2021年11月25日阴绢，美國明尼蘇達(dá)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室醫(yī)學(xué)和病理學(xué)系的研究人員在?Nature Communications?雜志上發(fā)表了“Single-cell analysis identifies dynamic gene expression networks that govern B cell development and transformation”的研究。該研究利用單細(xì)胞測序技術(shù)精確地描述了 B 細(xì)胞發(fā)育的不同階段奉狈，發(fā)現(xiàn)了前 B 細(xì)胞前期分化的幾個(gè)階段，包括一個(gè)前 BCR 依賴階段和兩個(gè)前 BCR 非依賴階段青自，表現(xiàn)出不同的增殖方式炫隶。前 BCR 依賴階段分化過程的特征是轉(zhuǎn)錄因子 EBF1 的運(yùn)動調(diào)節(jié)以及與 RNA 結(jié)合蛋白 YBX3 發(fā)生相互變化，而前 BCR 非依賴階段與趨化因子和細(xì)胞因子受體的變化相關(guān)咐刨，提示這些階段可能涉及骨髓中前 BCR 非依賴階段亞群的差異定位。最后扬霜，研究了與不同急性 B 淋巴細(xì)胞白血捕瘛（B-ALL）亞型相關(guān)的 B 細(xì)胞發(fā)育節(jié)點(diǎn)以及它們與預(yù)后的關(guān)系，證明 YBX3 與人類 B-ALL 不良預(yù)后相關(guān)著瓶。

研究背景

流式細(xì)胞術(shù)和各種表面和細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記物描繪了 B 細(xì)胞發(fā)育的不同階段联予。然而，這些標(biāo)記不足以充分劃分不同的亞群材原，導(dǎo)致不能完全理解 B 細(xì)胞發(fā)育軌跡中 B 系轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)動力學(xué)以及在增殖和分化交替周期下轉(zhuǎn)錄程序的編排沸久，捕捉 B 細(xì)胞從一個(gè)階段分化到下一個(gè)階段的過渡狀態(tài)尤為困難。此外余蟹，B 細(xì)胞正常分化過程中的干擾可導(dǎo)致 B 細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血簿砜琛（B-ALL）的發(fā)生。最近對 B-ALL 亞型的表征顯示了不同的轉(zhuǎn)錄特征威酒，表明 B 細(xì)胞的轉(zhuǎn)化有多個(gè)起源點(diǎn)或受不同的信號通路驅(qū)動窑睁。因此，了解正常的 B 細(xì)胞轉(zhuǎn)錄程序可以確定轉(zhuǎn)化發(fā)生的階段以及 B-ALL 如何利用 B 細(xì)胞完成發(fā)育途徑葵孤。

研究思路

研究結(jié)果

1. 利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄和蛋白標(biāo)記測序技術(shù)識別 B 細(xì)胞的發(fā)育階段

為了將轉(zhuǎn)錄信息與 B 細(xì)胞階段定義的表面標(biāo)志物的表達(dá)相結(jié)合担钮，研究聯(lián)合使用了單細(xì)胞 RNA-seq 和 CITE-Seq。選取兩只野生型 C57BL/6 小鼠骨髓尤仍，分別用識別 CD45 和 MHC I 類的獨(dú)特寡標(biāo)記抗體進(jìn)行標(biāo)記箫津，進(jìn)一步用 CITE-Seq 抗體對細(xì)胞染色并富集早期 B 細(xì)胞（圖1a）。對轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)進(jìn)行處理宰啦，得到了7454個(gè)細(xì)胞鲤嫡，14個(gè)細(xì)胞群（圖1b）。通過測定代表不同時(shí)期的典型基因的表達(dá)水平绑莺，發(fā)現(xiàn)增殖細(xì)胞（G1PM、S和G2/M期）聚集在遠(yuǎn)離靜止細(xì)胞（G0/G1）的地方惕耕，表明循環(huán)狀態(tài)是變化的主要來源（圖1c）纺裁。同樣，Mki67?基因表達(dá)水平在 G1PM、S 或 G2/M 期細(xì)胞中較高（圖1c）欺缘。與單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)相比栋豫，CITE-seq 數(shù)據(jù)具有更高的敏感性，被標(biāo)記為 CD43+?的細(xì)胞組成了大部分的循環(huán)細(xì)胞谚殊，符合之前報(bào)道的循環(huán)祖 B 細(xì)胞的特征（圖1d）丧鸯。

圖1 B 細(xì)胞圖譜和不同階段表達(dá)特點(diǎn)

2. 前祖 B 細(xì)胞和祖 B 細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄特征

對前祖 B 細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞表達(dá)早期 B 系相關(guān)基因，如?Flt3嫩絮、Il7r?和?Cd79a（圖2a）丛肢。這些細(xì)胞同時(shí)也高表達(dá)髓系相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子?Runx2、Irf8?和?Tcf4剿干，以及漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞標(biāo)記物?Bst2蜂怎，而在祖 B 細(xì)胞階段，這些基因的表達(dá)被抑制（圖2b）置尔。進(jìn)一步評估了前人報(bào)道的抑制 Ebf1 靶基因（包括?Tyrobp杠步、Clec12a、Cd300a榜轿、Cd7幽歼、Chdh?和?Mycl）的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)這些靶基因在前祖 B 細(xì)胞中高表達(dá)谬盐，而在祖 B 細(xì)胞中表達(dá)較低甸私，進(jìn)一步將前祖 B 細(xì)胞與祖 B 細(xì)胞區(qū)分開來（圖2c，2b）设褐。之后使用先前顯示可富集 B 細(xì)胞祖細(xì)胞的 CD93 ADT 抗體表達(dá)來確定 B 細(xì)胞偏向的非定向祖細(xì)胞在這個(gè)群中的存在颠蕴。結(jié)果顯示在該群中，CD93 表達(dá)中位數(shù)以上的細(xì)胞富集了 B 細(xì)胞分化相關(guān)基因助析，如?Ebf1犀被、Cd24a?和?Vpreb1（圖2d）。傳統(tǒng)上被描述為 c-KIT+?細(xì)胞的祖 B 細(xì)胞表達(dá)了?Kit?基因外冀。此外寡键，祖 B 細(xì)胞表達(dá)了?Bcl-2?家族基因?Bok?和干擾素刺激基因?Ifitm2?和?Ifitm3（圖2e）。最后雪隧，Ebf1?正向調(diào)節(jié)了前 BCR 替代輕鏈基因?Vpreb1?和?Igll123?的表達(dá)西轩。與不表達(dá) Ebf1 的前祖 B 細(xì)胞相比，祖 B 細(xì)胞高表達(dá)?Vpreb1?和?Igll1（圖2f）脑沿。證實(shí)了一些與前祖 B 細(xì)胞向祖 B 細(xì)胞過渡相關(guān)的基因表達(dá)模式藕畔，同時(shí)識別出高度特異性的祖 B 細(xì)胞標(biāo)記，如?Bok庄拇。

圖2 前祖 B 細(xì)胞和祖 B 細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄特征

3. 前 B 細(xì)胞增殖包括前 BCR 依賴和前?BCR 非依賴的增殖階段

對前 BCR 依賴的增殖簇進(jìn)行轉(zhuǎn)錄特征分析發(fā)現(xiàn)前 BCR 依賴的細(xì)胞適度表達(dá)了?Vpreb1?和?Igll1注服，上調(diào)表達(dá)神經(jīng)顆粒素?Nrgn?和一種調(diào)節(jié)?Slc7a5?和?Slc3a2?翻譯的 DNA/RNA 結(jié)合蛋白?Ybx3（圖2f, 3a）韭邓。Myc?在表達(dá)?Ybx3、Slc7a5?和?Slc3a2?的前 BCR 依賴細(xì)胞中表達(dá)最高溶弟，但?Ebf1?的表達(dá)顯著減少女淑，轉(zhuǎn)錄因子?Pax5?的表達(dá)基本不變，Ikzf1?被適度誘導(dǎo)（圖3a, 3b）辜御。與?Ebf1?低表達(dá)相一致的是鸭你，Ebf1?的靶基因如?Cd79a?和?Cd79b32?以及前 BCR 信號負(fù)調(diào)節(jié)因子?Il7r?的表達(dá)在前 BCR 依賴期顯著降低（圖3c）。對前 BCR 依賴細(xì)胞群中前100個(gè)差異上調(diào)基因進(jìn)行 LISA 和 GSEA 分析發(fā)現(xiàn)?Myc?是前 BCR 依賴的增殖過程中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子（圖3d）擒权。進(jìn)一步分析了包含?Ebf1?結(jié)合位點(diǎn)的差異調(diào)控基因袱巨，發(fā)現(xiàn) EBF1 在?Nrgn?和?Myc?的啟動子、Myc?增強(qiáng)子以及?Slc7a5?和?Slc3a2?的啟動子區(qū)有明顯或潛在的結(jié)合位點(diǎn)（圖3e）菜拓。對野生型和?Pax5+/??×Ebf1+/?白血病前體 B 細(xì)胞進(jìn)行 RNA-seq瓣窄，發(fā)現(xiàn)?Slc7a5?和?Slc3a2?以及?Ybx3?隨著?Ebf1?基因表達(dá)的降低而上調(diào)，表明 EBF1 介導(dǎo)了前?BCR 相關(guān)基因表達(dá)的抑制（圖3f）纳鼎。

