hello壤圃，大家好，又是新的一周琅轧，清明節(jié)大家找到了對(duì)象沒有伍绳？？乍桂？沒有的話冲杀， 那就繼續(xù)找??，29歲睹酌，而立之年权谁，雖然不知道命運(yùn)會(huì)帶來什么，但是有一點(diǎn)應(yīng)該是毫無疑問的憋沿，那就是天生我才必有用~~~~旺芽。

好了，這一篇我們要來分享全球首篇FFPE空間轉(zhuǎn)錄組的研究文章，文章在Tertiary lymphoid structures generate and propagate anti-tumor antibody-producing plasma cells in renal cell cancer,發(fā)表在了免疫雜志的頂刊采章，非常值得借鑒运嗜。

先來了解一個(gè)小知識(shí)，三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)悯舟。

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三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)（TLS担租，也稱為異位淋巴組織/器官）是在非淋巴組織中發(fā)現(xiàn)的淋巴組織結(jié)構(gòu)。TLS可在炎癥組織中發(fā)生抵怎，并與慢性炎癥性疾病翩活、自身免疫性疾病和癌癥有關(guān)。因此便贵，TLS作為腫瘤免疫調(diào)節(jié)和腫瘤治療的有利手段菠镇，受到了腫瘤患者的關(guān)注。
三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)可以看成是一個(gè)在架構(gòu)在成纖維細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)上的淋巴細(xì)胞聚集體承璃，包含兩個(gè)重要的結(jié)構(gòu)區(qū)域—T細(xì)胞區(qū)和（濾泡）B細(xì)胞區(qū)利耍。成熟的三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)被定義為存在有生發(fā)中心（Germinal centre，GC）盔粹，GC內(nèi)含有T濾泡輔助細(xì)胞和濾泡狀樹突細(xì)胞隘梨，并且與B細(xì)胞緊密聯(lián)系。

與正常淋巴組織發(fā)育不同舷嗡，在缺乏前體LTi細(xì)胞的情況下轴猎，第三級(jí)淋巴器官也開始出現(xiàn)。

起始階段（Initiation）

異位淋巴組織生成的起始階段是由一種局部炎癥微環(huán)境驅(qū)動(dòng)的进萄，主要參與的免疫細(xì)胞包括：分泌IL-17的CD4+細(xì)胞捻脖，糠馆、NK細(xì)胞份汗、中性粒細(xì)胞、γδT細(xì)胞和ILC3等席赂。
這些免疫細(xì)胞與成纖維細(xì)胞援雇、血管周圍成纖維細(xì)胞矛渴、間充質(zhì)細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞形成緊密連接，釋放細(xì)胞因子如IFN-γ惫搏、IL-1β具温、TNF等。這些細(xì)胞因子促進(jìn)粘附分子表達(dá)以及趨化因子（即CXCL12筐赔、CXCL13铣猩、CCL19和CCL21）釋放，創(chuàng)建淋巴結(jié)構(gòu)形成的基礎(chǔ)空間環(huán)境川陆。

歸巢階段（Homing）

釋放的趨化因子剂习，招募趨化T細(xì)胞蛮位，B細(xì)胞等更多的免疫細(xì)胞至炎癥局部三級(jí)淋巴器官形成空間，基質(zhì)細(xì)胞等持續(xù)釋放淋巴細(xì)胞存活細(xì)胞因子等（BAFF鳞绕，IL-7失仁，CXCL12），支持遷移過來的淋巴細(xì)胞持續(xù)存活们何，活化萄焦，增殖形成異位淋巴器官。

維持異位淋巴組織（Maintenance）

激活的B細(xì)胞和T細(xì)胞釋放LTα1β2冤竹，駐留的間質(zhì)細(xì)胞拂封、浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和其他實(shí)質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的趨化因子（CCL19/21鹦蠕，CXCL12/13）冒签，F(xiàn)DCs促進(jìn)生發(fā)中心形成，高親和力抗體產(chǎn)生钟病。B細(xì)胞也產(chǎn)生FDCs分化需要的 LTα1β2萧恕。

B細(xì)胞、T細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞向三級(jí)巴組織的募集肠阱，激活內(nèi)皮細(xì)胞的高內(nèi)皮微靜脈樣表型票唆。
在胚胎和新生兒時(shí)期，高內(nèi)皮微靜脈在所有次級(jí)淋巴器官中發(fā)育屹徘，對(duì)啟動(dòng)和維持免疫反應(yīng)至關(guān)重要走趋，因?yàn)樗鼈儚难褐刑崛∮字珊陀洃浟馨图?xì)胞，并將它們輸送到淋巴結(jié)內(nèi)的抗原呈遞細(xì)胞噪伊。

這些有助于淋巴細(xì)胞存活和/或增殖的細(xì)胞因子簿煌，自身抗體（Auto-Abs）等，為異位第三淋巴器官的維持創(chuàng)造一個(gè)生態(tài)位酥宴。

