來女坑，我們創(chuàng)建了一個層次結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)圖

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• 注：Multi-level hierarchical structural description of small intestine and colon. A) Representation of multiple levels of hierarchical description: i) cell type, ii) multicellular neighborhood, iii) community (based on clustering windows of cell neighborhoods), and iv) major community (major types of communities) compared for the small bowel (SB) to the colon (CL). B) tSNE of neighborhood vectors with neighborhood, community, and major community labels projected. C) Graph of multi-level structure of the tissue as broken down by the different structures. Shapes correspond to structural level, colors represent individual categories, size of shapes represents the percent contribution to tissue, and the size of connected lines represents the overall contribution to the next level of structure as moving down the graph in increasing tissue structural hierarchy.

上圖C的每一層都通過其對這些高階結(jié)構(gòu)的主要貢獻(xiàn)者連接到下一層填具。使用這種直觀的intuitive formalism，我們觀察到基質(zhì)細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞類型和結(jié)構(gòu)之間的串?dāng)_匆骗，這些細(xì)胞類型和結(jié)構(gòu)又與上皮細(xì)胞和免疫成分分離劳景，這些成分彼此更加纏繞。此外碉就，上皮和免疫起源的主要社區(qū)在各個級別的組成上更加多樣化盟广。使用這種圖結(jié)構(gòu)，我們還可以觀察結(jié)構(gòu)之間的多層次關(guān)系瓮钥。例如筋量， 是多個社區(qū)的重要交叉點：proliferating transit amplifying zone,secretory epithelial, adaptive immune enriched, outer follicle, and innate immune enriched。因此碉熄，這表明這些重要的免疫富集區(qū)尚未成為更大的結(jié)構(gòu)化免疫卵泡桨武，它們在腸道分泌和轉(zhuǎn)運放大區(qū)的兩側(cè)具有專門的壁龕。
利用這種組織組織的分層解構(gòu)來檢查多細(xì)胞鄰域中的相互作用具被。 我們分離了由主要上皮和免疫組織社區(qū)定義的細(xì)胞玻募，并使用與我們的鄰域分析類似的原理來提取交互信息。 我們根據(jù)每個窗口中鄰域的百分比量化了鄰域圖中的窗口組成一姿。 然后七咧，我們不是對窗口組合向量進(jìn)行聚類，而是評估哪個鄰域組合至少占每個窗口中 85% 的鄰域叮叹，總結(jié)獨特的鄰域組合艾栋，并將這些結(jié)構(gòu)相互作用連接到小腸和結(jié)腸的網(wǎng)絡(luò)圖結(jié)構(gòu)中.

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• 注：Spatial context maps of SB and CL highlighting relationships of multicellular neighborhoods. This structure is defined by the number of unique neighborhoods required to make up at least 85% in a given window. This graph was constructed from only the epithelial and immune regions as defined by the major community labels of cells. Circles represent the number of cells represented by a given structure.

從該分析中，已經(jīng)注意到的組成差異很明顯蛉顽，其中成熟上皮和富含 CD8+ T 的 IEL 鄰域組合存在于小腸中蝗砾，但不存在于結(jié)腸中。在結(jié)腸中，早期分泌上皮區(qū)與其他幾個區(qū)相結(jié)合悼粮，包括增殖轉(zhuǎn)運放大區(qū)和漿細(xì)胞富集區(qū)闲勺。此外，漿細(xì)胞富集鄰域與許多鄰域相連扣猫，但通常與適應(yīng)性免疫富集鄰域共同富集菜循，小腸圖和結(jié)腸圖也共享該鄰域。從高分辨率圖像中粘膜區(qū)域的鄰域順序也可以看出漿細(xì)胞富集鄰域的互連性申尤。早期分泌和適應(yīng)性免疫區(qū)在隱窩底部富集癌幕，然后分泌細(xì)胞和漿細(xì)胞通過隱窩中部富集，然后是先天免疫和成熟上皮區(qū)昧穿∩自叮總之，分層映射數(shù)據(jù)進(jìn)一步證實了小腸和結(jié)腸之間多細(xì)胞結(jié)構(gòu)的組成差異时鸵，但也突出了保守的多細(xì)胞結(jié)構(gòu)相互作用和不同細(xì)胞類型在腸道亞區(qū)的重要分布胶逢。

Single-cell transcriptomic and chromatin analyses reveal cell composition differences across regions of the intestine

CODEX 揭示了細(xì)胞的不同組成及其在不同腸道區(qū)域的排列。 然而饰潜，CODEX 實驗僅包括 54 個探針宪塔，可能限制了可識別的細(xì)胞類型的數(shù)量和復(fù)雜性以及它們在腸道不同區(qū)域的分布。 為了克服這些限制并創(chuàng)建人類腸道的基因調(diào)控圖譜囊拜，我們在四個供體的八個腸道區(qū)域上生成了 156,119 個 snRNA-seq 和 153,997 個 snATAC-seq profiles 某筐。

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• 注：Single-cell atlas of gene expression and chromatin accessibility in the human intestine. A) Sections of the intestine from which cells were isolated for snRNA-seq and snATACseq

為了檢查腸道區(qū)域之間的整體差異，我們首先將來自腸道所有區(qū)域的細(xì)胞聚集在一起冠跷，發(fā)現(xiàn)來自所有區(qū)域的免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞聚集在一起南誊，而上皮細(xì)胞根據(jù)它們是從 1) 十二指腸或空腸中分離出來而分離，2 ) 回腸蜜托，或 3) 結(jié)腸抄囚。 我們接下來對來自腸道不同區(qū)域的免疫細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞進(jìn)行亞群橄务，揭示了總共 7 種免疫細(xì)胞幔托、13 種基質(zhì)細(xì)胞和 18 種上皮細(xì)胞類型。 通過檢查已知標(biāo)記基因的基因表達(dá)水平和基因活性評分以及使用先前發(fā)布的 scRNA-seq 數(shù)據(jù)標(biāo)記數(shù)據(jù)集來注釋細(xì)胞類型

