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Dynamic blood single-cell immune responses in patients with COVID-19.

影響因子：13.493

PMID：33677468

期刊年卷：Signal Transduct Target Ther 2021 03 06;6(1)

DOI：10.1038/s41392-021-00526-2

摘要

由 SARS-CoV-2 病毒引起的 2019 年冠狀病毒病 (COVID-19) 爆發(fā)是持續(xù)的全球衛(wèi)生緊急情況哪工。但是，該病毒的發(fā)病機(jī)制尚不清楚苗胀，并且無(wú)法治愈該疾病。-疾病描述

我們通過(guò)使用 5' 基因表達(dá)瑞妇、T 細(xì)胞受體 (TCR) 和 B 細(xì)胞受體 (BCR) V(D)J 轉(zhuǎn)錄組分析豌研，研究了 COVID-19 患者不同階段血液免疫反應(yīng)的動(dòng)態(tài)變化。我們從 16 名 COVID-19 患者的 25 個(gè)樣本中獲得了 341,420 個(gè)外周血單核細(xì)胞 (PBMC) 和 185,430 個(gè)克隆型 T 細(xì)胞和 28,802 個(gè)克隆型 B 細(xì)胞的單細(xì)胞 mRNA 測(cè)序 (scRNA-seq) 數(shù)據(jù)仿吞，用于動(dòng)態(tài)研究缰犁。此外淳地，我們使用了三個(gè)對(duì)照樣品。-方法

我們發(fā)現(xiàn)樹(shù)突狀細(xì)胞 (DC)帅容、CD14+ 單核細(xì)胞颇象、和巨核細(xì)胞祖細(xì)胞 (MP)/血小板以及 COVID-19 患者的幼稚 CD4+ T 淋巴細(xì)胞減少，以及危重患者的 CD8+ T 淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞 (NK) 顯著減少并徘。-結(jié)果1

I型干擾素（IFN-I）遣钳、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和鐵死亡途徑在疾病活動(dòng)期間被激活，并在患者病情好轉(zhuǎn)后逐漸恢復(fù)麦乞。

與這一發(fā)現(xiàn)一致蕴茴，IFN-I 信號(hào)誘導(dǎo)基因的 mRNA 水平 并在病情好轉(zhuǎn)后逐漸恢復(fù)。IFN-I 信號(hào)誘導(dǎo)基因IFI27的 mRNA 水平在患者COVID-19驗(yàn)證隊(duì)列顯著增加姐直，其中包括38名患者和35個(gè)對(duì)照對(duì)照組比較倦淀。-驗(yàn)證1

在 215 名 COVID-19 患者和 106 名對(duì)照者的額外隊(duì)列中，與對(duì)照者相比简肴，COVID-19 患者****血清中干擾素-α（IFN-α）的濃度顯著增加****晃听，進(jìn)一步表明了COVID-19免疫反應(yīng)中的IFN-I通路。TCR 和 BCR 序列分析表明砰识，COVID-19 患者對(duì) SARS-CoV-2 抗原產(chǎn)生了特異性免疫反應(yīng)。-驗(yàn)證2

我們的研究揭示了人類血液對(duì) SARS-CoV-2 感染的免疫反應(yīng)的動(dòng)態(tài)格局佣渴，為治療 COVID-19 的治療潛力提供了線索辫狼。-結(jié)論

PBMC 的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組

從全血中分離出每個(gè)個(gè)體的外周血單個(gè)核細(xì)胞 (PBMC)，并在 10X 基因組學(xué)平臺(tái)上使用 Chromium Next GEM Single-Cell V(D)J Reagent Kits v1.2 對(duì) PBMC 進(jìn)行 scRNA-seq 分析（圖1a）辛润。從 19人19 個(gè)樣本中獲得了 241,292 個(gè) PBMC 細(xì)胞膨处、131,391 個(gè) TCR 克隆和 23,674 個(gè) BCR 克隆，其中包括 16 名 COVID-19 患者和 3 名對(duì)照。PCA和 t-SNE表明真椿，標(biāo)準(zhǔn)化后 19 個(gè)樣本之間沒(méi)有批次效應(yīng)（圖 1b）鹃答。在這些樣本中，我們確定了 8 種完全不同的 PBMC 細(xì)胞類型突硝，根據(jù)使用 Seurat V3 R 包以 0.9 分辨率的聚類結(jié)果测摔，可以將其進(jìn)一步分為 30 個(gè)細(xì)胞亞型（簇）（圖 1c, d）。