癌癥三級(jí)淋巴組織（TLS）中免疫浸潤(rùn)的組成也稱為三級(jí)淋巴器官或異位淋巴結(jié)構(gòu)啦吧，是出生后在非淋巴組織中出現(xiàn)的免疫細(xì)胞的有組織聚集體。TLSs在生理?xiàng)l件下不存在拙寡，但在慢性炎癥環(huán)境中形成。TLS可能在癌癥類型之間有所不同琳水。TLS的特點(diǎn)是CD20+ B細(xì)胞的內(nèi)部區(qū)域被CD3+ T細(xì)胞包圍肆糕，盡管TLS的具體組成可能有所不同，但在T細(xì)胞區(qū)室中在孝，CD4+ T濾泡輔助（TFH）細(xì)胞通常代表主要亞群诚啃，但CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞、CD4+ T輔助1（TH1）細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）也可以存在私沮。類似于次級(jí)淋巴器官始赎，三級(jí)淋巴組織包含T細(xì)胞區(qū)和B細(xì)胞區(qū)

• T細(xì)胞區(qū)：由T細(xì)胞，DC細(xì)胞和成纖維網(wǎng)狀細(xì)胞組成
• B細(xì)胞區(qū)：包含生發(fā)中心，漿細(xì)胞造垛，抗體和腫瘤抗原形成的免疫復(fù)合物魔招，濾泡DC。
  三級(jí)淋巴組織產(chǎn)生效應(yīng)T細(xì)胞和B細(xì)胞五辽，可以在腫瘤局部直接殺死腫瘤細(xì)胞办斑，或者通過ADCC和CDC效應(yīng)殺傷腫瘤細(xì)胞。三級(jí)淋巴組織的中樞記憶T細(xì)胞和B細(xì)胞杆逗，同時(shí)還擔(dān)負(fù)監(jiān)測(cè)腫瘤轉(zhuǎn)移的職責(zé)乡翅。靠近腫瘤的三級(jí)淋巴組織的淋巴細(xì)胞則是腫瘤前體細(xì)胞或者腫瘤細(xì)胞的微環(huán)境罪郊，在腫瘤復(fù)發(fā)中有一定作用蠕蚜。

好了，開始分享我們的主要內(nèi)容

值得注意的分析點(diǎn)

• 沒有單細(xì)胞數(shù)據(jù)的情況下悔橄，單細(xì)胞細(xì)胞豐度靶累、區(qū)域注釋如何做？
• 細(xì)胞類型的共定位
• 空間BCR（TCR）如何實(shí)現(xiàn)的橄维？尺铣？？

Highlights

• Tertiary lymphoid structures are sites of in situ B cell maturation toward plasma cells
• IgG+ and IgA+ plasma cells disseminate into the tumor tissue along fibroblastic tracks
• Tumor cells are labeled by locally produced IgG
• Patients with IgG-labeled tumor cells have high response rate to ICI and prolonged PFS

SUMMARY

腫瘤內(nèi)三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu) (TLS) 的存在與積極的臨床結(jié)果和對(duì)癌癥免疫治療的反應(yīng)有關(guān)争舞。在這里凛忿，使用空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)來檢查腎細(xì)胞癌 (RCC) 中 TLS 內(nèi) B 細(xì)胞反應(yīng)的性質(zhì)。 B 細(xì)胞在 TLS區(qū)域中富集竞川，在研究中可以識(shí)別所有 B 細(xì)胞成熟階段朝向漿細(xì)胞 (PC) 的形成店溢。 B 細(xì)胞 repertoire 分析揭示了 在TLS 中的B細(xì)胞的克隆多樣化、選擇委乌、擴(kuò)增以及遠(yuǎn)處完全成熟的克隆型的存在床牧。在 TLS+ 腫瘤中，產(chǎn)生 IgG 和 IgA 的 PC 沿著成纖維細(xì)胞空間分布遷移到腫瘤bed中遭贸。 TLS+ 腫瘤表現(xiàn)出高頻率的產(chǎn)生 IgG 的 PC 和 IgG 染色和凋亡的惡性細(xì)胞戈咳，這表明具有抗腫瘤效應(yīng)活性。Therapeutic responses and progression-free survival correlated with IgG-stained tumor cells in RCC patients treated with immune checkpoint inhibitors壕吹。因此著蛙，腫瘤內(nèi) TLS 維持與免疫治療反應(yīng)相關(guān)的 B 細(xì)胞成熟和抗體產(chǎn)生，可能通過直接的抗腫瘤作用耳贬。

INTRODUCTION

在自身免疫性疾病踏堡、慢性感染、移植排斥和癌癥中遭受慢性炎癥和抗原持久性的組織中發(fā)現(xiàn)了三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu) (TLS)咒劲。 腫瘤內(nèi) TLS 的存在和密度與許多癌癥類型的良好預(yù)后相關(guān).

TLS 是在成纖維細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)上形成的有組織的淋巴樣聚集體顷蟆，包括一個(gè) T 細(xì)胞區(qū)诫隅，其中成熟的樹突細(xì)胞與 T 細(xì)胞接觸，以及一個(gè)濾泡性 B 細(xì)胞區(qū)帐偎。成熟 TLS 的定義是存在包含 T 濾泡輔助 (Tfh) 細(xì)胞和與 B 細(xì)胞緊密接觸的濾泡樹突狀細(xì)胞的生發(fā)中心 (GC)逐纬。最近的證據(jù)支持這樣的結(jié)論，即含有 GC 的成熟 TLS肮街，而不是沒有 GC 的早期 TLS风题，與肝細(xì)胞癌、肺鱗狀細(xì)胞癌嫉父、結(jié)直腸癌和胰腺癌的臨床益處相關(guān)沛硅。 GC的主要功能是產(chǎn)生記憶B細(xì)胞和分泌高親和力抗體的 long-lived 漿細(xì)胞(PC)。 B 細(xì)胞和 PC 轉(zhuǎn)錄組特征的高表達(dá)水平和高 PC 密度與幾種癌癥類型的較長(zhǎng)存活率相關(guān)绕辖。在軟組織肉瘤摇肌、黑色素瘤、腎細(xì)胞癌仪际、非小細(xì)胞肺癌围小、尿路上皮癌和其他腫瘤中，B 細(xì)胞和成熟 TLS 的存在比 T 細(xì)胞更準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)了對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑 (ICI) 的治療反應(yīng)和存活率癌癥類型树碱。 B 細(xì)胞和 PC 影響臨床結(jié)果和對(duì) ICI 反應(yīng)的機(jī)制尚不清楚肯适。盡管一些研究顯示腫瘤內(nèi) B 細(xì)胞可以在某些癌癥中產(chǎn)生針對(duì)腫瘤相關(guān)抗原的 IgG 和 IgA 抗體，但沒有證據(jù)表明它們起源于腫瘤內(nèi)發(fā)生的 B 細(xì)胞分化成榜，特別是在 TLS 部位框舔。

在目前的工作中，解決了 TLS 作為 B 細(xì)胞原位成熟驅(qū)動(dòng)因素赎婚、產(chǎn)生抗體的 PC 的作用以及它們對(duì) ICI 反應(yīng)的影響的問題刘绣。研究了腫瘤的空間分辨轉(zhuǎn)錄組結(jié)構(gòu)透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌 (ccRCC) 原發(fā)性腫瘤的微環(huán)境 (TME)。通過關(guān)注 TLS 及其附近挣输，展示了 B 細(xì)胞在不同成熟階段的存在纬凤，支持 B 細(xì)胞反應(yīng)的產(chǎn)生。分析證明了 B 細(xì)胞的體細(xì)胞超突變撩嚼、克隆選擇和擴(kuò)增停士，以及 PC 產(chǎn)生的免疫球蛋白，表明腫瘤內(nèi)部產(chǎn)生了完整的 B 細(xì)胞反應(yīng)完丽。此外向瓷，發(fā)現(xiàn) IgG 和 IgA 陽性 PC 沿著 CXCL12 陽性成纖維細(xì)胞軌道在腫瘤內(nèi)遷移。顯示抗體（主要是 IgG）與腫瘤細(xì)胞結(jié)合舰涌，并且它們的存在與半胱天冬酶依賴性腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)。在 IgG 染色的腫瘤細(xì)胞附近檢測(cè)到呈現(xiàn) caspase 3 活化的巨噬細(xì)胞表明它們可能是通過誘導(dǎo) IgG 介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞死亡的效應(yīng)物你稚。最后瓷耙，具有大量 IgG 陽性腫瘤細(xì)胞的患者對(duì) ICI 反應(yīng)表現(xiàn)出高反應(yīng)率和更長(zhǎng)的 PFS朱躺。

RESULTS

Spatial TME architecture unveils areas of B cell rich hot spots in TLS+ tumors

為了分析 TLS 對(duì) TME 結(jié)構(gòu)的影響，使用了 10X Genomics 的 Visium 空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)搁痛。 它使用位于直徑為 55 um 的點(diǎn)中的空間條形碼寡核苷酸以空間分辨率測(cè)量完整的轉(zhuǎn)錄組长搀。 這允許在多達(dá) 5,000 個(gè)spot中量化空間基因表達(dá)。

使用冷凍（n = 12）和 FFPE 切片（n = 12）對(duì) 24 個(gè) ccRCC 原發(fā)性腫瘤進(jìn)行空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)鸡典。在對(duì)切片進(jìn)行 H&E 染色后源请，經(jīng)驗(yàn)豐富的病理學(xué)家 (VV) 對(duì)每個(gè)腫瘤的整體組織以及 TLS 的存在和定位進(jìn)行了注釋。下圖顯示了一個(gè) TLS+ 冷凍切片腫瘤彻况、一個(gè) TLS+ FFPE 腫瘤和一個(gè) TLS- 冷凍切片腫瘤谁尸。碳酸酐酶9（蛋白質(zhì)名稱：CAIX，基因名稱：Ca9）是ccRCC腫瘤細(xì)胞的標(biāo)志物纽甘，在大多數(shù)ccRCC腫瘤中的表達(dá)與23/24腫瘤中的表達(dá)一致良蛮，并且在腫瘤切片中分布均勻。使用微環(huán)境populations (MCP)-counter評(píng)估 TME 的免疫和基質(zhì)細(xì)胞群的分布悍赢，該counter從轉(zhuǎn)錄組譜估計(jì)細(xì)胞類型豐度决瞳。在下圖所示的 TLS+ 腫瘤中，B 細(xì)胞譜系（包含識(shí)別從幼稚細(xì)胞到 PC 的所有成熟步驟的基因）和 T 細(xì)胞（識(shí)別不同的 T 細(xì)胞群）基因特征優(yōu)先在位于TLS 區(qū)域中表達(dá) 左权。這些腫瘤表現(xiàn)出 CD8 T 細(xì)胞特征的低表達(dá)皮胡，在 TLS 區(qū)域略有富集（p = 0.017）。 TLS 中的單核細(xì)胞譜系特征略高（分別為 p = 0.00081 和 p = 0.035）赏迟，而 NK 細(xì)胞更廣泛地分布在整個(gè)腫瘤切片中屡贺。內(nèi)皮細(xì)胞和中性粒細(xì)胞均勻分布，在 TLS 內(nèi)得分較低）瀑梗，而在 TLS 區(qū)域發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞特征的高表達(dá)烹笔。 TLS 腫瘤沒有顯示出這種有組織的模式，MCP counter 分析顯示 B 譜系評(píng)分非常低且分散分布抛丽，以及其他免疫和基質(zhì)特征的分散定位谤职。這些不同的 TME 空間組織模式在 8 個(gè) TLS+ 和 4 個(gè) TLS- 冷凍切片腫瘤以及 10 個(gè) TLS+ 和 2 個(gè) TLS- FFPE 腫瘤中始終可以識(shí)別，這表明 TLS 與 B 譜系亿鲜、T 細(xì)胞和成纖維細(xì)胞特征的表達(dá)有關(guān).