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• 注： B) UMAP representation of all cells colored by the region of the intestine that they were isolated from as indicated in A. C, D) UMAP representation of all stromal (C) and immune (D) cells colored by cell type. E) Stacked bar plot representation of the fraction of total immune (top) and stromal (bottom) cells isolated from each region consisting of each cell type. F) UMAP representation of epithelial cells in the 4 primary regions of the intestine. Jejunum includes both proximal- and mid-jejunum samples. Colon includes samples from ascending, transverse, descending, and sigmoid colon. For all UMAP representations, snRNA is on the top and snATAC is on the bottom

在免疫區(qū)室中蜂挪，我們確定了 CD4+ 和 CD8+ T 細(xì)胞（CD2重挑、CD3E、IL7R棠涮、CD4谬哀、CD8）、B 細(xì)胞（PAX5严肪、MS4A1史煎、CD19）谦屑、漿細(xì)胞（IGLL5、AMPD1）篇梭、NK 細(xì)胞（SH2D1B）氢橙、snRNA 和 snATAC 數(shù)據(jù)集中的巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞 (CD14) 和肥大細(xì)胞（HDC、GATA2恬偷、TPSAB1）充蓝。 來自一個供體的 NK 和 T 細(xì)胞與 snRNA 數(shù)據(jù)中的其他 T 細(xì)胞分開聚集，這可能是因為該供體比本研究中的其他供體年輕得多（24 歲）喉磁。 大多數(shù)免疫細(xì)胞類型都在單核數(shù)據(jù)和 CODEX 數(shù)據(jù)中被識別，除了肥大細(xì)胞僅在單核數(shù)據(jù)中被識別官脓，樹突細(xì)胞和中性粒細(xì)胞僅在 CODEX 數(shù)據(jù)中被發(fā)現(xiàn) . 與 CODEX 實驗的結(jié)果相似协怒，一些免疫細(xì)胞類型在腸道中的含量不同。 例如卑笨，T 細(xì)胞在小腸中更普遍孕暇，而 B 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞在結(jié)腸中更常見.
在基質(zhì)隔室中，我們注釋了八種成纖維細(xì)胞亞型赤兴、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞妖滔、神經(jīng)元和內(nèi)皮細(xì)胞。 MYH11 和 ACTA2 高表達(dá)的細(xì)胞被歸類為平滑肌/肌成纖維細(xì)胞桶良。 我們還鑒定了具有高水平 WNT 激動劑的成纖維細(xì)胞座舍，例如被認(rèn)為存在于隱窩中的 RSPO3，以及具有高表達(dá) WNT5B 和 BMP 轉(zhuǎn)錄物的成纖維細(xì)胞被認(rèn)為存在于絨毛中陨帆。 與免疫細(xì)胞類似曲秉，我們觀察到了腸道細(xì)胞類型豐度的變化。 例如疲牵，平滑肌/肌成纖維細(xì)胞在十二指腸和空腸中含量最少承二，在回腸中含量中等，在結(jié)腸中含量最高纲爸。 相反亥鸠，絨毛成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞表現(xiàn)出相反的趨勢； 它們在十二指腸和空腸中含量最高识啦，在回腸中含量較低负蚊，在結(jié)腸的四個區(qū)域中含量最少.

鑒于上皮細(xì)胞最初是根據(jù)位置聚集在一起的，我們分別對來自不同主要位置（十二指腸颓哮、空腸盖桥、回腸和結(jié)腸）的上皮細(xì)胞進(jìn)行亞聚類和注釋。 在注釋細(xì)胞時题翻，我們觀察到不同腸道區(qū)域內(nèi)的相似細(xì)胞類型揩徊。 例如腰鬼，從干細(xì)胞到成熟吸收細(xì)胞（腸細(xì)胞）的分化軌跡在所有區(qū)域都很明顯。 我們將此分化軌跡劃分為先前在其他研究中定義的五種細(xì)胞類型（Stem>TA2>TA1>Imature Enterocyte>Enterocyte）塑荒。然而熄赡，我們觀察到這些細(xì)胞沿連續(xù)體存在，因此細(xì)胞類型的確切數(shù)量和位置 細(xì)胞類型之間的劃分在某種程度上是任意的齿税，并且在聚類過程中改變分辨率會導(dǎo)致沿著這條軌跡出現(xiàn)更多或更少的聚類彼硫。除了 absorptive cells收細(xì)胞吸外，我們還在腸道的所有區(qū)域觀察到了杯狀細(xì)胞凌箕、Best4+ 腸細(xì)胞拧篮、簇狀細(xì)胞和腸內(nèi)分泌細(xì)胞，盡管在小腸中觀察到的腸內(nèi)分泌細(xì)胞具有更大的多樣性牵舱，其中觀察到多個離散的cluster.正如預(yù)期的那樣串绩，與 CODEX 結(jié)果一致，在小腸的所有區(qū)域都觀察到了潘氏細(xì)胞芜壁，但在結(jié)腸中沒有發(fā)現(xiàn)礁凡。最后，十二指腸包含兩個在 snRNA 中鑒定的額外cluster和一個在 snATAC 數(shù)據(jù)集中鑒定的cluster慧妄。這些細(xì)胞與吸收細(xì)胞類型分開聚集顷牌，我們發(fā)現(xiàn) kegg 途徑粘蛋白型 O-聚糖生物合成富含這些細(xì)胞類型之一的標(biāo)記基因。在檢查這些cluster中的特定標(biāo)記基因時塞淹，我們發(fā)現(xiàn)一個cluster高表達(dá) MUC5B窟蓝，另一個cluster高表達(dá) MUC6 和 TFF2，表明這些可能是不同類型的粘蛋白產(chǎn)生細(xì)胞饱普，其中 MUC6+ 細(xì)胞可能代表這些細(xì)胞布倫納氏腺.

