單細(xì)胞測序技術(shù)日漸火爆，其相關(guān)文章也層出不窮惯裕。隨著越來越多相關(guān)研究的出現(xiàn)温数，也有更多的科研工作者對其產(chǎn)生了興趣。

單細(xì)胞測序技術(shù)應(yīng)用之初蜻势，其研究主要集中在探索組織器官內(nèi)部結(jié)構(gòu)撑刺，從而獲得其精細(xì)的細(xì)胞圖譜，例如浙江大學(xué)郭國驥團隊分別在?CELL 和 NATURE 雜志發(fā)表了首個小鼠細(xì)胞圖譜和涵蓋八大系統(tǒng)的人類細(xì)胞圖譜[2]咙边。隨著組織圖譜的不斷完善猜煮，大家關(guān)注的重點轉(zhuǎn)向了利用單細(xì)胞測序技術(shù)去解決真正的科學(xué)及臨床問題，例如疾病败许、腫瘤的致病機制和藥物的作用機理等等王带。

那么如何利用單細(xì)胞技術(shù)去解決這些科學(xué)/臨床問題呢？分析當(dāng)前已經(jīng)發(fā)表的單細(xì)胞文章及諾禾豐富的項目經(jīng)驗市殷，不難發(fā)現(xiàn)其研究思路大同小異愕撰。基于此我們總結(jié)了一套單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組通用的分析方案分享給關(guān)注小諾的各位醋寝。

接下來我們就從拿到一個課題中所有樣本單細(xì)胞測序的數(shù)據(jù)開始搞挣，給大家展示常規(guī)課題分析思路。

整合分析

利用單細(xì)胞測序技術(shù)解決科學(xué)/臨床問題的課題中音羞，一般會有2組或2組以上（例如：正常對照組 vs 疾病組）的樣本囱桨。首先需要將一個課題中所有的樣本整合到一起進(jìn)行分析，然后降維聚類獲得整個課題樣本的分群圖（拿到每個樣本的分群圖就會發(fā)現(xiàn)每個樣本分群圖的形狀都不一樣嗅绰，整合分析就避免了這一問題）舍肠，方便后續(xù)的分析搀继。

諾禾單細(xì)胞研究部開發(fā)了不同的樣本整合方法，例如?PCA翠语、CCA叽躯、Harmony 等可以分別對樣本間的批次效應(yīng)進(jìn)行不同程度的較正，以滿足不同課題的需要肌括。下面這兩張圖是諾禾利用10x官方 demo 數(shù)據(jù)將兩個 PBMC 樣本整合后的細(xì)胞分群圖点骑。

細(xì)胞定義

獲得細(xì)胞分群圖之后，需要根據(jù)每個群的基因表達(dá)特征定義出每個用數(shù)字標(biāo)記的小群具體是哪種類型的細(xì)胞谍夭，最終獲得樣本的組織細(xì)胞圖譜黑滴。

尋找組間差異

接下來就是找到整個課題中不同組別之間的差異，找到關(guān)鍵的細(xì)胞亞群或者基因慧库，來解釋科學(xué)/臨床問題跷跪。本次先介紹如下三個方面：

1. 細(xì)胞占比分析

通過對多樣本細(xì)胞占比分析，可以直觀的看出每個細(xì)胞群在不同樣本中的占比情況齐板，發(fā)現(xiàn)在不同組別中占比發(fā)生明顯變化的細(xì)胞亞群或者新的細(xì)胞群,并將該群體作為進(jìn)一步研究的重點吵瞻。

細(xì)胞占比示例

2. 差異基因分析

通過差異分析，分析不同樣本細(xì)胞群之間的基因表達(dá)差異甘磨，進(jìn)一步分析探究得到這些基因表達(dá)出現(xiàn)差異是由哪些生物學(xué)過程介導(dǎo)的橡羞。

此外可以分析某些功能相關(guān)基因集的表達(dá)，看這些關(guān)注的基因集在哪個細(xì)胞群中高表達(dá)济舆。

3．結(jié)合 V(D)J 分析克隆型變化

在免疫微環(huán)境研究中卿泽，結(jié)合?TCR/BCR 克隆型的變化，找到關(guān)注的細(xì)胞亞群滋觉。

細(xì)胞間進(jìn)化關(guān)系分析

在進(jìn)行組織發(fā)育進(jìn)化研究時签夭，可以通過擬時分析或者RNA速率分析去分析組織內(nèi)各群之間的進(jìn)化關(guān)系

1. 擬時分析

擬時分析可以推斷發(fā)育過程中細(xì)胞分化軌跡或免疫微環(huán)境中細(xì)胞亞型的演化過程，將其過程以樹狀圖的形式展示出來椎侠。

細(xì)胞占比示例

2. RNA 速率分析

RNA 速率是基因表達(dá)狀態(tài)的時間變率第租，可以通過區(qū)分普通單細(xì)胞 RNA 測序中未剪接和剪接的 mRNA 來直接進(jìn)行分析諸如胚胎發(fā)育或組織再生等隨時間變化的現(xiàn)象。

RNA 速率分析示例圖

細(xì)胞間相互作用分析

組織器官內(nèi)的各細(xì)胞亞群并不是單獨存在的我纪，各亞群細(xì)胞相互作用共同維持組織結(jié)構(gòu)發(fā)揮功能慎宾。通過分析細(xì)胞膜表面受體和配體相互作用，來推斷細(xì)胞之間的相互作用浅悉。例如找到不同細(xì)胞間相互作用的中心趟据，為深入研究疾病的發(fā)生機制或藥物的作用機制指明方向。

受配體分析示例圖

單細(xì)胞測序結(jié)果的驗證

通過單細(xì)胞分析得到的結(jié)果术健，還需要通過進(jìn)一步的驗證汹碱，可以通過流式分選驗證單細(xì)胞結(jié)果，流式分選結(jié)合?Bulk 測序分子實驗驗證基因表達(dá)荞估，分子實驗驗證細(xì)胞間作用咳促。

以上內(nèi)容為本次小諾給大家介紹的關(guān)于單細(xì)胞分析方案的主要內(nèi)容色难，通過整理總結(jié)得到如下分析流程圖可供各位老師參考。

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