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Immunoglobulin (Ig) gene expression inside and at distance from TLS

為了確定 TLS 在腫瘤中的轉(zhuǎn)錄組學(xué)印記允蜈，在冷凍切片的連續(xù)載玻片上通過三重 IF 標(biāo)記 (CD20/CD3/PD-1) 確認(rèn)了 H&E 定義的 TLS 位置，表達(dá)分析IHC 對(duì) FFPE 樣品進(jìn)行切片和 CD3/CD20 標(biāo)記后蒿柳，在 TLS 和腫瘤區(qū)域之間進(jìn)行了差異基因饶套。通過留一法交叉驗(yàn)證對(duì) 4 個(gè)冷凍的 TLS+ 腫瘤進(jìn)行了 TLS 印記markers的研究，這是一種通過識(shí)別來自 3 個(gè)腫瘤的基因并在第四個(gè)腫瘤上驗(yàn)證它們來執(zhí)行順序排列的方法垒探。平均倍數(shù)變化超過 2 且調(diào)整后的 p 值低于 0.05（Bonferroni 校正）的基因被考慮用于分析妓蛮。在signature中選擇了在至少 3 個(gè) TLS+ 腫瘤中分別達(dá)到 0.7 曲線下面積 (AUC) 的基因，這導(dǎo)致了 29 個(gè)基因的 TLS imprint signature圾叼。該特征包括 12 個(gè)免疫球蛋白基因（IGHA1蛤克、IGHG1捺癞、IGHG2、IGHG3构挤、IGHG4髓介、IGHGP、IGHM筋现、IGKC唐础、IGLC1、IGLC2矾飞、IGLC3 和 JCHAIN）一膨、5 個(gè) B 細(xì)胞標(biāo)志物（CD79A、FCRL5凰慈、MZB1汞幢、SSR4 和 XBP1）， 2 個(gè) T 細(xì)胞標(biāo)志物（TRBC2 和 IL7R）微谓、2 個(gè)成纖維細(xì)胞標(biāo)志物（CXCL12森篷、LUM）、2 個(gè)補(bǔ)體蛋白編碼基因（C1QA 和 C7）豺型，以及 CD52仲智、APOE、PTLP姻氨、PTGDS钓辆、PIM2 和 DERL3 基因。這 29 個(gè)基因特征是 TLS imprint的標(biāo)志物肴焊，在發(fā)現(xiàn)冷凍 TLS+ 腫瘤時(shí)的 AUC 范圍為 0.89 至 0.97前联，而在其余冷凍 TLS+ 腫瘤的驗(yàn)證中，其 AUC 范圍為 0.77 至 0.94娶眷。該特征在 9/10 TLS+ 腫瘤中 AUC 范圍為 0.75 至 0.93 的 12 個(gè) FFPE 腫瘤上得到進(jìn)一步驗(yàn)證似嗤，但一個(gè)樣本的 AUC 為 0.62 且 TLS 印記特征表達(dá)較弱。發(fā)現(xiàn)該腫瘤缺乏 TLS 成熟度標(biāo)志物届宠，例如 CD23 和 BCL6烁落，以及外周淋巴結(jié)尋址素陽性 (PNAd+) 高內(nèi)皮小靜脈 (HEV)。在 4 個(gè)冷凍和 2 個(gè) FFPE TLS 腫瘤中僅觀察到印跡特征的稀疏表達(dá)豌注，除了一個(gè)腫瘤伤塌，其中基因特征識(shí)別出表達(dá) MZB1 PC 相關(guān)基因和 IGHG1 的小區(qū)域，盡管沒有 TLS通過 H&E 染色和 CD3-CD20 IF 標(biāo)記觀察轧铁。

Ig 和 B 細(xì)胞相關(guān)基因在 TLS 印記特征中的顯著富集促使研究關(guān)注 B 細(xì)胞每聪。首先旨在精確定位與 TLS 相關(guān)的轉(zhuǎn)錄不同的 B 細(xì)胞亞型。使用穩(wěn)健的細(xì)胞類型分解 (RCTD，大家可以參考文章10X單細(xì)胞空間聯(lián)合分析之十（RCTD）) 對(duì)扁桃體 B 細(xì)胞單細(xì)胞分析中定義的 B 細(xì)胞亞群進(jìn)行空間映射熊痴，發(fā)現(xiàn)幼稚 B 細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)稀少他爸，盡管與 TLS 顯著相關(guān)，并且與 FCRL4+ 記憶 B 細(xì)胞密切相關(guān)果善、GC B 細(xì)胞 (p = 0.0087) 和具有 TLS 的漿細(xì)胞特征。 PC 相關(guān)基因 MZB1 的表達(dá)在 TLS 中高系谐，而在冷凍切片腫瘤的腫瘤區(qū)域中總體低巾陕。在 FFPE 腫瘤中發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果。然而纪他，在腫瘤內(nèi)的不同位置檢測(cè)到許多分散的鄙煤、遠(yuǎn)離 TLS 的 MZB1 表達(dá)點(diǎn)。 MZB1 是漿母細(xì)胞特征的一部分茶袒，在 PC 中高度表達(dá)梯刚。由于漿母細(xì)胞僅限于 TLS 區(qū)域，并且在 TLS 外發(fā)現(xiàn) MZB1 的高表達(dá)薪寓，因此表達(dá) MZB1 的 PC 可能不僅存在于 TLS 中亡资，而且存在于腫瘤bed中。由于 PC 的主要功能是產(chǎn)生抗體向叉，于是分析了免疫球蛋白基因的空間表達(dá)锥腻。 IGHM 幾乎只在 TLS 區(qū)域表達(dá)，增強(qiáng)了 TLS 內(nèi)非轉(zhuǎn)換 B 細(xì)胞的存在母谎，而 IGHG1瘦黑、IGHA1 和 pan Ig（IGKC 和 JCHAIN 的幾何平均值）基因在 TLS 區(qū)域高度表達(dá)，but also at distance in the tumors奇唤。 IGHG1 和 IGHA1 的分散表達(dá)表明同種型轉(zhuǎn)換的 PC 已在 TLS 中形成并在遠(yuǎn)處遷移幸斥。

值得注意的是，在與泛 Ig 基因（IGKC咬扇、JCHAIN）甲葬、IGHG1 和 IGHA1 基因相同的位置發(fā)現(xiàn)了泛成纖維細(xì)胞標(biāo)記 COL1A1 的高表達(dá)以及 MCP-counter 成纖維細(xì)胞特征。 由于據(jù)報(bào)道 CXCL12 與位于骨髓冗栗、淋巴結(jié)髓索和慢性炎癥組織中的 PC 生態(tài)位中的 PC 遷移和滯留有關(guān)演顾，我們分析了 CXCL12 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)它與 MZB1 的表達(dá)共定位隅居。

為了進(jìn)一步評(píng)估這些不同特征之間的空間協(xié)同定位钠至，每個(gè)特征的表達(dá)被二分法，使用中值作為截止點(diǎn)胎源，為每個(gè)spot定義“高”或“低”表達(dá)類別棉钧。當(dāng)一個(gè)基因被兩個(gè)特征共享時(shí)，它會(huì)從其中一個(gè)特征中刪除涕蚤，以避免其對(duì)統(tǒng)計(jì)分析的影響宪卿。因此的诵，當(dāng)分析 TLS 和 CXCL12 基因表達(dá)之間的重疊時(shí)，從 TLS imprint signature 中刪除了 MZB1 以分析 TLS/MZB1 重疊和 CXCL12佑钾。然后通過計(jì)算兩個(gè)特征之間的卡方檢驗(yàn)來評(píng)估有意義的重疊西疤，并用黃色突出顯示分類為“高/高”的點(diǎn)。該分析不僅證實(shí)了 TLS 特征與 MZB1休溶、成纖維細(xì)胞和 CXCL12 的共定位代赁，而且還證實(shí)了成纖維細(xì)胞與 CXCL12、MZB1 與成纖維細(xì)胞以及 MZB1 與 CXCL12 在距 TLS 一定距離處的共定位兽掰。這些共定位在其他 TLS+ 腫瘤中得到證實(shí)芭碍，而在 TLS-腫瘤中觀察到輕微或無關(guān)聯(lián)∧蹙。總體而言茁瘦，得出結(jié)論葬馋，在 TLS+ 腫瘤中粘昨，表達(dá) IGHG1 和 IGHA1 的 PC 存在于 TLS 附近倾剿，并且可能與成纖維細(xì)胞相關(guān)地在腫瘤內(nèi)遷移。

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Spatial B cell receptor (BCR) profiling identifies in situ hypermutation and clonal selection