為了進(jìn)一步探索人體腸道中腸內(nèi)分泌細(xì)胞的多樣性疗锐，我們對來自腸道所有區(qū)域的腸內(nèi)分泌細(xì)胞進(jìn)行了subclustered，并根據(jù)腸內(nèi)分泌標(biāo)記基因的表達(dá)對cluster進(jìn)行了注釋费彼。我們鑒定了許多已知的腸內(nèi)分泌細(xì)胞亞型滑臊，包括 D 細(xì)胞（SST 高）、I 細(xì)胞（CCK 高）箍铲、K 細(xì)胞（GIP 高）雇卷、Mo 細(xì)胞（MLN 高）、S 細(xì)胞（SCT 高）和 L 細(xì)胞（PYY 高） ）颠猴。然而关划，我們還鑒定了多個腸嗜鉻細(xì)胞cluster，它們表達(dá) TPH1翘瓮，一種參與血清素合成的酶贮折。有一cluster腸內(nèi)分泌細(xì)胞不表達(dá)任何這些特定標(biāo)記，我們在subcluster數(shù)據(jù)集中將其標(biāo)記為腸內(nèi)分泌资盅。 L 細(xì)胞形成兩個不同的cluster调榄，其中一個具有高表達(dá)的 INSL5踊赠，我們將其標(biāo)記為 INSL5+ L 細(xì)胞。十二指腸中腸內(nèi)分泌和腸嗜鉻細(xì)胞的絕對數(shù)量最高每庆，其次是空腸筐带。我們觀察到沿著腸道的每個亞型腸內(nèi)分泌細(xì)胞的比例發(fā)生了巨大變化。例如缤灵，正如先前研究所預(yù)期的那樣伦籍，表達(dá) SST 的 D 細(xì)胞在十二指腸中最為豐富。在結(jié)腸中腮出，腸嗜鉻細(xì)胞和 L 細(xì)胞最為豐富帖鸦，沿結(jié)腸長度觀察到一些變化，包括遠(yuǎn)端結(jié)腸中 INSL5+ L 細(xì)胞的增加胚嘲。這些結(jié)果提供了關(guān)于腸內(nèi)分泌和腸嗜鉻細(xì)胞復(fù)雜性的非凡細(xì)節(jié)作儿，可能定義了新的腸嗜鉻細(xì)胞亞型，并描述了它們的種群如何沿腸道長度變化

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• 注： Regulatory transcription factors in the human intestine. A) Sub-clustering of enteroendocrine cells from all regions of the intestine. Cells are colored by cell types as defined in B. B) Fraction of all enteroendocrine cells in each region of the small intestine and colon made up of each enteroendocrine/enterochromaffin subtype.

Nominating Specific Molecular Interactions in Neighboring Cells

CODEX 數(shù)據(jù)支持分配相鄰細(xì)胞類型慢逾，snRNA-Seq 數(shù)據(jù)提供了在這些細(xì)胞中 RNA 水平表達(dá)的分子的描述。 通過結(jié)合這兩種數(shù)據(jù)類型灭红，我們可以指定可能促進(jìn)這些細(xì)胞類型的細(xì)胞間通訊的潛在配體受體對侣滩。
使用colocalization quotient來衡量細(xì)胞類型 A 優(yōu)先與細(xì)胞類型 B 相關(guān)的程度。我們確定了顯著的成對細(xì)胞類型共定位变擒，并專注于小腸和結(jié)腸之間顯著不同的那些君珠。 該分析確定了八種細(xì)胞類型對，它們在結(jié)腸中比小腸中更共定位娇斑； 六對涉及腸細(xì)胞策添、漿細(xì)胞、TA 和平滑肌毫缆。 涉及漿細(xì)胞的細(xì)胞類型對在降乙狀結(jié)腸組織切片中比在其他切片中更集中

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使用來自這六種細(xì)胞類型的 snRNA-Seq 數(shù)據(jù)唯竹，我們對配體和受體進(jìn)行了差異表達(dá)分析，并確定了 48 對在結(jié)腸中比在小腸中表達(dá)更多的配體和受體苦丁。 例如浸颓，我們發(fā)現(xiàn)配體 SEMA4D 和受體 MET 在結(jié)腸組織中的漿細(xì)胞和 TA2 中分別上調(diào)

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• 注：SEMA4D ligand expression in plasma cells and MET receptor gene expression in TA2 cells, showing higher expression in colon than small bowel.

這在小腸中未觀察到，并且在所有細(xì)胞類型對中僅以 4.1% 的比例表達(dá)旺拉。 SEMA4D 信號傳導(dǎo)與多種免疫疾病有關(guān)产上，并在細(xì)胞間通訊中發(fā)揮重要作用，特別是在 B 細(xì)胞聚集和長期存活中蛾狗。與小腸中的 TA2 細(xì)胞相比晋涣，MET 受體對結(jié)腸中 TA2 細(xì)胞的影響進(jìn)一步通過（i）對 MET 激活（包括 RAS 和 MAPK 信號傳導(dǎo)）的下游反應(yīng)的富集，以及（ii）已知的叢蛋白上調(diào)得到證實與信號素的高親和力相互作用并激活 MET沉桌。這種可能的相互作用與之前對不同漿細(xì)胞富集多細(xì)胞鄰域的 CODEX 多路復(fù)用成像數(shù)據(jù)的表征谢鹊、整個腸道的漿細(xì)胞富集鄰域的保護(hù)以及這些鄰域比較小腸和結(jié)腸的差異連接的特征一致算吩。因此，這表明維持結(jié)腸中富含漿細(xì)胞的鄰域存在潛在的差異存活信號撇贺《妮海總體而言，這些結(jié)果確定了潛在的配體-受體相互作用松嘶，這些相互作用介導(dǎo)了腸道不同區(qū)域的特定細(xì)胞類型相互作用艘狭，并為其他將空間多路復(fù)用成像數(shù)據(jù)與成對 snRNAseq 分析相結(jié)合的圖譜工作提供了模板。

Integration of snRNA and snATAC data nominates transcription factors regulating gene expression in different cell types