8個(gè)PBMC的細(xì)胞類型包括

CD4 + T淋巴細(xì)胞通過(guò)識(shí)別CD4解恰，

CD8 + T淋巴細(xì)胞通過(guò)識(shí)別CD8A锋八，

CD16 +由識(shí)別單核細(xì)胞FCGR3A，

CD14 +單核細(xì)胞通過(guò)識(shí)別CD14通過(guò)鑒定护盈，

自然殺傷細(xì)胞（NK可以）KLRF1通過(guò)鑒定挟纱，

B細(xì)胞MS4A1，

樹(shù)突狀細(xì)胞（DCS）通過(guò)識(shí)別FCER1A通過(guò)識(shí)別和

巨核細(xì)胞祖細(xì)胞/血小板（MP /血小板）PF4（圖（圖1c）腐宋。部分樣品中標(biāo)記基因的 t-SNE 表達(dá)圖顯示在補(bǔ)充圖S1 中紊服。30 種細(xì)胞亞型的詳細(xì)信息如圖 1 所示。

圖1d包括7種CD4+ T淋巴細(xì)胞亞型胸竞、6種CD8+ T淋巴細(xì)胞亞型欺嗤、4種B淋巴細(xì)胞亞型以及其他細(xì)胞亞型。

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圖1COVID-19 患者和對(duì)照組 PBMC 的細(xì)胞組成撤师。

a用于 scRNA 測(cè)序的樣本和研究設(shè)計(jì)簡(jiǎn)要總結(jié)剂府。樣品的詳細(xì)信息見(jiàn)表S1。

b COVID-19 患者與正常對(duì)照的整合分析結(jié)果顯示主成分 (PC) 和 TSNE 算法可視化剃盾。樣品之間沒(méi)有觀察到批次效應(yīng)腺占。

c由已知細(xì)胞標(biāo)記物鑒定的8種主要 PBMC 細(xì)胞類型。

d COVID-19 患者與正常對(duì)照的整合分析結(jié)果顯示主成分（PC）痒谴、TSNE 和 UMAP 可視化衰伯。總共在 PBMC 中鑒定了 30 種細(xì)胞亞型积蔚。

e將每個(gè)患者與正常對(duì)照進(jìn)行比較的 PBMC 的主要細(xì)胞類型組成的比率的組成意鲸。計(jì)算每個(gè)樣品中每種細(xì)胞類型的比例，然后比較病例和對(duì)照之間每種細(xì)胞類型的比例（對(duì)于對(duì)照樣品尽爆，使用三個(gè)對(duì)照樣品的平均比例進(jìn)行比較）怎顾。

f每個(gè)細(xì)胞亞型的前 30 個(gè)基因的基因表達(dá)熱圖。

g PBMC 的所有 30 種細(xì)胞亞型組成的比率組成漱贱，將每位患者與正常對(duì)照進(jìn)行比較槐雾。計(jì)算每個(gè)樣本中各細(xì)胞亞型的比例，然后比較各細(xì)胞亞型在病例和對(duì)照之間的比例（對(duì)照樣品以三個(gè)對(duì)照樣品的平均比例進(jìn)行比較）

COVID-19患者與對(duì)照組PBMC細(xì)胞亞型比例的比較

大多數(shù) COVID-19 患者的髓系 DC幅狮、CD14+ 單核細(xì)胞和 MP/血小板擴(kuò)增募强，而超過(guò)一半的 COVID-19 患者的 CD16+ 單核細(xì)胞和 NK 減少****（圖1e****）株灸。