圖3?前?BCR 依賴細(xì)胞群表達(dá)分析

對其余循環(huán)細(xì)胞的特征分析發(fā)現(xiàn)俺夕，這些細(xì)胞具有中等水平的 ADT-CD43 表達(dá)，表明它們正在向靜止的 CD43lo/?小前 B 細(xì)胞階段過渡贱鄙。這些細(xì)胞群中的一些細(xì)胞表達(dá)前 B 細(xì)胞的 marker 蛋白 CD25（圖4a）劝贸。然而，與前?BCR 依賴的細(xì)胞群不同的是逗宁，這些細(xì)胞高表達(dá)?Bach2（一種抑制抗原受體信號傳導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子）映九，而低表達(dá)?Ybx3?和?Myc（圖3a, 4b, 4c），表明這些前 B 細(xì)胞的增殖不依賴于前 BCR 信號瞎颗。對前?BCRi I 中前?BCR 依賴和非依賴的細(xì)胞之間的差異表達(dá)基因進(jìn)行比較件甥，發(fā)現(xiàn)前?BCR 非依賴的細(xì)胞高表達(dá)高?Il7r?和?Ebf1（圖3b, c, 4d）。對前?BCR 非依賴 2個(gè)亞群分析發(fā)現(xiàn)哼拔，前?BCRi I 高表達(dá)組蛋白基因（圖4d）引有，而前?BCRi II 在表達(dá)細(xì)胞運(yùn)動相關(guān)的肌動蛋白（Actg1）、動力蛋白（Dynll1）和胸腺素（Tmsb4x?和?Tmsb10）基因的細(xì)胞中富集（圖4e）倦逐。有趣的是譬正，隨著前 B 細(xì)胞到達(dá)?前?BCR 非依賴階段，Cxcr4?的表達(dá)進(jìn)一步被誘導(dǎo)（圖4b）檬姥。CXCR4 的表達(dá)會促進(jìn)前?BCR 非依賴細(xì)胞靶向?CXCL12 表達(dá)的細(xì)胞曾我，這些細(xì)胞也經(jīng)常在骨髓中高表達(dá)?IL7。因此健民，前?BCR 非依賴細(xì)胞可能依賴于 CXCR4/IL7R 信號抒巢，并可能受 MIF/CD74/CD44 和 IGF1/IGF1R 信號軸介導(dǎo)，以有效地從前?BCR 依賴狀態(tài)過渡到前?BCR 非依賴狀態(tài)秉犹。

圖4?前?BCR 非依賴細(xì)胞群表達(dá)分析

4. B 細(xì)胞分化和成熟

靜止 IgM-?細(xì)胞中?Rag1?和?Rag2?的高表達(dá)虐秦，表明前 B 細(xì)胞和祖 B 細(xì)胞發(fā)生了 V（D）J 重組（圖5a）平酿。Igkc?在所有細(xì)胞亞群中都有表達(dá)，但除了循環(huán)前 B 細(xì)胞和前?BCR 依賴的 B 細(xì)胞外悦陋，Iglc1、?Iglc2?和?Iglc3?只在一個(gè)細(xì)胞亞群中表達(dá)（圖5a）筑辨。IgM+?細(xì)胞被分成三個(gè)簇：未成熟 B 細(xì)胞俺驶、循環(huán)未成熟 B 細(xì)胞和成熟 B 細(xì)胞。循環(huán)未成熟 B 細(xì)胞表面高表達(dá) IgM棍辕，未成熟 B 細(xì)胞表達(dá)?Ms4a1?和表面蛋白（CD20）暮现，而成熟 B 細(xì)胞表達(dá)?Ms4a4c、H2-Aa楚昭、Sell?和?Ltb（圖5b）和表面蛋白 IgM 和 CD43（圖1d）栖袋。

圖5 B 細(xì)胞分化和成熟

5.?B 細(xì)胞發(fā)育的擬時(shí)序和模塊分析

歸一化細(xì)胞周期相關(guān)基因之后將轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)重新聚類并使用階段定義 marker 確定了 B 細(xì)胞發(fā)育的13個(gè)不同階段。未成熟 B 細(xì)胞被分成兩個(gè)細(xì)胞群抚太，前?BCRi II S 和 G2/M 被合并為一個(gè)細(xì)胞群塘幅，進(jìn)行擬時(shí)序分析識別跨越發(fā)育軌跡變化的基因模塊（圖6a, b）。對這些基因模塊進(jìn)一步分析表明尿贫，B 細(xì)胞的早期階段（包括前祖 B 細(xì)胞和祖 B 細(xì)胞）在細(xì)胞粘附過程中顯著富集电媳，而這些信號在前 B 細(xì)胞中減弱（模塊1和模塊8，圖6c, d）庆亡。此外匾乓，循環(huán)祖 B 細(xì)胞和前BCR 依賴細(xì)胞富集涉及代謝過程的基因（模塊6），提示在 B 細(xì)胞發(fā)育過程中主要檢查點(diǎn)后的代謝重編程又谋。最后拼缝，對轉(zhuǎn)錄因子、表觀遺傳修飾因子（圖6e）彰亥、細(xì)胞因子咧七、趨化因子及其相應(yīng)受體（圖6f）的表達(dá)評估表明 B 細(xì)胞發(fā)育過程中表達(dá)動力學(xué)存在差異。

圖6 B 細(xì)胞擬時(shí)序軌跡和基因模塊展示

6. 階段特異性基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)與人 B-ALL 亞型和預(yù)后相關(guān)

為了識別與人類 B-ALL 亞型相關(guān)的 B 細(xì)胞發(fā)育途徑剩愧，研究使用 Seurat 和 Monocle 分析中識別的差異上調(diào)基因猪叙，將每個(gè)階段的轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)與不同的人類 B-ALL 亞型進(jìn)行比較（圖7a）。結(jié)果表明富集在祖細(xì)胞仁卷、前?BCR 依賴和前?BCR 非依賴亞群中的人類 B-ALL 亞型（BCL2/MYC穴翩、IKZF1、N159Y 和 KMT2A 亞型）锦积，都與高風(fēng)險(xiǎn)不良預(yù)后相關(guān)芒帕，而具有其他 B 細(xì)胞分化階段特征的基因如 ETV6-RUNX1 和 ZNF384 的 B-ALL 亞型，則預(yù)后良好（圖7a）丰介。進(jìn)一步聚類檢驗(yàn)結(jié)果顯示背蟆，B 細(xì)胞增殖與分化階段的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖7b鉴分，左），與 B 細(xì)胞增殖相關(guān)的高風(fēng)險(xiǎn)白血病明顯不同于與 B 細(xì)胞分化相關(guān)的低風(fēng)險(xiǎn)白血泊颉（圖7b志珍，右）。前?BCR 模塊基因?YBX3?和?NRGN?在 BCL2/MYC垛叨、IKZF1伦糯、N159Y 和 MEF2D?B-ALL 亞型中顯著高表達(dá)，但并非所有前 BCR 基因都具有這種模式嗽元，表明與正常發(fā)育的 B 細(xì)胞相比敛纲，B-ALL 具有轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性（圖7c）剂癌。通過檢測?YBX3?的表達(dá)與 B-ALL 預(yù)后的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)?YBX3?表達(dá)高于中位數(shù)以上的兒童 B-ALL 預(yù)后較差，而成人 B-ALL 患者生存率無顯著差異（圖7d）佩谷。確定了在 B 細(xì)胞發(fā)育過程中受調(diào)控的 B 細(xì)胞基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)（圖7e），并特別證明?YBX3?與人類 B-ALL 不良預(yù)后相關(guān)寡具。

圖7 B-ALL 亞型分析

研究結(jié)論

研究主要從機(jī)制上探討了 B 細(xì)胞發(fā)育過程與高風(fēng)險(xiǎn)白血病的關(guān)系稚补。通過激活不同的增殖模塊，導(dǎo)致高風(fēng)險(xiǎn)白血病和不良預(yù)后课幕。在前 BCR 依賴白血病中，使用靶向 YBX3 或前 BCR 相關(guān)模塊的診斷方法也許能進(jìn)一步改善這些高危 B-ALL 患者的預(yù)后杜秸。

參考文獻(xiàn)

Lee, R.D., Munro, S.A., Knutson, T.P.et?al.?Single-cell analysis identifies dynamic gene expression networks that govern B cell development and transformation.Nat Commun12,?6843 (2021). https: //doi.org/10.1038/s41467-021-27232-5.