為了深入了解控制腸道分化的因素和事件翠订，我們接下來研究了調(diào)節(jié)不同腸道細(xì)胞類型基因表達(dá)的潛在轉(zhuǎn)錄因子 (TF)巢音。我們首先計算了數(shù)據(jù)集中每個細(xì)胞的 ChromVar 偏差分?jǐn)?shù) 41，這使我們能夠識別與不同細(xì)胞類型中染色質(zhì)可及性相關(guān)的 TF 基序尽超。由于許多 TF 具有相似的基序官撼，因此結(jié)合基序活性檢查 TF 表達(dá)有助于識別在不同腸細(xì)胞類型中起作用的特定 TF。為了檢查 TF 表達(dá)似谁，我們使用典型相關(guān)分析整合了 snRNA 和 snATAC 數(shù)據(jù)以對齊數(shù)據(jù)集并將 snRNA 數(shù)據(jù)分配給每個 snATAC 細(xì)胞傲绣。我們接下來確定了在其基因表達(dá)與其假定的 DNA 結(jié)合基序的染色質(zhì)可及性活動水平之間具有最高相關(guān)性的 TF，以提名直接驅(qū)動可及性變化的 TF巩踏。在整個腸道中秃诵，該分析揭示了 63 個具有與表達(dá)密切相關(guān)的基序活性的 TF（r>0.6）。從廣義上講塞琼，我們觀察到在分泌譜系中活躍的 TF 和在吸收譜系中活躍的 TF菠净，具有相對較小的子集參與兩者的 TF（例如結(jié)腸腸細(xì)胞中的 KLF4 和 ELF3 和整個腸道的杯狀細(xì)胞）。

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• 注：) Heatmap representation of transcription factors whose integrated gene expression was correlated with their motif activity in one region of the intestine. Row z-scores of ChromVar deviation scores are shown on the left and row z-scores of integrated TF expression are shown on the left.

該分析突出了許多已知在腸道中發(fā)揮重要作用的 TF彪杉。例如毅往，ASCL2，一種腸道干細(xì)胞的主要調(diào)節(jié)因子派近，在干細(xì)胞中表現(xiàn)出其基序的高表達(dá)和可及性攀唯。在干細(xì)胞中具有高表達(dá)和基序活性的其他 TF 包括 NFIX、NFIA渴丸、NFIC 和 HNF1B革答。在分泌譜系中，POU2F3 是小鼠簇狀細(xì)胞發(fā)育所必需的調(diào)節(jié)劑曙强，在整個人類腸道的簇狀細(xì)胞中高度表達(dá)并具有高基序活性残拐。與 POU2F3 一起，RUNX1 和 RUNX2 在整個腸道的簇狀細(xì)胞中也表現(xiàn)出高表達(dá)和可接近性碟嘴。在杯狀細(xì)胞中溪食，KLF4 是小鼠終末分化為結(jié)腸杯狀細(xì)胞所必需的，表現(xiàn)出高基因表達(dá)和基序活性娜扇。令人驚訝的是错沃，KLF4 的表達(dá)和基序活性在結(jié)腸中分化的吸收性上皮細(xì)胞（未成熟的腸上皮細(xì)胞和腸上皮細(xì)胞）中也很高栅组，但在腸道的其他區(qū)域則不然，表明位置特異性調(diào)節(jié)枢析。在腸內(nèi)分泌/腸嗜鉻細(xì)胞中玉掸，LMX1A、LMX1B醒叁、RFX2司浪、RFX3 和 RFX6 表現(xiàn)出高表達(dá)和可及性。其中把沼，LMX1A 已被提議作為腸嗜鉻譜系的調(diào)節(jié)劑啊易，并且是 TPH1（一種參與血清素合成的酶）的調(diào)節(jié)劑。當(dāng)我們檢查 LMX1A 在腸內(nèi)分泌和腸嗜鉻亞型中的表達(dá)時饮睬，我們觀察到它僅在腸嗜鉻蛋白細(xì)胞租谈。類似地，RFX6 是一種建議的腸內(nèi)分泌細(xì)胞分化調(diào)節(jié)劑捆愁，RFX6 的缺失會損害小鼠的腸內(nèi)分泌細(xì)胞分化割去。總之昼丑，這些結(jié)果支持了先前的發(fā)現(xiàn)呻逆，并提名了額外的 TF，這些 TF 可能是不同腸道細(xì)胞類型的重要調(diào)節(jié)因子矾克，這些細(xì)胞類型在腸道的不同區(qū)域（例如 KLF4）可能有所不同页慷。

Differentiation trajectories across the intestine reveal distinct gene regulation programs

腸道干細(xì)胞不斷分化為成熟的腸細(xì)胞憔足、杯狀細(xì)胞和其他特殊細(xì)胞類型胁附，如腸內(nèi)分泌、簇狀細(xì)胞和窗格細(xì)胞滓彰，大約每 3 到 7 天更新一次上皮內(nèi)層控妻。為了繪制伴隨干細(xì)胞分化為成熟腸細(xì)胞的調(diào)控和基因表達(dá)變化，我們在來自十二指腸揭绑、空腸弓候、回腸和結(jié)腸的單核數(shù)據(jù)中沿著這條途徑定義了分化軌跡。然后他匪，我們在這四種分化軌跡中的任何一種中確定了可變?nèi)旧|(zhì)可及性（“peak值”）和可變基因表達(dá)的區(qū)域菇存。該分析揭示了腸道不同區(qū)域發(fā)育假時間中相關(guān)基因表達(dá)和可及性變化的連續(xù)軌跡。例如邦蜜，編碼在十二指腸中將胰蛋白酶原轉(zhuǎn)化為胰蛋白酶的蛋白質(zhì)的 TMPRSS15 在十二指腸中高度表達(dá)依鸥，在更分化的細(xì)胞中其表達(dá)逐漸增加。我們接下來將這些可變peak和基因聚類以識別具有共同行為的集合悼沈，揭示在腸道所有區(qū)域的分化假時間（例如在干細(xì)胞中）早期開放和表達(dá)的peak和基因組贱迟，我們將其表示為早期(E)姐扮。該cluste’包括腸道干細(xì)胞的一般標(biāo)記物，包括在整個腸道中共享的 RGMB衣吠、SOX9茶敏、SMOC2 和 LGR5。其他基因cluster和peak包括主要存在于未分化十二指腸和空腸（例如 REG3A缚俏、SCTR）惊搏、分化小腸細(xì)胞（例如 MTTP、APOA4袍榆、APOC3胀屿、MME）、未分化結(jié)腸（例如 ROR2包雀、PTGDR）和分化的結(jié)腸（例如 SCNN1B51宿崭、P3H2、MS4A12）才写。

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• 注：Regulation of differentiation in the human intestine A) UMAPs depicting the cells in the four primary regions of the intestine (duodenum, jejunum, ileum, and colon), labeled by cell type (left) and differentiation pseudotime (right). B, C) Variable peaks (B) and genes (C) identified along the absorptive differentiation trajectories. The rows represent the row z-scores of accessibility for each peak or expression for each gene. Columns represent the position in the pseudotime from start to end for each section of the intestine. Peaks and genes are k-means clustered and the clusters are labeled based on the dominant time and location where they are most accessible/expressed.

