hello，周四了落君，這是第399篇文章穿香，不知不覺中，已經(jīng)寫了很多了叽奥，但是前進(jìn)的腳步是不能停止的扔水，感覺自己要進(jìn)入下一個階段了，因?yàn)椴荒軆H僅局限于分享別人的內(nèi)容朝氓，要提升自己魔市，就需要自己來合作發(fā)文章了。

今天我們繼續(xù)分享單細(xì)胞空間聯(lián)合分析的方法文章赵哲，在Integrated single-cell and spatial transcriptomic analyses unravel the heterogeneity of the prostate tumor microenvironment待德，現(xiàn)在的文章用到單細(xì)胞空間聯(lián)合的，都發(fā)的很高枫夺，物以稀為貴将宪，如果大家有單細(xì)胞空間的樣本要分析，請抓緊橡庞，現(xiàn)在發(fā)较坛，發(fā)到Cell也很有可能。

先放上細(xì)胞定義的marker

Highlights

● Characterization of prostate cancer by combined scRNA-seq and spatial transcriptomic analysis
● Primary prostate cancer establishes a suppressive immune microenvironment
● The prostate tumor microenvironment exhibits a high angiogenic gene expression pattern
● A new computational analysis pipeline to deconvolute context-specific differential gene expression

先來簡單總結(jié)一下重點(diǎn)

• 分析點(diǎn)1 細(xì)胞豐度的變化扒最，尤其是免疫細(xì)胞
• 空間組織的研究（腫瘤狀態(tài)下相對于正常組織的破壞程度）
• 空間臨近通訊（配受體的空間阻隔作用丑勤，空間鄰近性可能是識別相關(guān)交互的一種過濾器）
• 腫瘤中巨噬細(xì)胞的作用（M1，M2）

Summary

原發(fā)性前列腺癌的治療巧妙地平衡了低風(fēng)險疾病的主動監(jiān)測方法與多模式治療吧趣，包括手術(shù)法竞、放射治療和高風(fēng)險疾病的激素治療。轉(zhuǎn)移性疾病的復(fù)發(fā)和發(fā)展仍然是一個臨床問題强挫，沒有清楚地了解是什么驅(qū)動了免疫逃逸和腫瘤進(jìn)展岔霸。在這里，研究試圖全面描述局部前列腺癌的腫瘤微環(huán)境俯渤，并將其與相鄰的正常樣本和健康對照進(jìn)行對比呆细。分析進(jìn)行了單細(xì)胞 RNA 測序和高分辨率空間轉(zhuǎn)錄組分析。這揭示了基因表達(dá)的腫瘤背景依賴性變化八匠。數(shù)據(jù)指向與抑制性骨髓種群和耗盡的 T 細(xì)胞相關(guān)的免疫抑制性腫瘤微環(huán)境侦鹏，以及高基質(zhì)血管生成活性。分析以前所未有的規(guī)模推斷了未解離組織切片中配體-受體相互作用的細(xì)胞間關(guān)系臀叙。

Introduction

Localized prostate cancer 是一種臨床異質(zhì)性疾病略水。 一些患者患有可以安全觀察的惰性低風(fēng)險前列腺腫瘤，而另一些患者則患有侵襲性高風(fēng)險疾病劝萤，即使在最先進(jìn)的治療后也具有很大的復(fù)發(fā)風(fēng)險渊涝。 盡管努力早期發(fā)現(xiàn)和改進(jìn)目前的治愈性治療，但不幸的是，許多患者經(jīng)歷了復(fù)發(fā)和疾病進(jìn)展跨释。 所以仍然非常需要進(jìn)一步了解前列腺癌胸私，其中前列腺腫瘤微環(huán)境 (TME) 的生物學(xué)見解可能有助于確定新的治療靶點(diǎn)。 這里檢查了前列腺 TME 內(nèi)的支持性細(xì)胞狀態(tài)和分子關(guān)系鳖谈，以確定驅(qū)動腫瘤生長的變化岁疼。

單細(xì)胞基因表達(dá)技術(shù)使評估單個樣本中的數(shù)千個細(xì)胞成為可能，揭示了腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性和復(fù)雜 TME 的subtletie缆娃。 對正常成人前列腺和前列腺癌的檢查提供了對前列腺腺癌和神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中上皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞以及細(xì)胞狀態(tài)的詳細(xì)研究捷绒。 然而，前列腺微環(huán)境中的免疫細(xì)胞尚未在單細(xì)胞水平上進(jìn)行嚴(yán)格的表征贯要。 前列腺 TME 通常包含很少的免疫細(xì)胞暖侨，據(jù)推測，這一特征可以解釋前列腺癌對免疫治療的普遍反應(yīng)不佳崇渗。 因此字逗，使用富集和保存免疫細(xì)胞群的方法處理新鮮的前列腺和腫瘤樣本，以便以高分辨率表征免疫微環(huán)境宅广。

為了驗(yàn)證單細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)葫掉，使用了 parallel spatial transcriptomic technique (Slide-seqV2)，其中保留了組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞-細(xì)胞鄰近關(guān)系跟狱。 因此挖息，還表征了來自低風(fēng)險和高風(fēng)險前列腺癌患者的腫瘤空間組織。 此外兽肤，分析開發(fā)了一種新的數(shù)據(jù)分析計(jì)算方法，以檢查腫瘤細(xì)胞對鄰近基質(zhì)細(xì)胞（包括成纖維細(xì)胞绪抛、周細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞）的轉(zhuǎn)錄影響资铡。

Together, this work provides a compendium of the prostate TME with a particular focus on immune populations. We further reveal the transcriptional state of stromal cells based on their spatial localization within the tumor. In sum, our data reveal a highly immune suppressive TME and describe tumor-induced alterations of neighboring cells that promote tumorigenesis and progression.

