SgRNA設計
目的基因SgRNA如何設計以及載體構建
簡單目的SgRNA設計
目前SgRNA設計網站較多取逾，張鋒實驗室總結了一下SgRNA設計工具https://zlab.bio/guide-design-resources镀迂，以BROAD實驗室的GPP Web Portal 設計工具為例
首先進入其網址
操作非常簡單弧呐，頁面上方是三種不同的目的SgRNA設計：CRISPRKO,CRISPRa,CRISPRi
首先選擇是敲除货抄，激活還是抑制的SgRNA設計
在
CRISPR Enzyme處選擇CAS蛋白類型漆改，一般默認SpCas9然后選擇靶向的物種
在
Specify Target下面的方框中輸入你SgRNA靶向的基因ID或者序列人機驗證
Submit提交即可
注：可查看官方幫助文檔進一步了解該工具的使用
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然后進入結果界面
下載結果即可查看設計完成的SgRNA以及靶向評分
結果展示為txt文件，可以在excel中導入數據方便查看：
sgRNA的序列與On-target和Off-target的匹配數都應盡可能的高满着，一般大于60谦炒，認為是可用的贯莺。一般選擇前面幾個的排序最優(yōu)的SgRNA，可以考慮多合成幾個進行實驗驗證编饺。
注意
具體設計SgRNA來說需要根據實驗要求，針對性的敲除單一轉錄本或者盡可能的影響所有轉錄本的轉錄响驴，這需要自己去找到靶基因及其所有轉錄本綜合分析透且。
載體構建-敲除
lentiviral CRISPR/Cas9 and single guide RNA
參：https://www.addgene.org/52961/
載體簡介
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lentiCRISPRv2 (one vector system):
這個質粒包含兩個重要的元件：hspCas9和嵌合的前導RNA。前導RNA即SgRNA是與靶向序列位點(20bp)互補配對的豁鲤，而且靶向位點序列的3'端必須緊鄰PAM基序（NGG）秽誊。載體經過BsmBⅠ限制性核酸內切酶消化后，設計好的SgRNA經退火后形成的一對寡核苷酸片段就可以連接到載體的SgRNA scaffold上琳骡。
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lentiGuide-Puro (two vector system):
這個質粒只有SgRNA锅论，沒有Cas9元件，必須配合 lentiCas9-Blast (a separate lentiviral construct that delivers hSpCas9 and blasticidin resistance) 使用楣号。該質粒使用方法就是預先在你的靶細胞系中轉染lentiCas9-Blast最易，通過單克隆培養(yǎng)，使你的細胞系表達Cas9蛋白炫狱，然后再轉染lentiGuide-Puro藻懒，整合進SgRNA。該載體連接寡核苷酸片段的酶切位點也是BsmBⅠ视译。
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選擇載體——Which vector to use
lentiCRISPRv2由第一代lentiCRISPRv1升級而來嬉荆，其產毒效率（病毒滴度）是第一代的約10倍。lentilGuide-Puro 的產毒效率則更高酷含，大約是lentiCRISPRv1的100倍鄙早，但是轉染lentilGuide-Puro 的細胞系需要預先整合Cas9基因（使用 the separate lentiCas9-Blast 慢病毒轉染）。對于不能提前整合表達Cas9的（比如原代細胞系）椅亚，則建議使用lentiCRISPRv2限番。轉染后，lentiCRISPRv2 或者 lentiGuide-Puro穩(wěn)轉株篩選條件為嘌呤霉素呀舔。
產毒——Lentiviral production
在開始任何慢病毒工作之前扳缕，請確保操作環(huán)境符合政府/機構/大學的衛(wèi)生和安全規(guī)范。
慢病毒包裝體系
transfer plasmid (e.g.lentiCRISPRv2 or lentiGuide-Puro)
packaging plasmids pVSVg (AddGene 8454) and psPAX2 (AddGene 12260)
包毒：
將transfer plasmid和packaging plasmids共轉進 HEK293(F)T 細胞
陽性對照：
CMV-EGFP lentiviral transfer plasmid (eg. AddGene 19319).