為了識別cluster特異性調(diào)控的染色質(zhì)驅(qū)動因素以及相關(guān)的cluster特異性基因表達(dá)程序葡兑，我們計算了每個 peak cluster中的 TF 基序富集和每個基因cluster中的 KEGG 通路富集。 在分化軌跡后期可到達(dá)的peak組富含 HNF4 和 JUN/FOS 基序赞草。 正如預(yù)期的那樣讹堤，主要在小腸分化軌跡后期表達(dá)的基因（十二指腸空腸晚期cluster）富集了多種代謝 KEGG 途徑，包括脂肪消化和吸收和蛋白質(zhì)消化和吸收厨疙。

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• 注：D) Hypergeometric enrichment of motifs in the clusters of peaks identified in B. E) Enrichment of KEGG pathways in the clusters of genes identified in C.

我們接下來通過計算四個分化軌跡中每個細(xì)胞的 TF 表達(dá)和 ChromVar 偏差之間的相關(guān)性洲守，確定了其基因表達(dá)與其基序活性相關(guān)的 TF。我們發(fā)現(xiàn)了 68 個 TF沾凄，其表達(dá)與其基序活性相關(guān) (r>0.7)梗醇，并繪制了這些轉(zhuǎn)錄因子的整合基因表達(dá)。許多這些因素在所有四個分化軌跡上都表現(xiàn)出類似的活動撒蟀。例如叙谨，ASCL2 是腸道干細(xì)胞的主要調(diào)節(jié)因子，在所有四個軌跡的開始處都高度表達(dá)保屯。其他 TF手负，如 ETV6，在腸道的不同區(qū)域表現(xiàn)出不同的行為姑尺。 ETV6 是一種轉(zhuǎn)錄因子竟终，與正常結(jié)腸相比，在結(jié)直腸癌中表達(dá)減少切蟋，ETV6 的遺傳變異可能賦予結(jié)直腸癌易感性统捶。我們發(fā)現(xiàn) ETV6 在結(jié)腸中的表達(dá)比在小腸中更高，并且與小腸不同，ETV6 在結(jié)腸中更多分化的細(xì)胞中表達(dá)增加瘾境。

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• 注：Integrated gene expression of TFs whose gene expression is correlated with ChromVar motif activity along the differentiation trajectory.

作為檢查如何控制具有獨特表達(dá)模式的基因的一個例子歧杏，我們接下來測試了哪些調(diào)控元件可能導(dǎo)致 ETV6 在腸道不同區(qū)域的這種可變表達(dá)。我們確定了與腸道任何區(qū)域中 ETV6 表達(dá)相關(guān)的可及性peak迷守，然后繪制了這些peak的可及性如何沿每個區(qū)域的分化假時間變化犬绒。對于七個最相關(guān)的peak，可接近性往往在結(jié)腸中最高兑凿，在那里表達(dá)最大凯力。在腸道的其他區(qū)域（內(nèi)含子 3）中最容易接近的peak值沿著分化軌跡變得更難接近，這與這些區(qū)域中沿著分化假時間的表達(dá)降低一致礼华。在結(jié)腸中也觀察到類似的行為咐鹤，盡管結(jié)腸中 ETV6 的表達(dá)增加，但沿分化軌跡的 Intronic 3 peak變得更難接近圣絮。然而祈惶，多個其他peak，包括遠(yuǎn)端和內(nèi)含子扮匠，僅在結(jié)腸中的分化程度更高的細(xì)胞中表現(xiàn)出增加的可及性捧请，我們推測這些調(diào)控元件可能會推動 ETV6 在分化的結(jié)腸細(xì)胞中的表達(dá)增加囤锉〈缡浚可以應(yīng)用相同的邏輯來識別可能驅(qū)動整個腸道基因表達(dá)變化的調(diào)控元件薇溃。例如余素，我們確定了 4 個與 TMPRSS15 表達(dá)高度相關(guān)的peak，并可能推動其在十二指腸中的表達(dá)增加瘩扼。綜上所述拣挪，該分析為干細(xì)胞在腸道內(nèi)對腸上皮細(xì)胞分化的調(diào)控提供了參考逼庞。

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• 注：Accessibility at peaks correlated with the expression of ETV6 along the differentiation trajectory in each region is plotted on the left. Each peak is normalized to the maximum accessibility along any of the trajectories. Integrated gene expression of ETV6 along the differentiation trajectory in each region is plotted on the right.

我們接下來使用linkage disequilibrium（LD）評分回歸測試了疾病遺傳力是否在腸細(xì)胞類型中的細(xì)胞類型特異性標(biāo)記物peak中富集克蚂。 我們發(fā)現(xiàn)克羅恩病和乳糜瀉的 T 細(xì)胞標(biāo)志物peak的遺傳力顯著增加闺鲸，這與 T 細(xì)胞在其發(fā)病機制中的重要性一致。 我們觀察到腸內(nèi)分泌細(xì)胞中 BMI 遺傳力的最顯著富集陨舱，表明遺傳變異可能對腸內(nèi)分泌細(xì)胞產(chǎn)生影響翠拣，從而導(dǎo)致對 BMI 的影響版仔。 作為對照游盲，我們還測試了 GWAS SNP 的遺傳力是否在無關(guān)性狀（齲齒）中富集，并且沒有發(fā)現(xiàn)細(xì)胞類型特異性富集蛮粮。 這些結(jié)果將重要的疾病特征映射到腸道中的特定細(xì)胞類型益缎。

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• 注：LD Score Regression to identify enrichment of GWAS SNPs in cell-type specific marker peaks. Unadjusted p-values are plotted in the heatmap. Significance is indicated by an asterisk in each box, as determined by a Bonferroni-corrected p-value of less than 0.05. P-values for determining significance were adjusted for the number of cell classes tested。