na?ve CD4+ T 淋巴細(xì)胞亞型核糖體編碼基因（如*****RPL32、RPL30擎值、RPS12*****和*****RPS3A*****）為標(biāo)志的（簇 1）在所有住院患者中均降低慌烧。鑒于核糖體編碼基因在病毒 RNA 轉(zhuǎn)錄和復(fù)制中起關(guān)鍵作用（CL：14985，在 STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)中）鸠儿，核糖體編碼基因在na?ve CD4+ T 淋巴細(xì)胞中的高表達(dá)可能與病毒的復(fù)制有關(guān)屹蚊。

na?ve CD8+ T（簇 4，高表達(dá)的非編碼 RNA LINC02446捆交，EEF1A1和EEF1B2）和 NKs（簇 13淑翼，高表達(dá)胱抑素超家族基因CST7、殺傷細(xì)胞凝集素樣受體KLRD1和KLRG1也被發(fā)現(xiàn)在超過(guò)一半的患者中減少品追。

效應(yīng)記憶CD8 T（簇23玄括，高度表達(dá)STMN1，HMGB2肉瓦，TUBA1B遭京，HIST1H4C），CD14 +單核細(xì)胞（簇10泞莉，高度表達(dá)FCN1哪雕，LYZ，S100A8鲫趁，簇12斯嚎，高度表達(dá)S100A12，S100A6挨厚、TYROBP和簇 16堡僻，高表達(dá)CAMP、LCN2疫剃、CCL3和CCL3L1）钉疫、na?ve B 細(xì)胞（簇 19，高表達(dá)*****CD74*****巢价、*****CD79A*****和*****HLA-DRA*****）牲阁、髓系 DC（簇 21，高表達(dá)*****HLA-DRB5壤躲、HLA-DPB1*****和*****HLA-DQA1*****）和** MP/血小板（簇11城菊，高表達(dá)的*****CAVIN2*****、*****HIST1H2AC*****和*****TUBB1*****和簇 28碉克，高表達(dá)的*****HIST1H4H*****役电、*****HIST1H3H*****、*****H3F3A*****和*****NT5C3A*****）在超過(guò)一半的患者中增加棉胀。**每個(gè)簇中前 30 個(gè)基因的基因表達(dá)熱圖如圖1f所示法瑟。

終末 CD8+ 效應(yīng)細(xì)胞耗竭與疾病危急狀態(tài)有關(guān)（圖 2a、b中的紅色箭頭）唁奢。與其他條件相比霎挟，溫和組呈現(xiàn)出更高的na?ve B 細(xì)胞比例（圖 2a、b 中的綠色箭頭）麻掸。這些結(jié)果表明酥夭，終末 CD8+ 效應(yīng) T 細(xì)胞耗竭可能與處于危急狀態(tài)的患者有關(guān)，并且大部分用于產(chǎn)生抗體的na?ve B 細(xì)胞擴(kuò)增可能會(huì)阻止 COVID-19 惡化脊奋。

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圖2SARS-CoV-2 感染的五個(gè)細(xì)胞簇的 UMAP 預(yù)測(cè)和 IFN-I 和 MAPK 通路的基因表達(dá)變化熬北。

a危急 ( n = 2)、重度 ( n = 1)诚隙、中度 ( n = 6)讶隐、輕度 ( n = 3)、治愈 ( n = 4) 和對(duì)照 ( n = 3)之間的五個(gè)細(xì)胞簇的UMAP 投影. 紅色箭頭效應(yīng)CD8 + T（CTL）的久又，綠色箭頭B細(xì)胞巫延。與 COVID-19 患者和對(duì)照組相比，它們發(fā)生了顯著變化地消。

b統(tǒng)計(jì)顯著性（每個(gè)其他條件與對(duì)照比較）炉峰，用于在所述的細(xì)胞群。

c危重患者（患者 1 和患者 2）與正常對(duì)照脉执。

d重癥患者（患者 3）與正常對(duì)照疼阔。

e中度患者（患者 4-9）與正常對(duì)照，以及f治愈患者（患者 11 和 10）與正常對(duì)照半夷。

g – j 分別在危重 ( g )婆廊、重度 ( h )、中度 ( i ) 和治愈的 COVID-19 患者與正常對(duì)照 ( j )中 MAPK 目標(biāo)的 UMI 計(jì)數(shù)的 Log2 倍變化玻熙。每個(gè)點(diