hello，大家好，今天我們繼續(xù)分享單細胞空間的分析內容间唉，不過我們今天重點放在免疫部分，參考文獻在Resident memory CD8⁺ T cells in regional lymph nodes mediate immunity to metastatic melanoma利术，2021年9月發(fā)表于Immunity,IF37分呈野，專門針對免疫研究的文章，我們今天來好好看看印叁，看看作者是如何將單細胞轉錄組被冒、VDJ、空間三項技術整合在一起攻克生物學難題的轮蜕。

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研究人員利用黑色素瘤相關的白癜風小鼠模型研究了常駐記憶（T_rm）和循環(huán)記憶（T_cirm）細胞在轉移位置的抗腫瘤反應中的作用昨悼。研究人員發(fā)現，腫瘤特異性CD8⁺ T細胞的轉錄特征是由占據的組織決定的跃洛。異種共生表明率触，腫瘤特異性的Trem和Tcirm區(qū)段在整個內臟器官中持續(xù)存在，但Trem細胞在淋巴結（LN）中占主導地位汇竭。淋巴結和皮膚中Trem細胞的單細胞RNA測序圖譜是不同的葱蝗，占據這兩種組織的T細胞克隆型在淋巴結中絕大部分保持為Trem細胞。

雖然Tcirm細胞阻止了黑色素瘤在肺部的生長细燎，但Trem對黑色素瘤在LN的播種提供了長期的保護两曼。擴大的Trem population也存在于黑色素瘤患者的LN中，其轉錄特征預示著更好的生存玻驻。因此合愈，腫瘤特異性Tram細胞在LN中持續(xù)存在，從而限制了轉移性癌癥。

In brief

Lymph nodes (LNs) are frequent sites of metastasis. Molodtsov, Khatwani et al. find that melanoma-specific CD8⁺ T cells persist as functional resident memory (T_rm) populations within skin-draining LNs, and these T_rm cells prevent melanoma growth upon tumor seeding in LNs. A LN T_rm transcriptional signature predicts survival in melanoma patients, highlighting the relevance of LN T_rm function in human disease.

Highlights

• Tissue localization defines the transcriptional profile of tumor-specific CD8⁺ T cells
• Melanoma-specific T_rm populations develop in skin-draining lymph nodes
• T_rm cells protect against melanoma tumor seeding in lymph nodes
• A lymph node T_rm transcriptional signature uniquely predicts survival in melanoma patients

SUMMARY

隨著原發(fā)性腫瘤的進展和轉移佛析，抗腫瘤免疫反應的性質會發(fā)生變化益老。研究使用黑色素瘤相關白斑的小鼠模型研究了resident memory (T_rm) 和circulating memory (Tcirm) 細胞在轉移部位的抗腫瘤反應中的作用。發(fā)現腫瘤特異性 CD8⁺ T 細胞的轉錄特征由占據的組織defined寸莫。Parabiosis顯示腫瘤特異性 T_rm 和 Tcirm compartments在整個內臟器官中持續(xù)存在捺萌，但 T_rm 細胞主導淋巴結 (LN)。 LN 和皮膚中 T_rm 細胞的單細胞 RNA 測序譜是不同的膘茎，占據兩種組織的 T 細胞克隆型在 LN 中絕大多數保持為 T_rm桃纯。 Tcirm 細胞阻止黑色素瘤在肺部的生長，而 T_rm 提供了針對 LN 中黑色素瘤seeding的長期保護披坏。來自患者的黑色素瘤相關淋巴結中也存在擴大的 T_rm population态坦，它們的轉錄特征預測了更好的存活率。因此棒拂，腫瘤特異性 T_rm 細胞在 LN 中持續(xù)存在伞梯，限制了轉移性癌癥。（T細胞的分類實在太多了一些）