Discussion

我們使用各種不同的單細(xì)胞（CODEX然想、snRNA-Seq莺奔、snATAC-Seq）技術(shù)以高分辨率分析了腸道的許多不同區(qū)域。 我們的工作通過結(jié)合空間蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)集（CODEX 成像）以及 snRNA 和 snATAC 技術(shù)变泄，極大地擴(kuò)展了以前的單細(xì)胞研究令哟。 我們證明了小腸廣泛的細(xì)胞復(fù)雜性恼琼，包括相當(dāng)大的上皮異質(zhì)性和新的分泌細(xì)胞亞型，腸道的不同區(qū)域具有不同的細(xì)胞組成屏富，并且細(xì)胞被組織成不同的鄰域晴竞，這些鄰域也形成社區(qū)。 我們還展示了腸道內(nèi)這些社區(qū)和社區(qū)的保護(hù)性和異質(zhì)性狠半。 最后噩死，還繪制了開放染色質(zhì)調(diào)節(jié)程序，定義了在腸道不同區(qū)域使用的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑和分化途徑神年。

我們生成了腸道的空間分層描述已维，該描述源自我們在 CODEX 多路復(fù)用成像數(shù)據(jù)中生成的細(xì)胞類型標(biāo)簽。通過檢查十個最近鄰細(xì)胞內(nèi)的保守細(xì)胞類型組成已日，我們計算的第一層是組織內(nèi)的直接細(xì)胞鄰域垛耳。這些代表并確定了在腸道內(nèi)發(fā)現(xiàn)的微結(jié)構(gòu)，例如脈管系統(tǒng)或免疫卵泡飘千。我們進(jìn)一步建立在鄰域概念的基礎(chǔ)上艾扮，以了解細(xì)胞的鄰域如何相互作用并趨于共定位。我們在多細(xì)胞結(jié)構(gòu)群落中對這些進(jìn)行了定量表征占婉，這些群落可以進(jìn)一步分為主要群落類型泡嘴。雖然小腸和結(jié)腸之間共享相同的主要群落，但我們觀察到免疫群落的差異定位逆济，這些免疫群落定位于結(jié)腸的頂點和小腸的上皮細(xì)胞的底部酌予，這可能反映了不同的微生物負(fù)荷。這種分類分離了富含免疫細(xì)胞和上皮細(xì)胞的組織的粘膜區(qū)域奖慌，并在比較結(jié)腸和小腸時定義了多細(xì)胞鄰域的整體結(jié)構(gòu)和相互作用抛虫。這種多路復(fù)用空間數(shù)據(jù)的分層視圖可以作為其他空間圖集工作的模板參考。

我們將空間分析重點放在腸道內(nèi)的免疫細(xì)胞組織上简僧，因為漿細(xì)胞建椰、CD4+ T 細(xì)胞和 CD8+ T 細(xì)胞都在腸道免疫反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。漿細(xì)胞通過分泌 IgA 抗體在免疫中發(fā)揮重要作用岛马，IgA 抗體是產(chǎn)生最多的抗體棉姐，對于維持與微生物群和食物抗原的穩(wěn)態(tài)關(guān)系至關(guān)重要。有趣的是啦逆，漿細(xì)胞具有最高的相同細(xì)胞密度伞矩，并且還發(fā)現(xiàn)與抗原呈遞細(xì)胞共同定位在這個在腸道所有區(qū)域中發(fā)現(xiàn)的多細(xì)胞鄰域中。通過合并 snRNAseq 數(shù)據(jù)和 CODEX 數(shù)據(jù)夏志，我們還發(fā)現(xiàn)漿細(xì)胞和轉(zhuǎn)運放大上皮細(xì)胞是在結(jié)腸中比在小腸中更多地共定位的細(xì)胞對之一乃坤，并且差異表達(dá)的 SEMAD-MET 配體對已知可誘導(dǎo) B細(xì)胞聚類。漿細(xì)胞需要一個特殊的生態(tài)位才能在骨髓中存活，并具有 CD44湿诊、增殖誘導(dǎo)配體 (APRIL)狱杰、IL-6 和 SDF-1 等存活因子。漿細(xì)胞的定位在上皮下空間的腸道相關(guān)淋巴組織 (GALT) 中對于 IgA 通過上皮的轉(zhuǎn)胞吞至關(guān)重要厅须，我們發(fā)現(xiàn)富含漿細(xì)胞的鄰域形成了粘膜內(nèi)其他幾個免疫和上皮鄰域的重要十字路口浦旱。因此，我們的數(shù)據(jù)表明九杂，來自結(jié)腸的抗原呈遞細(xì)胞和轉(zhuǎn)運放大細(xì)胞在維持連接其他多細(xì)胞免疫和上皮結(jié)構(gòu)的粘膜豐富的漿細(xì)胞區(qū)方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用颁湖。

CD4+ T 細(xì)胞參與 B 細(xì)胞的 CD4+ T 細(xì)胞支持和 CD8+ T 細(xì)胞的激活。我們發(fā)現(xiàn) CD4+ T 細(xì)胞廣泛分布并富集在所有富含免疫的多細(xì)胞結(jié)構(gòu)（先天免疫富集例隆、內(nèi)卵泡甥捺、外卵泡、適應(yīng)性免疫富集和漿細(xì)胞富集）中镀层，這些結(jié)構(gòu)具有支持功能的特征镰禾。特別是，CD4+ T 細(xì)胞是外卵泡多細(xì)胞鄰域中最豐富的細(xì)胞類型唱逢，無論是否存在完全發(fā)育的卵泡結(jié)構(gòu)吴侦，它都存在于腸道的所有部位。這一觀察結(jié)果表明坞古，免疫系統(tǒng)似乎在結(jié)構(gòu)上沿著腸道保持平衡备韧，以根據(jù)需要在局部產(chǎn)生以生發(fā)中心為重點的免疫反應(yīng)。將小腸與結(jié)腸進(jìn)行比較時痪枫，濾泡型多細(xì)胞結(jié)構(gòu)是最不保守的結(jié)構(gòu)之一织堂。進(jìn)一步了解這些差異對于闡明功能差異、發(fā)育和維持很重要奶陈，因為卵泡與有益的癌癥結(jié)果易阳、增強的自身免疫和清除感染有關(guān)。此外吃粒，CD4+ T 細(xì)胞廣泛參與多種免疫多細(xì)胞結(jié)構(gòu)表明它們的調(diào)節(jié)可能是調(diào)節(jié)腸道免疫反應(yīng)的關(guān)鍵治療靶點潦俺。