TLS 中 B 細(xì)胞成熟亞型和 PC 的共定位暗示了原位 B 細(xì)胞適應(yīng)性免疫的產(chǎn)生宠纯。在此過程中卸夕，B 細(xì)胞會(huì)突變其 B 細(xì)胞受體 (BCR) 序列，并選擇和擴(kuò)增最親和的克隆婆瓜。為了證明這些事件快集，有必要研究 BCR 的核苷酸序列。 Visium 空間技術(shù)基于條形碼轉(zhuǎn)錄本的 RNA 測(cè)序廉白，這能夠訪問原始轉(zhuǎn)錄本并執(zhí)行空間 BCR repertoire 分析个初。使用了公開可用的實(shí)施 MiXCR，這是一種旨在從 50 個(gè) RNA 測(cè)序數(shù)據(jù)中識(shí)別 BCR IgL 和 IgH 克隆型及其種系體細(xì)胞超突變的工具猴蹂，以及 30 Frozen Visium 試劑盒院溺，它使我們能夠獲得足夠長(zhǎng)度的 mRNA 轉(zhuǎn)錄物捕獲大多數(shù) IGL 和一些 IGH 序列的完整互補(bǔ)決定區(qū) (CDR)3 區(qū)域。通過 3 倍推薦深度（每個(gè)點(diǎn) 150,000 個(gè)讀數(shù)磅轻，相當(dāng)于每個(gè)樣本 2.25 億個(gè)讀數(shù)）的測(cè)序促進(jìn)了這種捕獲珍逸。MiXCR 鑒定了許多獨(dú)特的克隆型：總共 3,015 個(gè) λ 輕鏈、3,084 個(gè) kappa 輕鏈和325 重鏈聋溜。在 TLS+ 腫瘤中發(fā)現(xiàn)了最多的獨(dú)特克隆型和總 Ig 計(jì)數(shù)谆膳。在 TLS 區(qū)域也發(fā)現(xiàn)了數(shù)量最多的獨(dú)特輕鏈克隆型。通過測(cè)量 Ig 輕鏈序列的 V 區(qū)的突變計(jì)數(shù)與映射的 V 種系基因進(jìn)行比較來評(píng)估 B 細(xì)胞成熟撮躁。中位 V 基因突變計(jì)數(shù)在 TLS 區(qū)域中顯示低至中位水平漱病，并且引人注目的是，在腫瘤區(qū)域中遠(yuǎn)離 TLS 的大部分是高度突變的序列。盡管如此杨帽，在 TLS 區(qū)域測(cè)量了全范圍的突變漓穿，包括高度突變的序列，而距 TLS 一定距離的大多數(shù) Ig 轉(zhuǎn)錄物富含高度突變的序列注盈，表明體細(xì)胞超突變發(fā)生在 TLS 中晃危，并表明突變的 PC 在整個(gè)腫瘤中遷移. 研究了來自 47 個(gè) ccRCC 腫瘤（包括 Visium 分析的 12 個(gè)冷凍腫瘤）的bulk 50 個(gè) RNA-seq 中的輕鏈和重鏈突變計(jì)數(shù)，這些腫瘤使用 TLS 印記特征的中值表達(dá)被分類為 TLS 高或低当凡。對(duì)于 VL（中位 TLS 高 = 12 個(gè)突變山害，中位 TLS 低 = 8 個(gè)突變，p = 0.0163）和 VH 基因（中位 TLS 高 = 19）沿量，TLS 高與 TLS 低腫瘤的總體體細(xì)胞超突變水平顯著更高突變，中位 TLS 低 = 13.5 個(gè)突變冤荆，p = 0.0227）朴则。為了確定體細(xì)胞超突變是否伴隨著克隆型選擇，研究了bulk 50 RNA-seq 數(shù)據(jù)的 IgH 庫钓简。高 TLS 樣本的所有樣本都表現(xiàn)出大量的總克隆型計(jì)數(shù)以及計(jì)數(shù)超過 100 次的更高比例的克隆型乌妒。事實(shí)上，30% 的 TLS 高腫瘤庫被識(shí)別超過 100 次的克隆型占據(jù)外邓，而 TLS 低腫瘤中這一比例為 1% (p = 10e-7)撤蚊，揭示了 TLS 高樣本中持續(xù)的免疫反應(yīng)。相反损话，TLS-low 樣本顯示出較少的多樣性侦啸，計(jì)數(shù)較低，大多數(shù)被測(cè)量不到 10 次丧枪，除了一個(gè)腫瘤有 123 個(gè) IgH 克隆型光涂，只有 2 個(gè)被計(jì)數(shù)超過 100 次。

最后拧烦，為了確定擴(kuò)增的 IgH 克隆型的克隆關(guān)系和位置忘闻，對(duì) 30 個(gè) RNA-seq 空間數(shù)據(jù)進(jìn)行了克隆性評(píng)估。克隆性由相同的 VH 基因家族恋博、相同的 JH 基因和相同的 CDR3 長(zhǎng)度以及 VH 序列之間的 CDR3 核苷酸序列的最大差異為 15% 來定義齐佳。為了可視化這些關(guān)系，計(jì)算了每個(gè) VH CDR3 序列之間的 Levenshtein 距離债沮，并用 TLS+ 腫瘤的圓形樹表示它炼吴。總共確定了 31 個(gè)具有 2 至 16 個(gè)獨(dú)特成員的克隆家族秦士。在一個(gè)家族中缺厉，一些克隆可以在多達(dá) 20 個(gè)不同的空間位置被檢測(cè)到多達(dá) 80 次。 IgH 克隆型在 Visiumslide 上的定位證明了同一家族的克隆型聚集在 TLS 附近并在遠(yuǎn)處稀疏遷移。一些克隆型甚至可以在距它們所在的 TLS 區(qū)域高達(dá) 3 mm 處檢測(cè)到可能已經(jīng)生成提针。為了證實(shí)這些結(jié)果命爬，在從配對(duì)的bulk 50 RNA-seq 推斷的克隆型中尋找從空間 30 RNA 轉(zhuǎn)錄組學(xué)鑒定的克隆型的 CDR3 核苷酸序列》保克隆家族 1 的 CDR3 序列 CATYNAGEGGRGYW 的克隆型也在bulk 50 個(gè) RNA-seq 數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)饲宛，從而證實(shí)了分析的結(jié)果。此外嗜价，這些克隆型位于 TLS 內(nèi)部和遠(yuǎn)離 TLS 的位置艇抠，表明相應(yīng) B 細(xì)胞克隆的遷移。

在 TLS-low 樣本中久锥，檢測(cè)到的克隆型數(shù)量非常少家淤，阻止了對(duì) Ig 轉(zhuǎn)錄物的分析，也支持了腫瘤內(nèi) PC 主要在 TLS 中產(chǎn)生的假設(shè)瑟由。 總之絮重，這些數(shù)據(jù)支持原位 TLS 介導(dǎo)的成熟，允許在腫瘤的各個(gè)區(qū)域選擇歹苦、克隆擴(kuò)增和傳播選定的 PC青伤。

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Plasma cells disseminate from TLS along fibroblastic tracks

為了分析腫瘤內(nèi) PCs 和成纖維細(xì)胞的位置以及原位 CXCL12 的表達(dá)，使用多發(fā)性骨髓瘤癌基因 1 (MUM1) (IRF4) 作為 PCs 和 COL1 (Col1a) 的特異性標(biāo)志物對(duì) FFPE 腫瘤切片進(jìn)行多重 IF 標(biāo)記) 用于成纖維細(xì)胞殴瘦。在 TLS 區(qū)域內(nèi)檢測(cè)到雙陽性 MUM1+ IgG+ PC 和一些 MUM1+ IgA+ PC狠角，由連續(xù)載玻片上的顯色 CD3/CD20 標(biāo)記定義。在這些區(qū)域觀察到 COL1+/CXCL12+ 成纖維細(xì)胞與 MUM1+ PC 并列蚪腋。此外丰歌，在遠(yuǎn)離 TLS 的地方證明了 PC 沿著成纖維細(xì)胞軌道排列，嵌入在密集的 COL1+ CXCL12+ 成纖維細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)中辣吃，從而證明它們?cè)谀[瘤床中的遷移动遭。為了定量評(píng)估 PC 和成纖維細(xì)胞之間的空間關(guān)系，對(duì) DAPI/MUM1/IgG/IgA IF 染色樣品上的成纖維細(xì)胞核進(jìn)行了 AI 檢測(cè)神得。如下圖所示厘惦，成纖維細(xì)胞核的檢測(cè)映射了 COL1+ 成纖維細(xì)胞軌跡。絕大多數(shù) PC 與成纖維細(xì)胞核非常接近哩簿，兩個(gè)腫瘤的平均距離分別為 17.5 和 19 mm宵蕉，其距離分布下圖所示。在 44 個(gè)腫瘤樣本上測(cè)得的平均距離為 25.7 mm节榜∠勐辏總而言之，這些數(shù)據(jù)概括了 Ig 和成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)錄物的共表達(dá)宗苍，以及成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)錄物和 CXCL12 的共表達(dá)稼稿，并驗(yàn)證了 PC 在 TLS 內(nèi)的位置以及空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)確定的成纖維細(xì)胞網(wǎng)狀細(xì)胞 (FRC) 空間上的位置薄榛。值得注意的是，在被 MUM1+ IgG+ 成纖維細(xì)胞軌道包圍的腫瘤巢中檢測(cè)到與腫瘤細(xì)胞結(jié)合的 IgG让歼。

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TLS and Ig-producing PCs are associated with IgG antibodies bound to apoptotic tumor cells and with response to immunotherapy

為了進(jìn)一步研究 TLS敞恋、腫瘤內(nèi) PC 和 Ig 染色之間的聯(lián)系，首先分析了 TLS 成熟度谋右。 成熟 TLS 的特點(diǎn)是 GC 包含一個(gè)被 T 細(xì)胞區(qū)包圍的 B 細(xì)胞區(qū)硬猫，其中存在 CD4+PD1+ T 細(xì)胞、CD4+ PD1+CXCR5+ Tfh 細(xì)胞和產(chǎn)生 CXCL13 的細(xì)胞改执。 GC 區(qū)的特點(diǎn)是在外圍檢測(cè)到 CD23+ 濾泡樹突細(xì)胞 (FDC)啸蜜、BCL6+ CD20+ B 細(xì)胞和 PNAd+ HEV 網(wǎng)絡(luò)。 研究了 103 個(gè)腫瘤中 TLS 的存在與 PC 密度之間的相關(guān)性辈挂。 觀察到 TLS 的存在與 MUM1+ IgG+ 細(xì)胞和 MUM1+ IgA 細(xì)胞的密度之間存在顯著關(guān)聯(lián)衬横。 進(jìn)一步研究了 57 個(gè) TLS+ 樣本上 TLS 成熟度標(biāo)記與 MUM1+IgG+ 和 MUM1+IgA+ PCs 密度的相關(guān)性。 發(fā)現(xiàn)含有 CD23+ FDC 網(wǎng)絡(luò)终蒂、BCL6+ 細(xì)胞和 PNAd+ HEV 的 TLS 與 MUM1+IgG+ PC 和 MUM1+IgA+ PC 密度之間存在很強(qiáng)的相關(guān)性冕香。

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在腫瘤巢周圍檢測(cè)到高密度的產(chǎn)生 Ig 的 PC 和在腫瘤巢中觀察到 IgG 促使研究抗腫瘤抗體的存在。 值得注意的是后豫，如在 TLS+ 腫瘤中所示，a bright labeling of CAIX+ tumor cell membrane突那，by conjugated anti-human IgG was observed as illustrated in a TLS+ tumor, whereas no labeling was observed in a TLS- tumor挫酿。 隨后對(duì) 103 個(gè)腫瘤的量化顯示 IgG 陽性率很高，與 TLS- 腫瘤相比愕难，TLS+ 中的腫瘤細(xì)胞高達(dá) 100%（中位數(shù)分別為 70% 和 30%早龟，p = 0.0046）。 在 TLS+ 和 TLS- 腫瘤中均觀察到弱 IgA 標(biāo)記猫缭。 此外葱弟，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞上的 IgG 標(biāo)記與 MUM1+ IgG+ PC 的腫瘤浸潤(rùn)之間存在顯著關(guān)聯(lián)（MUM1+IgG+ 高腫瘤的中位 IgG 標(biāo)記 = 80%，MUM1+IgG+ 低腫瘤的中位 IgG 標(biāo)記 = 40%猜丹，p = 0.000195） , IgA 標(biāo)記非常低芝加。

為了揭示腫瘤結(jié)合 IgG 抗體的潛在功能，使用檢測(cè)切割的半胱天冬酶 3 的抗體搜索腫瘤細(xì)胞中發(fā)生的細(xì)胞凋亡跡象射窒，通過其典型的大細(xì)胞核和透明細(xì)胞表型鑒定藏杖。下圖說明了切割半胱天冬酶 3 在 一個(gè) TLS+ 和一個(gè) TLS- 腫瘤。 在 IgG 染色高于 60%（這是區(qū)分兩個(gè)腫瘤群的最佳平均值）的腫瘤中脉顿，裂解的 caspase 3+ 腫瘤細(xì)胞的密度顯著高于 IgG+ 腫瘤細(xì)胞低于 60% 的腫瘤（中位數(shù)：12.7 個(gè)細(xì)胞/ mm2 和 7.2 個(gè)細(xì)胞/mm2蝌麸，p = 0.0255）。

這里解決了可能在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡中起作用的機(jī)制的問題艾疟。由于巨噬細(xì)胞和 NK 細(xì)胞是抗體依賴性細(xì)胞毒性 (ADCC) 的主要效應(yīng)物来吩，分別評(píng)估了 76 和 98 個(gè)腫瘤上 CD68+ 巨噬細(xì)胞和 NKp46+NK 細(xì)胞的總密度敢辩，found no correlation with the density of cleaved caspase-3+ tumor cells。然而弟疆，發(fā)現(xiàn)具有大量凋亡細(xì)胞和高百分比 IgG 染色腫瘤細(xì)胞的腫瘤比具有大量凋亡細(xì)胞但低百分比 IgG 染色腫瘤細(xì)胞的腫瘤更容易被 CD68+ 巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)（p = 0.0054 ）戚长。接近性評(píng)估證明 14 個(gè)腫瘤上 CD68+ 巨噬細(xì)胞和裂解的 caspase 3+ 腫瘤細(xì)胞呈正相關(guān)，凋亡細(xì)胞數(shù)量多兽间，IgG 染色腫瘤細(xì)胞百分比高历葛。NK 細(xì)胞的密度低于巨噬細(xì)胞，并沒有表現(xiàn)出這種相關(guān)性嘀略。此外恤溶，發(fā)現(xiàn) 13.6% 的凋亡腫瘤細(xì)胞位于小于 25 mm 的巨噬細(xì)胞處，而沒有觀察到 NK 細(xì)胞和凋亡腫瘤細(xì)胞之間的緊密接近（中位數(shù) = 0.5%）帜羊。

為了評(píng)估 IgG 腫瘤染色對(duì) ICI 治療患者的影響咒程，我們?cè)u(píng)估了來自 NI 治療患者的 35 個(gè)腫瘤和來自 Nivolumab 治療患者的 16 個(gè)腫瘤（一名 Nivolumab 治療患者的 IgG 腫瘤染色不可評(píng)估，一名患者缺少臨床信息） .我們選擇平均 IgG 腫瘤染色 (60%) 作為截止值讼育，因?yàn)樗鼌^(qū)分了最好的兩個(gè)腫瘤群體帐姻。對(duì)于 NI 治療的患者，證明了 IgG 腫瘤細(xì)胞標(biāo)記高于平均值的患者的治療反應(yīng)與 62% 的客觀反應(yīng)（OR：完全和部分反應(yīng)）之間存在顯著關(guān)聯(lián)奶段，而 IgG 腫瘤細(xì)胞標(biāo)記低于平均值的患者為 18% OR (p = 0.0384)饥瓷，以及與低 IgG 腫瘤細(xì)胞染色相比，高 IgG 腫瘤細(xì)胞染色患者的 PFS 顯著延長(zhǎng)（中位 PFS = 16.3 個(gè)月對(duì) 6.4 個(gè)月痹籍，p = 0.039）呢铆。僅接受 Nivolumab 治療的患者隊(duì)列太小，無法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析蹲缠。然而棺克，在接受 ICI 治療的 51 名患者中，無論是單用 Nivolumab 還是 NI线定，對(duì)于腫瘤染色高的患者（未達(dá)到與 6.4 個(gè)月娜谊，p = 0.019）相比，觀察到 PFS 顯著延長(zhǎng)斤讥，并且 OR 數(shù)量呈增加趨勢(shì)（58% 對(duì) 32%）纱皆。

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DISCUSSION，這里提到了組織的3D模型周偎，從立體上分析腫瘤異質(zhì)性

Our study has several limitations. Spatial transcriptomic analyses reveal the architecture of a limited part of a tumor and do not take into consideration potential 3D tumor heterogeneity. This limitation is inherent to this type of analysis抹剩。

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Methods（關(guān)注一下重點(diǎn)）

Quantitative evaluation of TLS and cell densities

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Artificial intelligence (AI) assisted spatial proximity analysis

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空間共定位

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BCR repertoire profiling

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生活很好，有你更好