Results

The prostate TME characterized by single-cell and spatial transcriptomic analysis

從 19 名被診斷患有前列腺腺癌并接受根治性前列腺切除術(shù)的初治患者中收集了新鮮的前列腺癌樣本。 在 19 名患者中的 14 名中幢码，還對與腫瘤相鄰的匹配的“正丑孕荩”良性前列腺組織進(jìn)行了取樣。 作為對照症副，從 4 名患者（因膀胱癌接受膀胱前列腺切除術(shù)）采集未患癌癥的前列腺組織樣本店雅，并從一名轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌患者的快速尸檢中采集了一個健康的前列腺。

在一系列原發(fā)性腫瘤等級和階段中檢查了前列腺 TME 的細(xì)胞組成贞铣。 樣品分為low-grade and high-grade闹啦。 通過熒光激活細(xì)胞分選 (FACS) 從健康前列腺組織 (n=5)、前列腺腫瘤組織 (n=12 LG 和 n=7 HG) 和鄰近的非紅細(xì)胞中收集活的非紅細(xì)胞 (DAPIneg/CD235neg) 腫瘤涉及前列腺組織（n = 11 LG 和 n = 4 HG辕坝，以下稱為“相鄰正城戏埽”）。 我們從 14 名患者中收集了成對的腫瘤組織和鄰近正常組織樣本（n=10 LG 和 n=4 HG）。 所有患者均進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)病理評估以確認(rèn)其診斷琳袄。

分析了 179,359 個單細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組（平均每個樣品 4,721 個細(xì)胞和每個細(xì)胞 50,416 個轉(zhuǎn)錄本）江场。 Conos (Clustering On Network Of Samples) 對樣本進(jìn)行了aligned，對產(chǎn)生的聯(lián)合細(xì)胞clusters的分析揭示了豐富的免疫細(xì)胞和非免疫基質(zhì)細(xì)胞窖逗。 根據(jù)細(xì)胞類型特異性基因標(biāo)記對細(xì)胞類型進(jìn)行注釋址否，形成 16 個主要clusters。

值得注意的是碎紊，解離方案經(jīng)過優(yōu)化以富集免疫細(xì)胞佑附。 這是一個專注于前列腺免疫 TME 的有意選擇，目的是了解為什么前列腺癌被認(rèn)為免疫原性差矮慕，因此很少對免疫治療產(chǎn)生反應(yīng)帮匾。 在將組織處理方法（膠原酶+分散酶）與已發(fā)表的單細(xì)胞前列腺研究方案（Rocky）進(jìn)行比較時，膠原酶+分散酶釋放了更高比例的免疫細(xì)胞痴鳄。 令人欣慰的是瘟斜，兩種解離方案釋放的細(xì)胞顯示出相似的轉(zhuǎn)錄組譜。

就主要細(xì)胞群的豐度而言痪寻，在將腫瘤樣本與相鄰正常樣本進(jìn)行比較時螺句，在漿細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的整體水平上觀察到了顯著但很小的絕對差異橡类。 對低級別 (LG) 和高級別 (HG) 病例進(jìn)行分層蛇尚，漿細(xì)胞（adj-正常與腫瘤，LG）顾画、巨噬細(xì)胞（adj-正常與腫瘤取劫，LG）和內(nèi)皮細(xì)胞（ 健康與 adj-N LG）。 即使在具有相同 Gleason 評分的患者中研侣，細(xì)胞豐度的少數(shù)顯著差異也可能是由于患者之間的高變異性谱邪。

使用加權(quán)表達(dá)距離檢查樣本之間轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的總體相似性，顯示與調(diào)整正常和健康部分相比庶诡，腫瘤部分之間的患者間變異性顯著增加惦银。 這表明不同患者腫瘤區(qū)域中細(xì)胞狀態(tài)的不同軌跡。

為了使用保留組織結(jié)構(gòu)的無解離方法驗(yàn)證單細(xì)胞發(fā)現(xiàn)末誓，使用 Slide-seqV2 進(jìn)行了空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)扯俱。 這提供了以高空間分辨率檢查腫瘤組織的機(jī)會。 新鮮冷凍的 10 微米切片取自健康前列腺樣本和兩個前列腺腫瘤樣本（一個低級和一個高級）以及它們相應(yīng)的鄰近正常組織 喇澡。

穩(wěn)健的細(xì)胞類型分解 (RCTD) 用于根據(jù) scRNA-seq 參考數(shù)據(jù)分配細(xì)胞類型注釋（大家可以參考文章10X單細(xì)胞空間聯(lián)合分析之十（RCTD））迅栅。 表示不同細(xì)胞群的標(biāo)志基因用于驗(yàn)證 RCTD 注釋。 正如預(yù)期的那樣晴玖，與 scRNA-seq 數(shù)據(jù)相比库继，Slide-seqV2 測量結(jié)果顯示細(xì)胞比例差異更明顯箩艺，上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞群大大增加，免疫細(xì)胞比例顯著減少宪萄。

通過 Slide-seqV2 的鏡頭觀察到的細(xì)胞結(jié)構(gòu)與人們對標(biāo)準(zhǔn) H&E 染色的預(yù)期完全一致艺谆。 健康前列腺組織的高度詳細(xì)的空間配置顯示了組織良好的前列腺上皮腺體，周圍環(huán)繞著免疫和非免疫基質(zhì)細(xì)胞拜英，包括成纖維細(xì)胞静汤、周細(xì)胞、肥大細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞居凶。 這種結(jié)構(gòu)在癌性前列腺中被明顯破壞虫给。 使用 Moran's I 評分通過空間自相關(guān)來量化組織組織的差異，該評分評估細(xì)胞聚集（高分）或分散（低分）的程度侠碧。 與健康組織相比抹估，腫瘤中成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞的 Moran's I 評分顯著降低弄兜。

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A Prostate Tumor Gene Signature distinguishes normal and malignant luminal epithelial cells

無監(jiān)督聚類揭示了四個上皮亞群：basal, luminal, club, and hillock药蜻，由關(guān)鍵標(biāo)記基因表達(dá)表示。 club and hillock細(xì)胞被確定為小鼠肺細(xì)胞圖譜中的過渡細(xì)胞替饿。 這些細(xì)胞在人類前列腺組織和良性人類前列腺類器官中也有報道语泽，但它們在前列腺腫瘤發(fā)生中的作用仍不清楚。

使用 RNA 速度來推斷上皮細(xì)胞分化的可能軌跡视卢。 一條軌跡表明踱卵，club細(xì)胞充當(dāng)腔細(xì)胞祖細(xì)胞，這是先前在前列腺癌中報道的觀察結(jié)果据过。 第二個不同的軌跡顯示一致的定向流動惋砂，表明hillock細(xì)胞可能充當(dāng)基底細(xì)胞的祖細(xì)胞。 比較健康和腫瘤相關(guān)hillock和club細(xì)胞的差異基因表達(dá)分別顯示參與泌尿生殖系統(tǒng)發(fā)育和上皮管形態(tài)發(fā)生的基因富集绳锅，并且已知這些細(xì)胞在尿道和尿道周圍前列腺區(qū)富集西饵。

Chromosomal aberrations和 inferCNV 分析使我們能夠?qū)盒怨芮患?xì)胞（具有基因組畸變）與腫瘤內(nèi)的正常管腔細(xì)胞分開。 DEG 分析用于識別惡性細(xì)胞的表達(dá)特征榨呆，導(dǎo)致由八個基因組成的特征，我們將其稱為“前列腺腫瘤基因特征”庸队。 我們將此基因特征應(yīng)用于已發(fā)表的前列腺組織的bulk RNA-seq积蜻，證明了在四個獨(dú)立數(shù)據(jù)集中區(qū)分腫瘤樣本與相鄰正常樣本的一致能力。

由于能夠?qū)⒛[瘤樣本中的惡性細(xì)胞與正常上皮細(xì)胞區(qū)分開來彻消，因此評估了異質(zhì)性竿拆。 惡性細(xì)胞的獨(dú)立成分分析 (ICA) 揭示了惡性clusters的三個主要方面。 基因 (GO) 通路分析顯示惡性cluster 1 (C1) 中細(xì)胞生長和上皮細(xì)胞遷移相關(guān)基因的富集宾尚。 cluster 1 還顯示 EGR1丙笋、IER2 和 KLF6 基因的高表達(dá)谢澈，表明在前列腺癌進(jìn)展、運(yùn)動和轉(zhuǎn)移中的作用御板。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）在前列腺癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中起重要作用锥忿。 與來自三種不同樣本類型（健康、調(diào)整正常和腫瘤）的非惡性管腔細(xì)胞相比怠肋，惡性細(xì)胞顯示出顯著更高的 EMT 基因特征敬鬓。

在空間上，健康的前列腺表現(xiàn)出有組織的腺上皮笙各，具有結(jié)構(gòu)良好的基底細(xì)胞和腔細(xì)胞雙層钉答。 調(diào)整正常樣本隨著管腔上皮群體的擴(kuò)大和組織良好的腺體的喪失而不同。 使用 RCTD 注釋上皮亞群并使用上皮細(xì)胞類型特異性標(biāo)記基因進(jìn)行驗(yàn)證杈抢。 如空間自相關(guān)所示数尿，腫瘤和調(diào)整正常樣本中的棒狀細(xì)胞和hillock細(xì)胞的正常cluster被破壞。

從單細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中獲得的“前列腺腫瘤基因特征”應(yīng)用于 Slide-seqV2 結(jié)果惶楼。 這種八基因腫瘤特征成功識別了從 HG 病例中收集的腫瘤細(xì)胞右蹦。 在健康和調(diào)整正常的樣本中幾乎沒有這樣的細(xì)胞被注釋，這說明了這個“前列腺腫瘤基因特征”的準(zhǔn)確性鲫懒。

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Context-dependent differential expression with linear admixture correction

擴(kuò)大腫瘤的邊緣或邊界在 HG 樣本中特別明顯嫩实，可以分割成兩個不同的空間背景。 腫瘤環(huán)境以腫瘤細(xì)胞的密集積累為主窥岩，而與腫瘤相鄰的環(huán)境主要由非惡性上皮細(xì)胞組成甲献。 在調(diào)整正常樣本中檢測到的一小部分腫瘤細(xì)胞可能代表腫瘤細(xì)胞的真實(shí)浸潤。 Slide-seqV2 允許人們檢查與精確空間背景相關(guān)的細(xì)胞狀態(tài)差異颂翼。 RCTD 等注釋工具估計(jì)對每個spot有貢獻(xiàn)的細(xì)胞類型的分?jǐn)?shù)晃洒，并確定可以自信地分配給特定細(xì)胞類型的相對純的spot。 然而朦乏，即使是“純”spot也可以攜帶來自相鄰細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組混合物球及。