SgRNA合成
為了將目標序列克隆到lentiCRISPRv2或lentiGuide-Puro主鏈中别威，合成以下形式的兩個oligos
連接載體和寡核苷酸片段采用酶切連接的方式躯舔。lentiCRISPRv2, lentiGuide-Puro or lentiCRISPRv1這三種質粒都可以用BsmBⅠ限制性核酸內切酶酶切，形成的末端都是相同的粘性末端省古，即合成oligos的時候5‘和3’末端添加的同源序列是一樣的粥庄。
注意：
如果構建U6啟動子或T7啟動子驅動sgRNA的表達載體，需要考慮sgRNA的5'堿基為G或GG豺妓，來提高其轉錄效率惜互。
舉例說明：
以lentiCRISPRv2載體為例布讹，說明sgRNA是如果構建到該載體中。首先训堆，將設計好的sgRNA中的U堿基改成T堿基描验，如TP53基因的sgRNA序列為5’-CAUUGCUUGGGACGGCAAGG-3’，修改后的堿基為5’-CATTGCTTGGGACGGCAAGG-3’坑鱼，該序列的反向互補序列為3’-GTAACGAACCCTGCCGTTCC-5’膘流。正向序列和反向互補序列退火成雙鏈后就可以連接到載體中，但是需要在序列兩端添加BsmBI酶切后的同源序列鲁沥，如下圖所示：
合成這兩條互補的序列后呼股，退火成雙鏈就可以連接到用BsmBI酶切后的LentiCRISPRv2載體中。
載體構建
- LentiCRISPR載體酶切和去磷酸化画恰，用BsmBI在37℃酶切30min
| 5 ug | lentiCRISPRv2 or lentiGuide-Puro |
|---|---|
| 3 ul | FastDigest BsmBI (Fermentas) |
| 3 ul | FastAP (Fermentas) |
| 6 ul | 10X FastDigest Buffer |
| 0.6 ul | 100 mM DTT (freshly prepared) |
| X ul | ddH2O |
| 60 ul | total |
- 瓊脂糖凝膠純化酶切的LentiCRISPRv2載體
LentiCRISPR載體的大小為14,873bp彭谁，酶切后產生兩個片段，一條大的為目的片段允扇，小片段大小為1885bp缠局。在LentiCRISPRv2載體中有兩個BsmBI酶切位點，兩個位點之間的片段為1885bp考润，酶切連接后sgRNA正好在U6啟動子下游甩鳄，連接后的sgRNA下游就是gRNA scaffold序列，與sgRNA一起轉錄出來發(fā)揮gRNA的引導功能额划。
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Oligo磷酸化和退火成雙鏈DNA
1 ul Oligo 1 (100 μM) 1 ul Oligo 2 (100 μM) 1 ul 10X T4 Ligation Buffer (NEB) 6.5 ul ddH2O 0.5 ul T4 PNK (NEB M0201S) 10 ul total buffer使用的是T4連接buffer妙啃，里面含有ATP；如果使用T4 PNK對應的buffer俊戳，則需要添加1mM的ATP
反應體系：
37℃ 30 min 95℃ 5 min and then ramp down to 25℃ at 5℃/min
將步驟3中退火過的寡核苷酸以1:200稀釋到無菌水或EB中揖赴。
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連接反應：室溫孵育10 min
X ul BsmBI digested plasmid from Step 2 (50ng) 1 ul diluted oligo duplex from Step 4 5 ul 2X Quick Ligase Buffer (NEB) X ul ddH2O 10 ul subtotal 1 ul Quick Ligase (NEB M2200S) 11 ul total 陰性對照：使用ddH2O代替Oligos
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轉化
使用Stbl3感受態(tài)
慢病毒轉染質粒包含Long-TerminalRepeats (LTRs) ，感受態(tài)細胞選擇重組缺陷型的細菌以提高轉化效率 抑胎。