INTRODUCTION

轉移是癌癥死亡的主要原因帚屉，盡管對轉移部位的免疫反應尚不清楚谜诫。 CD8⁺ T 細胞充當小鼠早期癌癥的守護者，抑制癌細胞的擴散攻旦，T 細胞激活免疫檢查點抑制劑藥物對廣泛轉移性疾病的患者有效喻旷。 記憶 T 細胞對于對癌癥的持久免疫特別重要，并且與患者的較低轉移率有關牢屋。
盡管作為 T 細胞啟動的必要器官且预，淋巴結 (LN) 卻是最常見的早期轉移部位。 Tumor-draining的 LN 變得高度免疫抑制烙无，并且 LN 脈管系統(tǒng)獨特地能夠將腫瘤細胞傳播到遠處器官辣之。將 LN 指定為轉移的途徑強調了了解 LN 局部對癌癥的免疫的必要性。 這種免疫的存在是通過以下發(fā)現來推斷的：一些轉移瘤從未擴散到 LN 的包膜下區(qū)域之外皱炉，并且全區(qū)域淋巴結 (RLN) 切除對轉移性黑色素瘤患者缺乏治療益處怀估。
在 LN 中啟動 CD8⁺ T 細胞后，克隆擴增的population分化為循環(huán)和常駐記憶亞群合搅。循環(huán)記憶 (Tcirm) 細胞——包括中樞 (Tcm)多搀、效應細胞 (Tem) 和干細胞記憶 (Tscm) 亞群——通過血液和淋巴器官再循環(huán)，而常駐記憶 (T_rm) 細胞群在組織中穩(wěn)定駐留灾部。與 Tcirm 細胞相反康铭，T_rm 細胞表達組織保留標志物，缺乏egress markers的表達赌髓，并且在功能上被定義為它們無法在穩(wěn)定狀態(tài)下再循環(huán)从藤。 T_rm 細胞存在于整個組織中催跪，包括皮膚、肺夷野、肝懊蒸、腦、腸和生殖道悯搔，在這些組織中它們提供了抵御外周再感染和癌癥的屏障骑丸。此外，CD8⁺ T_rm 細胞也可以占據 RLN妒貌。在人類免疫缺陷病毒 (HIV) 感染的患者中通危，HIV 特異性 CD8⁺ T_rm 細胞在elite controllers的 LN 中富集，表明 LN T_rm 細胞在對抗感染中的作用灌曙。
Tcirm 和 T_rm 細胞介導的癌癥免疫研究主要集中在原發(fā)性腫瘤上菊碟，而對轉移部位的memory requirements知之甚少。 之前的工作揭示了皮膚 T_rm 細胞在小鼠皮膚黑色素瘤的長期保護中的關鍵作用在刺。 其他研究人員已經表明需要 T_rm 細胞對抗粘膜部位的腫瘤逆害，盡管 T_rm 和 Tcm 細胞之間的相互作用在其他情況下可能至關重要。 腫瘤內 CD103⁺ T_rm 樣細胞與改善預后和增強免疫治療反應相關增炭。 然而，Tcirm 細胞也與改善的結果有關拧晕。 Tcirm 和皮膚 T_rm population共同構成了患有白斑病的黑色素瘤幸存者的持久免疫治療反應的基礎隙姿。
在這里，分析使用已建立的黑色素瘤長壽命免疫模型和相關自身免疫檢查了 T_rm 細胞對轉移部位黑色素瘤免疫的貢獻厂捞。 T_rm 和 Tcirm compartments均在整個淋巴和內臟轉移部位產生输玷，但與受 Tcirm 細胞有效保護的肺不同，RLN 中的腫瘤保護主要由轉錄上不同的 LN T_rm 細胞群提供靡馁。 這些研究表明欲鹏，腫瘤位置定義了保護性記憶反應的最佳特征，并表明 T_rm 細胞是 LN 內癌癥免疫的關鍵介質臭墨。

RESULTS

Tissue location dictates the transcriptional characteristics of tumor-specific memory T cells