由于細(xì)胞鄰域的組成在不同的組織環(huán)境之間變化，這種混合物將嚴(yán)重偏向環(huán)境之間細(xì)胞狀態(tài)的轉(zhuǎn)錄比較呻疹。 為了克服這種混合效應(yīng)吃引，開發(fā)了一種新的計(jì)算方法，它消除了可能歸因于來自其他細(xì)胞類型的混合的背景相關(guān)差異刽锤，重點(diǎn)關(guān)注可能反映靶細(xì)胞類型轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的背景相關(guān)變化的殘余差異镊尺。 在隨后的部分中，應(yīng)用這種方法來對比腫瘤和腫瘤相鄰環(huán)境之間的基質(zhì)群體的狀態(tài)并思。

The prostate tumor microenvironment exhibits high endothelial angiogenic activity

非免疫基質(zhì)包括成 fibroblasts, endothelial cells and pericytes庐氮，代表了 TME 的重要組成部分，其功能和豐度因癌癥類型而異宋彼。 確定了五個基質(zhì)亞群弄砍，包括兩個內(nèi)皮細(xì)胞仙畦、兩個周細(xì)胞和一個基于關(guān)鍵標(biāo)記基因表達(dá)注釋的成纖維細(xì)胞亞群。

Endothelial-1 細(xì)胞顯示高表達(dá) SELE/SELP/CLU/PLVAP音婶，這是竇狀內(nèi)皮細(xì)胞的特征慨畸，而 Endothelial-2 細(xì)胞表達(dá)常見的動脈基因 (HEY1/IGFBP3/FBLN5)。 Endothelial-2 細(xì)胞的基因 (GO) 分析指出了參與血管發(fā)育和血管生成的途徑桃熄。 血管生成基因特征表明先口，與其他基質(zhì)群體相比，以及在比較幾乎所有群體的健康和腫瘤細(xì)胞時瞳收，與腫瘤相關(guān)的 Endothelial-2 細(xì)胞得分最高碉京。 不同基質(zhì)亞群的血管生成評分在 LG 和 HG 腫瘤樣本之間沒有差異。

在 Slide-seqV2 空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)平臺內(nèi)檢查 Endothelial-2 細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組變化螟深，比較“腫瘤”和“腫瘤相鄰”的背景谐宙，通路富集分析與腫瘤的單細(xì)胞數(shù)據(jù)一致，showing upregulation of sprouting angiogenesis and vascular endothelial growth factor pathways界弧。

腫瘤環(huán)境中的Endothelial-2 細(xì)胞也顯示出細(xì)胞遷移和增殖途徑的上調(diào)凡蜻。 這與腫瘤組織內(nèi)Endothelial-2細(xì)胞的分散組織相一致，與調(diào)整正常和健康樣本的組織良好的結(jié)構(gòu)形成對比垢箕，這通過空間自相關(guān)分析進(jìn)行了量化划栓。 總體而言，這突出了內(nèi)皮細(xì)胞與腫瘤血管化和遷移的相關(guān)性条获，這與前列腺癌疾病進(jìn)展相關(guān)

血管周細(xì)胞是血管系統(tǒng)的另一個組成部分忠荞。這些細(xì)胞表現(xiàn)出具有多能性的間充質(zhì)特征，并且它們在脈管系統(tǒng)發(fā)育中的作用已經(jīng)確立帅掘，而它們在癌癥進(jìn)展中的作用尚不清楚委煤。分析確定了兩個周細(xì)胞亞群。 Pericyte-1 細(xì)胞中的表達(dá)模式富含參與細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織和結(jié)締組織發(fā)育的途徑修档，而 Pericyte-2 細(xì)胞表現(xiàn)出與血管平滑肌細(xì)胞 (VSMC) 一致的肌肉收縮基因特征碧绞。此外，與健康前列腺相比吱窝，從癌性前列腺收集的樣本中兩種周細(xì)胞亞群的血管生成基因特征顯著增加讥邻。在空間上，與健康和 adj 正常樣本相比院峡，Pericyte-1 細(xì)胞分散在腫瘤樣本中兴使。總之撕予，這些數(shù)據(jù)表明周細(xì)胞在前列腺癌進(jìn)展過程中的血管生成和重塑腫瘤基質(zhì)中的作用鲫惶。

癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞 (CAF) 通過促進(jìn)腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移蜈首、增強(qiáng)血管生成和介導(dǎo)免疫抑制实抡，在塑造 TME 中發(fā)揮關(guān)鍵作用欠母。 CAF 與許多癌癥類型的不良預(yù)后相關(guān)。 在前列腺癌中吆寨，CAF 在疾病早期階段的癌癥發(fā)展中發(fā)揮著因果作用赏淌，有助于治療抵抗和轉(zhuǎn)移進(jìn)展。 成纖維細(xì)胞基因表達(dá)模式顯示膠原纖維組織啄清、細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織和結(jié)締組織發(fā)育途徑的富集六水。 在 Slide-seq 差異基因分析中也確定了這些相同的途徑，將腫瘤與腫瘤相鄰環(huán)境進(jìn)行比較辣卒。 這些數(shù)據(jù)表明成纖維細(xì)胞在前列腺 TME 中誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)重塑中的作用掷贾，這反過來對腫瘤進(jìn)展很重要。

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Coordination between tumor cells and stromal compartment in tumor context（共定位分析）