CD8+ T 細(xì)胞對于抗病毒細(xì)胞毒功能至關(guān)重要，是 CODEX 數(shù)據(jù)中定義的少數(shù)細(xì)胞類型之一徐勃，顯示從小腸到結(jié)腸減少事示。這種成分變化可能反映了抗原可用性的差異，與最初接觸以及與結(jié)腸相比疏旨，更多地接觸食物抗原和具有較少粘液分泌細(xì)胞的異物很魂。這些差異被分為兩個鄰域扎酷，即富含 CD8+ T 的 IEL 和適應(yīng)性免疫檐涝，其中富含 CD8+ T 的 IEL 鄰域在結(jié)腸中幾乎耗盡。這種結(jié)構(gòu)差異進(jìn)一步證實了 IEL CD8+ T 細(xì)胞與腸道內(nèi)其他 CD8+ T 細(xì)胞的表型區(qū)別，值得進(jìn)一步研究以了解這些細(xì)胞的維持谁榜、調(diào)節(jié)和更新幅聘。事實上，CD8+ T 細(xì)胞的存在和密度與有益的抗癌結(jié)果相關(guān)窃植，與小腸相比帝蒿，結(jié)腸內(nèi)的癌癥發(fā)病率增加。未來探索這種相關(guān)性并了解上皮內(nèi)免疫細(xì)胞是否有助于去除有缺陷的上皮細(xì)胞將是很有趣的巷怜。

我們還計算了從小腸到結(jié)腸的多細(xì)胞結(jié)構(gòu)的相似性葛超，并生成了一個保守分?jǐn)?shù)來描述組成的相似性。 從該分析中可以明顯看出延塑，所有多細(xì)胞結(jié)構(gòu)都檢測到該結(jié)構(gòu)的共同核心特征绣张，例如外濾泡結(jié)構(gòu)中 CD4+ T 細(xì)胞的高富集，但其他細(xì)胞類型的組成富集有所不同关带。 最多樣化的結(jié)構(gòu)是早期分泌上皮多細(xì)胞鄰域侥涵。 這進(jìn)一步證實了隱窩結(jié)構(gòu)是小腸和結(jié)腸之間差異功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，并與從 RNA 和 ATAC 數(shù)據(jù)集觀察到的差異一致宋雏。

利用成對的轉(zhuǎn)錄組和染色質(zhì)可及性數(shù)據(jù)芜飘，我們實現(xiàn)了進(jìn)一步的粒度來定義腸道中細(xì)胞類型的多樣性∧プ埽總的來說嗦明，結(jié)腸的不同區(qū)域表現(xiàn)出高度一致的細(xì)胞類型豐度。然而蚪燕，與結(jié)腸相比招狸，小腸區(qū)域的細(xì)胞類型組成更加多樣化，回腸通常表現(xiàn)出小腸區(qū)域和結(jié)腸之間共享的免疫和基質(zhì)細(xì)胞類型部分邻薯。我們觀察到特化上皮細(xì)胞的多樣性更大裙戏，包括小腸中的腸內(nèi)分泌和粘液分泌細(xì)胞。在所有區(qū)域內(nèi)厕诡，我們鑒定了具有高表達(dá) MUC2 的杯狀細(xì)胞累榜。然而，在十二指腸中灵嫌，我們發(fā)現(xiàn)了兩個額外的細(xì)胞cluster壹罚，其特征是形成凝膠的粘蛋白 MUC5B 和 MUC6 的高表達(dá)。 MUC6 cluster可能代表十二指腸 Brunner 腺體的細(xì)胞寿羞，這些細(xì)胞已被證明表達(dá)高水平的 MUC6猖凛。 MUC5B cluster更令人驚訝，因為已知 MUC5B 在肺和膽囊的杯狀細(xì)胞中表達(dá)绪穆，在結(jié)腸杯狀細(xì)胞中表達(dá)水平較低辨泳，但在十二指腸中不表達(dá)虱岂，其中 MUC2 和 MUC6 是主要的粘蛋白。

雖然之前的 scRNA 數(shù)據(jù)集已經(jīng)檢查了人類腸道中細(xì)胞類型的多樣性菠红，但我們集成的 snRNA 和 snATAC 數(shù)據(jù)集提供了詳細(xì)的腸道單細(xì)胞調(diào)控圖第岖。 我們使用這個數(shù)據(jù)集來識別不同細(xì)胞類型中的轉(zhuǎn)錄因子，這些細(xì)胞類型的基因表達(dá)與它們結(jié)合的基序的可及性高度相關(guān)试溯。 這確定了已知是不同細(xì)胞類型的主要調(diào)節(jié)因子的 TF蔑滓，包括 Tuft 細(xì)胞中的 POU2F3、干細(xì)胞中的 ASCL2 和腸內(nèi)分泌細(xì)胞中的 RFX6遇绞，同時還指定了許多其他轉(zhuǎn)錄因子键袱，這些因子可能是各自細(xì)胞類型中的重要調(diào)節(jié)因子。 這包括簇狀細(xì)胞中的 RUNX1 和 RUNX2摹闽、杯狀細(xì)胞中的 FOXA3 和 ATOH1 以及潘氏細(xì)胞中的 ZBTB18杠纵。

在腸道的所有區(qū)域內(nèi)，腸道干細(xì)胞分化為成熟的吸收性腸細(xì)胞钩骇。通過沿著腸道不同區(qū)域的分化軌跡整合基因表達(dá)和染色質(zhì)可及性數(shù)據(jù)比藻，我們指定了在腸道所有區(qū)域的吸收分化中表現(xiàn)出一致行為的 TF。其中有已知的腸道干細(xì)胞調(diào)節(jié)劑倘屹，如 SOX9 和 ASCL2银亲，它們在腸道所有區(qū)域的分化軌跡開始時高度表達(dá)并在細(xì)胞中具有高染色質(zhì)活性。我們還觀察到不同區(qū)域軌跡之間 TF 動力學(xué)的許多差異纽匙。一個這樣的例子是 ETV6务蝠，它在結(jié)腸的分化吸收細(xì)胞中高度表達(dá)，但在腸道的其他區(qū)域不表達(dá)烛缔。有趣的是馏段，在 CRC 中 ETV6 表達(dá)降低，并且 ETV6 中的遺傳變異可能賦予 CRC 風(fēng)險践瓷。我們的數(shù)據(jù)使我們能夠推測為什么會出現(xiàn)這種情況院喜，因為 ETV6 對正常結(jié)腸分化很重要，因此 ETV6 的缺失可能會阻止結(jié)腸干細(xì)胞的分化晕翠。檢查這些數(shù)據(jù)還使我們能夠?qū)⑻囟ǖ恼{(diào)控元件與沿軌跡的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)聯(lián)系起來喷舀。對于 ETV6，該分析確定了一個遠(yuǎn)端和三個具有相似活性的內(nèi)含子調(diào)控元件淋肾，它們最有可能負(fù)責(zé)沿結(jié)腸中的吸收分化軌跡驅(qū)動 ETV6 的表達(dá)硫麻。

染色質(zhì)可及性數(shù)據(jù)還允許使用與常見腸道疾病（例如 GWAS 命中）（如腹腔疾病樊卓、潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩材美ⅰ）相關(guān)的常見遺傳變異的調(diào)控元件來評估細(xì)胞類型特異性富集。這種分析可以指定這些 GWAS 命中可能起作用的特定細(xì)胞類型碌尔，以及可能驅(qū)動疾病病因的細(xì)胞類型浇辜。我們發(fā)現(xiàn) T 細(xì)胞在自身免疫性疾病券敌、乳糜瀉、潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病中最為豐富奢赂。我們還發(fā)現(xiàn) BMI 的遺傳力在腸內(nèi)分泌細(xì)胞中富集陪白，這表明 BMI 的變異可能部分是由腸道腸內(nèi)分泌細(xì)胞功能區(qū)域的遺傳變異驅(qū)動的颈走。我們注意到高血壓與內(nèi)皮細(xì)胞有關(guān)膳灶，這可能代表內(nèi)皮細(xì)胞的更普遍效應(yīng)；然而立由，探索高血壓患者是否也有腸道問題會很有趣轧钓。無論如何，總的來說锐膜，我們可以將特定疾病的遺傳性分配給特定的腸道細(xì)胞類型毕箍。

研究有幾個局限性。 首先道盏，對于每位患者而柑，我們通常分析來自每個腸道區(qū)域的單個樣本。 由于 CODEX 和單細(xì)胞數(shù)據(jù)在很大程度上是一致的荷逞，并且受試者之間的差異小于區(qū)域之間的差異媒咳，因此這些模式很可能代表了這些區(qū)域。 同樣重要的是要注意种远，所分析的四名成年人中有三名年齡較大涩澡，三名是男性。 跨越廣泛年齡和種族的模式仍有待闡明坠敷。 我們也沒有能力確定性別差異妙同，鑒于男性和女性的疾病風(fēng)險差異，這可能很重要膝迎。 未來可以通過采集更多樣本和數(shù)據(jù)來解決這些限制粥帚。

總之，我們展示了人類腸道的詳細(xì)地圖限次，特別是健康小腸和結(jié)腸的第一個多路復(fù)用成像參考茎辐。 除了生物學(xué)見解，這還可以作為腸道疾驳嗨　（例如 IBD）以及與其他生物體比較的重要參考拖陆。

METHOD

Cell Type Analysis

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Cell Type Annotation using STELLAR

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CODEX Cell Density Analysis

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Neighborhood Identification Analysis

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Neighborhood Conservation Analysis

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Community and Major Community Identification Analysis

Communities were determined similar to how multicellular neighborhoods were determined with some minor differences. Briefly, the cells in the neighborhood tissue maps were taken with a larger window size of 100 nearest neighbors. These windows were taken across the entirety of the tissue and the vectors then clustered with k-means clustering and overclustering with 20 total clusters. These clusters were mapped back to the tissue and evaluated for neighborhood composition and enrichment to determine overall community type. Communities were categorized into one of four major communities: epithelial, immune, stroma, or smooth muscle.

Hierarchical Intestine Structural Graphs

Each hierarchical level was connected to the next by either what it contributed to the largest in
the next level, or what made up at least 15% of this next hierarchy. The percentage of each feature in the level was represented by size of the shape. The shape and color combination correspond to the level and feature respectively. The size of the connecting line represents the amount a feature contributes to the next feature.

Spatial Context Maps

Spatial context maps were created as previously described34. Briefly, first only cells which made up either epithelial or immune major cell types were selected for further analysis. Then, windows were taken again with the neighborhood types captured from the 100 nearest neighbors. Individual square combinations were selected by what combination of neighborhoods were needed to make up at least 85% of the total composition of the windows. Combinations were then counted and represented in size by the size of the black circle underneath the square neighborhood combination.

Colocalization Analyses

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Ligand and Receptor Analyse

The FANTOM5 database and 12 more literature-supported experimentally-validated ligand and
receptor pairs were used to obtain the final list of validated ligand receptor pairs (Yu et al., 2021). Non-parametric Wilcoxon rank-sum test was used to identify differentially expressed ligands and receptors in the small bowel versus the colon (adjusted p-value cutoff = 0.05).

Single-nuclei Analytical Methods: Quality control, dimensionality reduction, and clustering of snATAC data

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Single-nuclei Analytical Methods: Integration of snRNA and snATAC data and nomination of regulatory TFs

The snRNA and snATAC datasets from the four primary regions of the intestine (duodenum, jejunum, ileum, and colon) were integrated separately using the ArchR function addGeneIntegrationMatrix with reducedDims = "Harmony" and useMatrix = "GeneScoreMatrix". We then identified TF regulators following the ArchR manual for identifying TF regulators for each region, with a correlation cutoff of 0.6.

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