為了研究 CD8⁺ T 細胞對轉移部位腫瘤的反應赔嚎，利用已建立的手術后黑色素瘤相關白斑 (MAV) 小鼠模型。 為了響應 B16 真皮腫瘤生長和用抗 CD4 治療以消耗 Treg 細胞胧弛，小鼠打破了對黑素細胞分化抗原 gp100 和 TRP-2 的耐受性尤误。 在手術切除原發(fā)腫瘤后，這些小鼠會發(fā)展為自身免疫性白癜風结缚，這是維持 LN 和皮膚中針對 gp100 和 TRP-2 的記憶 CD8⁺ T 細胞反應所必需的损晤。 在患有 MAV 的小鼠中，黑色素瘤保護在dermis中持續(xù)存在红竭，并防止肺部靜脈注射 (i.v.) 再激發(fā)尤勋。 皮膚腫瘤保護由皮膚中的 T_rm 細胞提供喘落。 為了識別其他組織中的腫瘤抗原特異性 CD8⁺ T 細胞，在 MAV 誘導之前引入了 10⁴ 個初始 pmel 細胞的示蹤population最冰。 這些sentinel pmel 細胞反映了 MAV 小鼠的內源性 CD8⁺ T 細胞反應瘦棋。
在腫瘤切除當天評估啟動，抗原經歷 (CD44^hi) pmel 細胞已經分布在整個組織中锌奴。 正如預期的那樣兽狭，在皮膚中檢測到最高的 pmel 比例。 然而鹿蜀，pmel 細胞也在肺箕慧、肝和淋巴結中大量積累。 四十五天后茴恰，整個組織中的記憶群仍然很明顯颠焦。 在灌注的肺和肝臟中，體內 mAb 染色揭示了實質和血管相關 pmel 記憶群的存在往枣。 相對于啟動伐庭，脾、肺和肝臟的記憶反應收縮分冈，盡管它們在 LN 中保持不變圾另，并在自身免疫性皮膚中膨脹。 因此雕沉，在存在皮膚局部自身免疫的情況下集乔，在宿主淋巴組織和內臟器官中形成了強大的腫瘤特異性 T 細胞記憶。
然后坡椒，使用 CD103⁺CD69⁺CD62L^lo 皮膚 T_rm 細胞作為參考population評估了記憶時組織定位的 pmel 細胞的表型扰路。 雖然 CD103 和 CD69 在皮膚的 pmel 細胞上表達最強，但它們在 LN 中也高度表達倔叼。 脾臟汗唱、肺和肝臟中的 Pmel 細胞也表達 CD103 和 CD69，但水平低于皮膚或淋巴結丈攒。 CD62L 在所有組織中的 pmel 細胞中基本上不存在哩罪，證實該模型中不存在穩(wěn)健的 Tcm compartment。 CD103⁺CD69⁺CD62L^lo T_rm 表型是 MAV 環(huán)境中 pmel 細胞所獨有的巡验，因為它與過繼轉移之前的幼稚 pmel 細胞不同识椰，并且與在表達 gp100 的單純皰疹病毒感染背景下產生的 pmel 記憶群不同 . 因此，腫瘤特異性記憶 T 細胞在所有組織位置表達 T_rm 標志物深碱，盡管水平不同腹鹉。
為了識別不同位置的腫瘤特異性 T 細胞之間的差異，從不同組織中分選 pmel 細胞并通過bulk RNA-seq 進行分析敷硅。對組織間表達差異最大的轉錄物的分析揭示了組織特異性轉錄特征功咒。皮膚中的 Pmel 細胞表達最高水平的 Atf3愉阎、Zfp36 和 Fabp4/5，后者對于皮膚中的 T_rm 代謝至關重要力奋。另一方面榜旦，來自肺的 pmel 細胞表達 Gzma、Itgax (CD11c) 和 Fabp3景殷。這與肝臟形成對比溅呢，肝臟中細胞表達 Fabp1 和 Fabp7，前者促進肝臟中的 T_rm 細胞維持猿挚。來自 LN 的 pmel 細胞表達與 IL-7 信號（例如咐旧，Il7r、Stat5a 和 Bcl2）和 1 型 IFN 信號（例如绩蜻，Stat1 和 Irf3）相關的轉錄本铣墨。在啟動/效應時間點取自 LN 的效應 (Teff) pmel 細胞中未觀察到這種特征，表明它是記憶所獨有的办绝。因此伊约，克隆相同的記憶 T 細胞群采用基于其占據組織的獨特基因表達譜。
為了更好地了解組織內記憶 T 細胞亞群的分化孕蝉，關注與 T_rm屡律、激活/效應子和 Tcirm 亞群相關的轉錄本。對于 標記降淮，初始 pmel 細胞或腫瘤浸潤淋巴細胞 (TIL) 為低轉錄本或缺失轉錄本提供了T_rm參考超埋。正如預期的那樣，來自皮膚的 pmel 細胞表現出 T_rm 轉錄本的顯著表達骤肛，因此缺乏大多數 Tcirm 轉錄本纳本，而這些轉錄本由對照naive (CD44lo) pmel 細胞高度表達窍蓝。皮膚 pmel 細胞也表達了高水平的激活/耗竭轉錄本腋颠，這些轉錄本在 TIL 中高度表達。這與來自脾臟的 pmel 細胞不同吓笙，后者表達較低水平的大多數 T_rm 和激活/耗竭轉錄本淑玫，同時表達高水平的幾種 Tcirm 轉錄本。另一方面面睛，肺絮蒿、肝和淋巴結中的 pmel 細胞通過已知特征不太清楚。盡管這些population中的每一個都表達了高水平的多個 T_rm 標記叁鉴，但它們同時表達了中等水平的激活/耗竭標記和中等或高水平的幾個 Tcirm 轉錄本土涝。因此，即使在單個組織位置幌墓，腫瘤特異性記憶 T 細胞的異質population也存在于克隆一致的population中但壮。

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Tumor-specific CD8⁺ T cells differentiate into T_rm populations within LNs and lungs

為了最終確定單個組織中 T_rm 和 Tcirm subset的存在冀泻，進行了共生研究。 含有記憶 pmel 示蹤劑population的 MAV 供體小鼠與具有同類標記的 MAV 受體共生結合 14 天蜡饵。 這足以建立血管吻合弹渔，在第 30 天時不會進一步增加∷莼觯考慮到總 CD8⁺ T 細胞肢专，初始 (CD44^lo) 和記憶 (CD44^hi) compartments的平衡在連體小鼠的脾臟、LN 和肺中都很明顯焦辅。 盡管有大量的內源性 T_rm population博杖，但肝臟也達到了平衡。 皮膚 CD8⁺ T 細胞未能平衡氨鹏，這與受白癜風影響的皮膚中存在 T_rm 細胞一致欧募。
正如預期的那樣，專注于 Ag 特定的 pmel population仆抵，在皮膚中沒有觀察到平衡跟继。 然而，脾臟中的 pmel 細胞完全平衡镣丑，表明它們的身份為 Tcirm舔糖，這與它們通過bulk RNA-seq 表達的組織出口分子一致。 相比之下莺匠，肺 pmel 細胞僅部分平衡金吗，表明它們包含 Tcirm 和 T_rm subset。 此外趣竣，再循環(huán)肺population的表型主要是 CD103loCD62Llo摇庙，與這些細胞是 Tem 一致。 受體小鼠肝臟中的 Pmel 種群小于供體遥缕，表明 Tcirm 細胞在肝臟中普遍存在卫袒，但不排除 T_rm 亞群的存在。 總之单匣，這些數據表明腫瘤特異性 T_rm 和 Tcirm 細胞的組合占據了 MAV 小鼠的內臟器官夕凝。
出乎意料的是，共生研究進一步揭示了 LN 中存在大量腫瘤特異性 T_rm population户秤。大多數 pmel 細胞未能在腹股溝淋巴結中平衡码秉，并保留在具有 CD103^hiCD62L^low 表型的供體中。在 LN 中僅檢測到少量再循環(huán)部分鸡号，其特征在于 CD103^loCD62L^hi/lo 表型转砖。 LN T_rm 種群隨著時間的推移是穩(wěn)定的，這表明即使在 30 天的共生之后也達到最小平衡鲸伴。使用naive受體交替進行聯體共生導致類似的結果府蔗，表明受體小鼠的白斑病既不阻止也不促進 pmel T 細胞駐留或再循環(huán)莉兰。所有引流皮膚的 LN 都含有 pmel T_rm 群，而腸系膜 LN 完全缺乏 pmel 細胞礁竞，這表明靠近皮膚可能對 LN 中的 T_rm 建立很重要糖荒。在引流先前腫瘤切除部位的 RLN 中觀察到最大的population。在這里模捂，大多數 pmel 細胞是 T_rm捶朵，但也有少量的再循環(huán)細胞群。這些研究揭示了以前未被重視的腫瘤特異性 T_rm 細胞群的存在狂男，這些 T_rm 細胞在 LN 中持久存在综看。

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Transcriptional single-cell analysis reveals diverse memory T cell populations throughout tissues(轉錄單細胞分析揭示了整個組織中不同的記憶 T 細胞群)

為了更好地表征 T_rm 和 Tcirm population的異質性，使用 10X 平臺通過單細胞 RNA 測序 (scRNA-seq) 分析從不同組織中分選的 pmel T 細胞岖食。 Pmel 細胞根據它們的起源組織清晰地聚集在一起红碑，除了一個包含來自所有組織的細胞的混合小cluster。一般來說泡垃，scRNA-seq 的標記表達與流式細胞術和批量 RNA-seq 一致析珊。正如預期的那樣，來自皮膚的細胞表達 T_rm 標記（例如蔑穴，Itgae忠寻、Cd69、CXCR6 和 NR4A1）并且缺乏 Tcirm 標記（例如存和，Klf2 和 S1pr1）奕剃。根據 Stmn1、Mki67 和 Mcm3 等基因的表達推斷捐腿，混合cluster包含增殖細胞纵朋。來自皮膚和肝臟的細胞各自形成單一的同質cluster。從皮膚中分離出的 pmel 細胞重新聚集幾乎沒有異質性茄袖，所有細胞都具有 T_rm 特征操软，與它們的共生行為一致。然而绞佩，肝臟的重新聚類揭示了兩個通過 Klf2 表達區(qū)分的cluster寺鸥，表明肝臟中同時存在 Tcirm 和 T_rm 亞群猪钮。
即使聚集在更大的數據集中品山，肺和淋巴結中的 Pmel T 細胞也是異質的。 Lung 包含三個clusters烤低，Lung_1 和 Lung_2 均表達 Tcirm 相關轉錄本 S1pr1 和 Klf2肘交，以及高水平的 Gzma 和 Gzmb。 較小的 Lung_3 cluster表達 Bcl2扑馁、Bbc3涯呻、Pim2 和 Ddit3凉驻，類似于最近報道的肺氣道 T_rm特征。 因此复罐，與共生數據一致涝登，肺具有轉錄不同的 T_rm 和 Tcirm populations。 值得注意的是效诅，肺和肝 Tcirm 樣細胞群在轉錄上是不同的胀滚，這表明它們并不代表來自血液的污染物，而是 Tcirm 細胞與組織相互作用到一定程度改變了它們的轉錄譜乱投。
LN 還包含三個cluster咽笼。 LN_1 是最小的，表達 Cd28戚炫、Klf2剑刑、Slamf6、Tcf7 和 Tox双肤，但缺乏 Itgae施掏，與循環(huán) Tscm 樣或祖細胞耗竭細胞一致。 相比之下茅糜，較大的 LN_2 和 LN_3 cluster具有高 Itgae 和 Cxcr6 以及低 Klf2 和 S1pr1其监，使它們與 LN Trm cluster對齊。 與皮膚 Trm 細胞不同限匣，LN Trm 細胞缺乏 Nr4a1抖苦、Fos 和 Tnf，而是表達高 Il7r米死、Lta 和 Cxcr3锌历。 有趣的是，LN_2 與 LN_3 僅通過與 1 型 IFN 信號相關的轉錄本的表達來區(qū)分峦筒，這與大量 RNA-seq 數據一致究西，并表明 LN_2 是暴露于 1 型 IFN 的 Trm 亞群。 因此物喷，在 LN 中的腫瘤特異性記憶 T 細胞克隆群中存在轉錄異質性卤材。
為了識別組織中記憶clusters之間的轉錄相似性，使用 Monocle 進行偽時間排序峦失。 populations形成了三個不同的分支扇丛，肺和肝在很大程度上重疊，與皮膚或 LN 不同尉辑。Based on distance and trajectories, the main LN Trm cluster (LN_3) appeared most similar to skin Trm cells, with the LN Tcirm cluster being more distinct帆精。 然而，基于 RNA 速度分析，皮膚和 LN Trm populations之間不存在明顯的分化關系卓练。 因此隘蝎，雖然 LN 和皮膚population共享多個特征，但 LN Trm 細胞是轉錄上不同的記憶populations襟企。

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這里多說一句嘱么，氣泡圖有負值，說明是對基因表達值標準化后繪制的結果顽悼。

LN Trm cells are functional, prevalent, and present in the endogenous T cell compartment

在先前腫瘤切除的 RLN 引流部位內更仔細地檢查了腫瘤特異性 T 細胞的定位和表型特征拱撵。 RLN 的免疫熒光顯微鏡顯示 pmel T 細胞定位在 T 細胞區(qū)內，類似于naive和 Tcm 細胞表蝙。 然而拴测，在包膜下竇中表達 CD169 的巨噬細胞附近的cluster中也觀察到細胞，這與病毒感染模型中的 LN Trm 定位一致府蛇。 T 細胞區(qū)和包膜下竇內的 Pmel 種群表達 CD103集索，表明 Trm 種群在整個 LN 中的分布。
基于測序和共生數據汇跨，LN Trm 細胞通過 CD103 表達與其 LN Tcirm 對應物區(qū)分開來务荆。 為了定義額外的表型特征，分析了表征來自 scRNA-seq 數據的 LN Trm cluster的標記的表面表達穷遂。 IL-7R (CD127)函匕、CXCR6 和 CXCR3 的顯著更高表面表達將 CD103⁺ Trm 細胞與 LN 中的 CD103- Tcirm 對應物區(qū)分開來。 為了解決這些亞群之間功能性的潛在差異蚪黑，在 MAV 誘導之前盅惜，小鼠被過繼轉移了表達 IRES-eYFP IFNg 報告基因的 pmel 細胞。 引人注目的是忌穿，對未再刺激細胞的快速離體分析表明抒寂，盡管 CD103^-Tcirm 亞群中明顯不存在，但 IFNg 在 LN 中的 CD103⁺ Trm 細胞中的表達一致高掠剑。 這些數據突出了 LN Trm 細胞作為表型和功能不同的腫瘤特異性 T 細胞群屈芜，準備在 LN 內發(fā)揮效應子功能。

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LN Trm cells mediate long-lived immunity to melanoma in RLNs

白癜風與轉移性黑色素瘤患者的持久免疫治療反應和良好預后密切相關草则。因此，患有 MAV 的小鼠在真皮和肺中維持針對黑色素瘤再攻擊的長期保護性免疫蟹漓。為了確定該模型中保護性記憶的完整程度炕横，在原發(fā)腫瘤切除后至少 30 天，通過多種途徑進行 B16 黑色素瘤再激發(fā)葡粒。為了僅評估宿主內源性免疫份殿，這些再攻擊研究中未使用 pmel 細胞。除了表現出強大的 CD8⁺ T 細胞介導的對尾靜脈再攻擊的保護作用嗽交，尾靜脈再攻擊會在肺中產生類似轉移的疾病伯铣，MAV 小鼠還通過門靜脈途徑獲得顯著保護，防止再攻擊轮纫，門靜脈途徑在肝臟中播種黑色素瘤腔寡。此外，還針對在先前腫瘤生長部位直接注入 RLN 中的黑色素瘤細胞提供保護掌唾。與肺部一樣放前，LN 中的腫瘤保護是由 CD8⁺ T 細胞介導的，并且在接種多達 50,000 個 B16 細胞后觀察到糯彬。因此凭语，攜帶 MAV 的小鼠在內臟器官和 RLN 內持續(xù)對黑色素瘤提供廣泛的保護。
考慮到發(fā)現肺和 LN 都含有異質性的 Trm 和 Tcirm 細胞群撩扒，目前尚不清楚這些細胞群中的哪一個在每個位置介導了長壽命的保護性免疫似扔。為了解決這個問題吨些，將帶有 MAV 的小鼠與幼稚的受體共生化，以使 Tcirm 平衡 14 天炒辉。然后在同一天通過手術將小鼠分開并單獨重新攻擊豪墅，通過尾靜脈或直接進入 RLN 中的 B16 細胞。再次嘗試后共生化供體和受體小鼠的肺對靜脈注射表現出類似的抵抗力黔寇，說明 Tcirm 細胞足以針對肺部轉移樣疾病的保護性免疫偶器。這也說明保護性 Tcirm populations可以有效地轉移到沒有白斑的受體。無論如何缝裤，在共生受體小鼠中不存在對 LN 再攻擊的保護屏轰，這表明 RLN 中的腫瘤保護需要 Trm 細胞。因此憋飞，Tcirm 和 Trm 細胞共同為轉移部位的黑色素瘤提供保護霎苗，LN Trm 細胞為 RLN 內的黑色素瘤生長提供了屏障。

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為了明確確定人類中 LN Trm populations的存在，對來自轉移性疾病患者手術收獲的黑色素主要參與的 LN 的 T 細胞進行了 scRNA-seq 和配對 scTCR-seq获茬。 對分選的人類 CD8⁺ T 細胞的分析揭示了四個轉錄cluster港庄，其中一個 (HuLN_1) 表現出 Trm 細胞的顯著特征。 此外恕曲，該樣本中擴增最多的前五個克隆型富集在 Trm cluster中鹏氧，表明這些人 LN Trm 細胞已經進行了克隆擴增。 這些結果共同證實了患者中 LN Trm populations的存在佩谣。

研究 LN Trm 細胞在轉移性黑色素瘤患者中的潛在預后意義把还，基于 pmel LN Trm cluster中相對于其他人群表達差異最大的基因產生了轉錄特征。生成皮膚-Trm 和肺-T_CIRCM 特征用于比較茸俭。然后使用這些特征來推斷來自癌癥基因組圖譜 (TCGA) 的黑色素瘤樣本中記憶性 T 細胞的富集吊履。評估 TCGA 中的所有黑色素瘤樣本懒鉴，所有三個特征都具有顯著的預后價值励堡。然而，當僅分析 RLN 轉移性黑色素瘤標本時漫萄，LN-Trm 特征的富集提供了最強的預后益處腾窝，LN-T_rm^hi 患者的中位總生存期比具有其他特征的隊列長至少 670 天缀踪。這種相關性在兩個獨立的黑色素瘤 RLN 轉移數據集中得到證實居砖，即使從特征中排除 CD8⁺ T 細胞特異性基因（Cd8a、Cd8b1驴娃、Cd3g奏候、Cd3e 和 Trav7-4）也沒有改變。此外托慨，通過 Cox 多變量分析鼻由，LN Trm 特征的富集是轉移性黑色素瘤標本中唯一重要的保護特征暇榴。因此厚棵，Trm populations存在于黑色素瘤浸潤的 LN 中，它們的轉錄特征獨特地預測了患者的更好結果蔼紧。