利用 Slide-seqV2 空間信息來檢查腫瘤生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)細(xì)胞之間的潛在通信渠道荣茫。 雖然細(xì)胞間信號的重要性得到了認(rèn)可想帅，但很難推斷哪些細(xì)胞相互通信以及通過哪些通道進(jìn)行通信。 可能關(guān)系的預(yù)測基于配體和同源受體對的表達(dá)啡莉，通常會導(dǎo)致許多潛在的相互作用港准； 需要額外的過濾器來區(qū)分功能相關(guān)的通道。 推斷空間鄰近性可能是識別相關(guān)交互的一種過濾器咧欣。

這里query相應(yīng)的配體和受體基因是否在直接位于每個配體和受體基因旁邊的細(xì)胞中表現(xiàn)出協(xié)同上調(diào)浅缸。 Slide-seqV2 數(shù)據(jù)用于繪制物理相鄰細(xì)胞的圖形，這允許測試配體受體 (LR) 評分（定義為兩個相應(yīng)表達(dá)水平的乘積）是否在物理相鄰細(xì)胞中顯著高于空間距離較遠(yuǎn)的細(xì)胞魄咕。 從約 1200 個配體-受體相互作用的參考列表中衩椒，分析揭示了 405 個具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的潛在溝通渠道。

以腫瘤-基質(zhì)通訊為重點(diǎn)蚕礼，我們在將腫瘤細(xì)胞視為配體來源和將基質(zhì)細(xì)胞視為表達(dá)受體時研究了通訊渠道烟具。 腫瘤細(xì)胞表達(dá)血管內(nèi)皮生長因子（VEGFA 和 VEGFB），可通過 VEGF 受體奠蹬、FLT1 和 β-1 整合素刺激Endothelial-2朝聋。 這些通道可能解釋腫瘤相關(guān)內(nèi)皮-2亞群狀態(tài)的促血管生成轉(zhuǎn)變。 還觀察到腫瘤細(xì)胞與成纖維細(xì)胞 (COL9A2-ITGA1) 和腫瘤細(xì)胞與 Pericytes-2 細(xì)胞 (COL12A1-ITGA1) 之間的潛在相互作用囤躁，這些通路均涉及細(xì)胞外基質(zhì)重塑和細(xì)胞遷移冀痕。

反向相互作用分析（即基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)腫瘤受體的配體）揭示了由成纖維細(xì)胞胰島素樣生長因子 (IGF1) 刺激腫瘤細(xì)胞 IGF1 受體介導(dǎo)的潛在相互作用。 已知 IGF 通路通過抑制細(xì)胞凋亡和激活細(xì)胞周期來促進(jìn)腫瘤生長和存活狸演。 IGF1-IGF1R 相互作用的 Slide-seqV2 分析證實(shí)了表達(dá) IGF1R 的腫瘤細(xì)胞和表達(dá) IGF1 的成纖維細(xì)胞的共定位言蛇。

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Prostate tumors are enriched in immunosuppressive myeloid cells

骨髓細(xì)胞支持幾種癌癥類型的腫瘤進(jìn)展，這些細(xì)胞被認(rèn)為是臨床上最相關(guān)的群體之一宵距，可用于免疫治療目的腊尚。 無監(jiān)督聚類揭示了 7 個骨髓亞群，包括 3 個單核細(xì)胞满哪、3 個巨噬細(xì)胞和 1 個骨髓 DC (mDC)婿斥。 基于關(guān)鍵標(biāo)記基因進(jìn)行注釋劝篷，并使用已發(fā)表的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞基因特征進(jìn)行驗(yàn)證。

單核細(xì)胞亞群的特征是 CD16hi (CD16hi Mo)民宿，稱為非經(jīng)典單核細(xì)胞娇妓，腫瘤炎癥單核細(xì)胞 (TIMo) 具有高表達(dá) CD14（經(jīng)典單核細(xì)胞標(biāo)志物）以及炎癥基因特征的最高表達(dá)。 第三個亞群被注釋為單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞 (Mo-MΦ)活鹰，因?yàn)樗@示出它們的基因表達(dá)從單核細(xì)胞中高表達(dá)的基因（例如哈恰，S100A9）到巨噬細(xì)胞中表達(dá)的基因（例如，C1QA）的逐漸轉(zhuǎn)變志群，表明過渡細(xì)胞 從單核細(xì)胞到巨噬細(xì)胞的狀態(tài)着绷。

腫瘤細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞都產(chǎn)生參與骨髓分化過程以及單核細(xì)胞向腫瘤募集的趨化因子。 我們觀察到成纖維細(xì)胞中 CXCL12锌云、周細(xì)胞中 CCL2 和上皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中 CCL3蓬戚、4 和 5 的高表達(dá)蘸炸，表明成纖維細(xì)胞和周細(xì)胞在將單核細(xì)胞募集到前列腺腫瘤中的潛在作用堰怨。

前列腺癌患者對腫瘤的免疫反應(yīng)無效瞬内，免疫抑制性 TME 與髓源抑制細(xì)胞 (MDSC) 的積累有關(guān)麻裳。 TIMo 細(xì)胞的 MDSC 基因特征得分最高幕垦，與健康前列腺組織相比循诉，從癌性前列腺（腫瘤和 adj-正常）收集的細(xì)胞中的基因特征顯著更高渡嚣。 這表明 TIMo 亞群通過免疫抑制活性和促炎細(xì)胞因子的釋放在前列腺腫瘤生長中發(fā)揮作用洁仗。

前列腺癌患者對腫瘤的免疫反應(yīng)無效讲衫，免疫抑制性 TME 與髓源抑制細(xì)胞 (MDSC) 的積累有關(guān)缕棵。 TIMo 細(xì)胞的 MDSC 基因特征得分最高，與健康前列腺組織相比涉兽，從癌性前列腺（腫瘤和 adj-正常）收集的細(xì)胞中的基因特征顯著更高招驴。 這表明 TIMo 亞群通過免疫抑制活性和促炎細(xì)胞因子的釋放在前列腺腫瘤生長中發(fā)揮作用。

鑒定了幾個巨噬細(xì)胞亞群枷畏，包括具有高“炎癥基因特征”的腫瘤炎性巨噬細(xì)胞 (TIMΦ)别厘、具有高“抗原加工和呈遞基因特征”的抗原呈遞巨噬細(xì)胞 (AP MΦ)，以及 M2 巨噬細(xì)胞 (M2- MΦ) 具有高“M2 樣基因特征”拥诡。 M2-MΦ 顯示從健康到腫瘤部分的細(xì)胞豐度逐漸增加触趴，并且已顯示 M2 樣巨噬細(xì)胞在廣泛的腫瘤中抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)。 在前列腺癌中渴肉，腫瘤組織中 M2 樣巨噬細(xì)胞的高度浸潤與腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移有關(guān)冗懦。

在與單細(xì)胞表達(dá)相同的組織樣本上進(jìn)行的多重免疫組織化學(xué) (mIHC) 證實(shí)，與匹配的 adj 正常組織相比仇祭，腫瘤組織中 CD68+ 巨噬細(xì)胞和 CD68+CD163+ M2-MΦ 的浸潤更高披蕉。 在高 Gleason 評分（4+4、4+5、5+5）的情況下没讲，M2-MΦ 對腫瘤浸潤的量化更為明顯承冰。 M2-MΦ 表達(dá)高水平的與血管生成有關(guān)的基因，如血管生成因子 EGFL7 和腫瘤轉(zhuǎn)移中的基因食零，如 LYVE1 和 NRP1，表明 M2-MΦ 浸潤在腫瘤內(nèi)血管生成中的作用寂屏。

髓樣樹突狀細(xì)胞 (mDC) 將腫瘤抗原呈遞給 T 細(xì)胞贰谣，在適應(yīng)性抗腫瘤免疫反應(yīng)的啟動和調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。 分析確定了三個 mDC 亞群迁霎，每個亞群都高表達(dá) CD1C吱抚、CLEC9A 或 LAMP3。 不同 mDCs 亞群的細(xì)胞豐度未觀察到顯著變化

總體而言考廉，骨髓細(xì)胞的分析確定了可能導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展的免疫抑制亞群秘豹，包括 MDSC 樣單核細(xì)胞 (TIMo) 和具有 M2 樣特征的巨噬細(xì)胞。

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Prostate cancer is characterized by T-cell exhaustion and immunosuppressive Treg activity

適應(yīng)性免疫系統(tǒng)在啟動針對腫瘤的有效抗原特異性免疫反應(yīng)方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用昌粤。 lymphoid compartment的無監(jiān)督聚類揭示了四個 CD4+ T 細(xì)胞既绕、三個 CD8+ T 細(xì)胞和兩個 NK 亞群，由關(guān)鍵標(biāo)記基因注釋涮坐。 使用細(xì)胞毒性基因特征（“細(xì)胞毒性評分”）測定 CD8+ T 細(xì)胞的功能狀態(tài)凄贩。 與其他 CTL-1 和 CTL-2 CD8+ 亞群相比，CD8+ 效應(yīng)細(xì)胞表現(xiàn)出更高的細(xì)胞毒性評分袱讹，并且 CD8+ 效應(yīng)細(xì)胞的細(xì)胞毒性評分在不同樣品組分中是一致的疲扎。

與健康前列腺組織相比，CTL-1 和 CD8+ 效應(yīng)細(xì)胞都表現(xiàn)出更高的 T 細(xì)胞衰竭基因特征表達(dá)捷雕，并且前列腺腫瘤和 adj 正常樣本中的衰竭評分更高椒丧。 在比較來自 LG 和 HG 樣品的細(xì)胞時，沒有觀察到exhaustion score 的顯著差異救巷。 與健康前列腺組織相比壶熏，T 細(xì)胞豐度的測量顯示從癌性前列腺收集的組織中耗盡的 CTL-1 細(xì)胞比例更高，這表明前列腺腫瘤中耗盡的 CTL 擴(kuò)增浦译。 比較 LG 和 HG Gleason 組時久橙，T 細(xì)胞豐度未觀察到差異。

根據(jù)細(xì)胞類型特異性基因管怠，CD4+ T 細(xì)胞被細(xì)分為初始細(xì)胞淆衷、T-helper-1 (Th1)、T-helper-17 (Th17) 和 T-調(diào)節(jié) (Treg) 細(xì)胞渤弛。 CD4+ 細(xì)胞豐度在不同樣品組分中是穩(wěn)定的祝拯。 作為 CD4+ T 細(xì)胞功能的替代物，檢測了 Treg 活性并在腫瘤和 adj 正常樣本中增加。 值得注意的是佳头，腫瘤壞死因子受體超家族 TNFRSF9鹰贵、TNFRSF18 和 TNFRSF4 的基因在浸潤腫瘤的 Treg 中高度且唯一地表達(dá)。 這些受體結(jié)合腫瘤壞死因子康嘉、參與炎癥相關(guān)癌變的促炎細(xì)胞因子和支持免疫抑制性 TME碉输。

Tregs 和 MDSCs 代表了兩種對癌癥免疫耐受很重要的免疫抑制細(xì)胞群。 兩個群體在腫瘤部分都表現(xiàn)出高抑制活性亭珍，并且它們的串?dāng)_先前已在不同的癌癥中被報道過敷钾。 基于此，我們檢查了腫瘤樣本及其鄰近正常組織樣本中 TIMo 中的 MDSC 評分與 Treg 中的 Treg 活性評分之間的相關(guān)性肄梨。 在腫瘤分?jǐn)?shù)中阻荒，MDSC 評分和 Treg 活性評分顯著相關(guān)，LG 和 HG Gleason 患者之間沒有明顯的區(qū)別众羡。 在 adj 正常組織中沒有發(fā)現(xiàn)相關(guān)性侨赡。

總之，對前列腺腫瘤中 T 細(xì)胞亞群的功能狀態(tài)進(jìn)行了表征粱侣，以證明 CTL 耗盡以及 Treg 抑制活性增加羊壹，這與 MDSC 樣單核細(xì)胞的抑制活性密切相關(guān)。

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The prostate cancer TME is enriched in exhausted CD56^DIM NK cells

自然殺傷 (NK) 細(xì)胞是一種先天性淋巴細(xì)胞齐婴，具有細(xì)胞毒性功能舶掖，可通過激活和抑制細(xì)胞表面受體進(jìn)行調(diào)節(jié)。 高密度的腫瘤浸潤 NK 細(xì)胞通常與不同實(shí)體瘤（包括乳腺癌尔店、肺癌和前列腺癌）的良好預(yù)后相關(guān)眨攘。 NK 細(xì)胞基于關(guān)鍵標(biāo)記基因表達(dá)進(jìn)行注釋，聚類揭示了 4 個 NK 亞群嚣州。 在 5 個不同的樣品級分中沒有觀察到 NK 細(xì)胞豐度的差異鲫售。 NKT 細(xì)胞的特點(diǎn)是 T 細(xì)胞標(biāo)記基因 CD3D 和 CD8 以及 CD56dim NK 細(xì)胞的高表達(dá)是由終末分化的 NK 細(xì)胞表達(dá)的 HAVCR2 的高表達(dá)。 CD56bright NK 細(xì)胞表達(dá) XCL1该肴、XCL2情竹、GZMK、CD44 和 KLRC1匀哄，而 CD56bright-IL7R+ 細(xì)胞基于 IL7R 和歸巢受體 SELL（編碼 CD62L）的特異性表達(dá)而分離.

NKT和CD56^DIM細(xì)胞也表現(xiàn)出效應(yīng)蛋白和細(xì)胞毒相關(guān)基因FGFBP2秦效、GNLY、GZMB涎嚼、GZMH的高表達(dá)阱州。 然而，與健康組織相比法梯，這些相同的 NK 亞群在腫瘤樣本中表現(xiàn)出更高的衰竭基因特征苔货，表明前列腺 TME 內(nèi)的效應(yīng)器功能受損犀概。 在 NK 亞群中，與健康前列腺相比夜惭，CD56^DIM 細(xì)胞的衰竭基因特征得分最高姻灶，并且在前列腺腫瘤中的豐度更高.

The prostate cancer TME is characterized by activated B cells

與骨髓和 T 細(xì)胞對應(yīng)物相比，B 細(xì)胞在癌癥中的研究較少诈茧。 B 細(xì)胞浸潤已在幾種癌癥類型中進(jìn)行了描述产喉，盡管它們的功能和與生存的相關(guān)性仍然存在爭議。 基于關(guān)鍵標(biāo)記基因的 B 細(xì)胞聚類揭示了 3 個亞群：幼稚 B敢会、活性 B 和漿細(xì)胞曾沈。 五個樣品部分的 B 細(xì)胞豐度相似。 在活性 B 細(xì)胞和漿細(xì)胞中評估 B 細(xì)胞活性走触。 與健康前列腺相比，來自腫瘤和輔助正常組織的細(xì)胞中的 B 細(xì)胞活性顯著更高疤苹，這可能是由于 B 細(xì)胞識別腫瘤抗原所致互广。 然而，這種增加的活性伴隨著腫瘤樣本中較低的 B 細(xì)胞豐度卧土。

In our spatial characterization of immune cells, B cells and macrophages were most abundant, with few monocytes, T cells and plasma cells. This low abundance did not permit a formal analysis of potential ligand/receptor interactions.

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Discussion

使用 bulk 轉(zhuǎn)錄組和基因組測序方法對局部前列腺癌進(jìn)行了廣泛研究惫皱，為致癌驅(qū)動因素和復(fù)發(fā)性分子變化提供了見解。 在這里尤莺，使用高分辨率單細(xì)胞方法來表征腫瘤微環(huán)境中腫瘤旅敷、免疫和非免疫基質(zhì)細(xì)胞的變化。 這些發(fā)現(xiàn)得到了空間轉(zhuǎn)錄組分析的補(bǔ)充颤霎，其中組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞間關(guān)系得以保留媳谁，從而可以確定轉(zhuǎn)錄組變化是否與環(huán)境有關(guān)。

研究的優(yōu)勢包括（a）患者樣本的新鮮性質(zhì)友酱，（b）在一系列 Gleason 評分中匹配的腫瘤和鄰近正常樣本晴音，以幫助克服固有的患者與患者之間的差異，（c）嚴(yán)格收集真正正常的對照前列腺樣本（健康）缔杉，和（d）組合的單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組分析锤躁。事實(shí)上，使用 Slide-seqV2 來表征前列腺腫瘤組織的高度詳細(xì)的空間轉(zhuǎn)錄組分析或详，以及一種新的計(jì)算方法來檢測不同細(xì)胞類型中空間背景相關(guān)的轉(zhuǎn)錄差異系羞，這些差異通常被來自的混合物所掩蓋相鄰的細(xì)胞。這種變化可能會提供關(guān)于微環(huán)境對細(xì)胞的影響以及可能誘導(dǎo)這種變化的機(jī)制的見解霸琴。

正如預(yù)期的那樣椒振，除了內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和周細(xì)胞的非免疫基質(zhì)群外梧乘，前列腺 TME 與幾個髓細(xì)胞亞群杠人、T 細(xì)胞、NK 細(xì)胞和 B 細(xì)胞是復(fù)雜的。This led to some key observations.

關(guān)于上皮細(xì)胞嗡善，確定了在正常前列腺組織中描述的不同的hillock and club cells 亞群辑莫。 已在人類前列腺腫瘤中鑒定出club細(xì)胞； 我們的 RNA 速度分析表明了先前報道的club細(xì)胞的祖細(xì)胞作用罩引。 還看到了從小丘到基底細(xì)胞的定向流動各吨，表明小丘細(xì)胞的第二個祖細(xì)胞作用。 在我們的數(shù)據(jù)集中識別小丘上皮子集可能是由于我們遵循的解離方案袁铐，因?yàn)閾?jù)報道揭蜒，腫瘤解離的方法和條件會影響原發(fā)性實(shí)體瘤組織中的細(xì)胞產(chǎn)量和轉(zhuǎn)錄狀態(tài)。 然而剔桨，在我們的 Slide-seq 數(shù)據(jù)中也檢測到了小丘上皮細(xì)胞屉更，其中沒有發(fā)生解離。

惡性細(xì)胞和正常細(xì)胞很難區(qū)分洒缀。 這里使用了一種迭代策略瑰谜，首先依靠檢測基因組畸變來區(qū)分正常和惡性腔型細(xì)胞，然后推導(dǎo)出一個簡潔的前列腺腫瘤基因特征树绩，它可以在四個獨(dú)立的數(shù)據(jù)集中可靠地識別腫瘤細(xì)胞

關(guān)于骨髓細(xì)胞萨脑，我們發(fā)現(xiàn)一群腫瘤炎性單核細(xì)胞具有免疫抑制性，具有高 MDSC 基因特征饺饭。 此外渤早，M2 樣巨噬細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中大量增加，這一發(fā)現(xiàn)在單細(xì)胞分析和免疫組織化學(xué)中是一致的瘫俊。 據(jù)報道鹊杖，M2-巨噬細(xì)胞與前列腺癌的生長和進(jìn)展有關(guān)，它們作為實(shí)體瘤的治療候選者已獲得顯著的重要性扛芽。

關(guān)于淋巴細(xì)胞仅淑，觀察到細(xì)胞毒性 T 淋巴細(xì)胞顯示出高耗竭特征以及低細(xì)胞毒性特征。 Treg 細(xì)胞也表現(xiàn)出高耗竭特征胸哥。 有趣的是涯竟，在比較low-grade and high-grade cases，沒有看到顯著的 T 細(xì)胞差異空厌，這表明即使是low-grade腫瘤也已經(jīng)建立了高度免疫抑制的微環(huán)境庐船。 即使在 NK 細(xì)胞內(nèi)，CD56^DIM NK 細(xì)胞也在腫瘤部分中擴(kuò)增嘲更，再次表明功能上細(xì)胞毒性較低的 NK 細(xì)胞筐钟。

假設(shè)免疫抑制性骨髓細(xì)胞促成了耗盡的 T 細(xì)胞表型，正如我們小組之前在轉(zhuǎn)移性前列腺癌的環(huán)境中所顯示的那樣赋朦。 事實(shí)上篓冲，MDSC 和 Treg 活性特征之間存在相關(guān)性李破，表明骨髓細(xì)胞在建立 T 細(xì)胞抑制和促腫瘤微環(huán)境中的作用。

利用空間鄰域以高分辨率推斷細(xì)胞間相互作用壹将，這使得能夠識別未解離組織切片中的配體-受體相互作用嗤攻，尤其是腫瘤細(xì)胞與其基質(zhì)之間的相互作用。 除了我們強(qiáng)調(diào)的腫瘤-成纖維細(xì)胞和腫瘤-內(nèi)皮細(xì)胞通訊之外诽俯，我們希望這種分析將證明對社區(qū)更廣泛有用妇菱，并指向臨床相關(guān)和治療靶向的相互作用。 該分析還支持將涉及組織解離的技術(shù)與保留正常組織結(jié)構(gòu)以關(guān)注這些細(xì)胞-細(xì)胞關(guān)系的技術(shù)相輔相成暴区。

總體而言闯团，該原發(fā)性前列腺腫瘤樣本及其正常對照的單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組分析組合數(shù)據(jù)集提供了豐富的數(shù)據(jù)資源。 對腫瘤與其鄰近免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的關(guān)系進(jìn)行生物學(xué)驗(yàn)證仙粱，將有助于更好地了解前列腺癌的進(jìn)展房交，并為這種常見疾病確定新的治療靶點(diǎn)。 我們也希望這份手稿能強(qiáng)調(diào)多學(xué)科團(tuán)隊(duì)的重要性伐割，因?yàn)橹挥性谕饪坪蛭丁⒉±韺W(xué)和基礎(chǔ)科學(xué)拼貼真正合作時才能獲得縱向收集的新鮮患者樣本。

Method（關(guān)注一下重點(diǎn)方法）

Identification of tumor cells from luminal epithelial cells

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Spatial autocorrelation analysis

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Identification of significant ligand-receptor pairs

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生活很好口猜，有你更好