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DISCUSSION

產生持久的宿主范圍抗癌免疫是該領域的基本目標婆硬。 最近對患者進行免疫治療的成功表明，這種結果是可能的奸例，但癌癥會轉移到不同的組織位置彬犯，并且 T 細胞必須能夠進入、占據并在這些環(huán)境中發(fā)揮作用查吊。 本研究為支持這些功能的 T 細胞多樣性提供了新的見解谐区。 通過產生循環(huán)和組織駐留記憶subsets，克隆相同的 CD8⁺ T 細胞群形成一個巨大的網絡逻卖，賦予整個宿主保護性免疫宋列。 分析闡明了引流 LN 內腫瘤排斥的鮮為人知的現象，我們表明 Trm 細胞是早期轉移的這個關鍵部位腫瘤免疫的主要介質评也。
我們的研究證明了結合表型分析炼杖、轉錄組學和體內功能分析的關鍵價值，以揭示離散記憶 T 細胞亞群的身份盗迟。只有通過聯體共生坤邪、流式細胞術和單細胞 RNA-seq 的組合，我們才能確定和有效地辨別記憶 T 細胞亞群的特性罚缕。盡管之前人們認識到 Trm 細胞根據組織位置采用獨特的特征艇纺，但我們的研究揭示了這些精確的變化，并表明它們可以由腫瘤特異性 T 細胞的克隆群產生邮弹。單細胞轉錄組學揭示了宿主范圍內抗腫瘤反應的異質性喂饥。腫瘤特異性 Trm 細胞在 LN 中形成了一個離散的記憶群，具有獨特的轉錄特性肠鲫。這些特性具有預后意義员帮，例如它們具有預測具有 RLN 轉移的黑色素瘤患者生存的卓越能力。由于先前對 LN Trm 反應的研究僅限于病毒感染的環(huán)境导饲，我們在這里的工作顯示了這種現象在腫瘤免疫和自身免疫中的重要方面捞高。除了它們的 CD69⁺CD62L_lo 表型外氯材，腫瘤特異性 LN Trm 細胞在高 Itga1 和 Xcl1 和低 Sell、S1pr1硝岗、Klf2 和 Nr4a1 的表達方面與病毒特異性 LN Trm 相似氢哮。 LN Trm population也由高 Itgae 和 Cxcr6 表達定義，這在 Beura 等人中未觀察到型檀。阿爾冗尤。但在來自 HIV 患者的 CD69⁺ LN Trm 細胞中很突出。
皮膚中克隆相同的 Trm 細胞與皮膚引流 LN 之間的關系仍有待辨別胀溺。雖然與皮膚 Trm 細胞共享許多特征裂七，但 LN Trm 細胞缺乏 AP-1 家族、Nr4a 家族和 Fabp4/5 轉錄本的表達仓坞。相反背零，它們表達了高水平的 IL-7R（已知它支持記憶性 T 細胞維持）和 1 型 IFN 信號的標記物，后者可以通過增加 CD69 的表達來促進組織駐留无埃。作者之前的研究表明徙瓶，LN 和皮膚中的記憶 T 細胞維持具有不同的特性，因為后者需要 CD103 表達嫉称，而前者不需要侦镇。無論如何，目前的研究不排除 LN 和皮膚compartments之間通過逆行遷移的潛在通信织阅，眾所周知壳繁，逆行遷移在病毒感染模型中維持 LN Trm 種群。雖然我們沒有觀察到 LN Trm 細胞在結合 30 天后達到平衡蒲稳，但在自身免疫過程中可能會在幾個月內通過淋巴管實現更漸進的平衡氮趋。此外，LN Trm 細胞與 LN 中的小群 CD103-Tcirm 細胞共存江耀，后者不產生 IFNg剩胁，并表現出更類似干細胞或祖細胞耗盡的狀態(tài)。更好地了解 LN 和皮膚中這些腫瘤特異性區(qū)室之間的關系應該更好地了解我們對區(qū)域抗腫瘤免疫的理解祥国。
根據先前的工作查看目前的研究昵观，腫瘤抗原的性質可能是 LN Trm 生成的重要因素。我們之前表明 MAV 是形成針對 LN 中共享黑色素瘤/黑色素細胞抗原的記憶所必需的舌稀。雖然之前的工作沒有根據 Trm 標記區(qū)分 LN population啊犬，但我們現在認識到這些依賴白斑的population是 Trm 細胞。相比之下壁查，針對 B16 表達的 OVA（一種模型腫瘤特異性抗原）的 T 細胞在 LN 中發(fā)育成常規(guī)的 CD62Lhi 記憶 T 細胞觉至。黑色素細胞抗原被 MAV 小鼠 LN 中的 T 細胞持續(xù)感知，并且可以維持 LN Trm 種群睡腿。 LN Trm population可能反過來使自身免疫性白癜風持續(xù)存在语御，盡管這仍有待探索峻贮。盡管慢性抗原暴露，CD8⁺ T 細胞可以抵抗自身免疫的衰竭应闯。人們可能推測抗原指導 Trm 細胞在 LN 內的定位纤控，因為 pmel Trm 細胞聚集在 SCS 中，其中抗原由 APC 交叉呈遞碉纺。值得注意的是船万，腫瘤抗原交叉呈遞和早期轉移性侵襲都發(fā)生在 SCS 內。將需要涉及自發(fā)轉移小鼠模型的研究來證明 Trm 細胞可防止真正轉移到 SCS骨田。然而耿导，我們發(fā)現 Trm 細胞駐留在這個空間表明它們在戰(zhàn)略上定位這樣做。
我們對初始抗原接觸位點遠端器官中持久黑色素瘤保護的鑒定改進和擴展了腫瘤特異性記憶 T 細胞反應作為組織受限的概念盛撑。 與 LN 相比碎节，肺中的腫瘤保護是由該組織中的 Tcirm 細胞群介導的捧搞。 肺黑色素瘤保護中對 Tcirm 細胞的要求可能反映了腫瘤細胞引入該器官的機制抵卫，這是通過 Tcirm 細胞更普遍的靜脈途徑發(fā)生的。 由于肺 Trm 細胞通常占據氣道胎撇，因此它們可能更適合針對原發(fā)性肺癌的免疫介粘。 聯體共生與門靜脈注射手術相結合的技術挑戰(zhàn)排除了我們對肝臟中這種現象的研究，盡管我們可以推測 Tcirm population廣泛介導了針對黑色素瘤轉移到內臟器官的免疫晚树。

In conclusion, the present studies reveal the tissue-wide diversity of anti-tumor memory T cells, while highlighting a novel population of protective Trm cells within LNs. This work adds to a growing body of literature supporting a role for Trm cells in cancer immunity while filling a long-standing void in our understanding of tumor rejection within LNs. We propose that the installation of memory T cells across lymphoid and peripheral tissues will be a critical path to achieving curative cancer immunity.

Methods（關注一些重點方法）

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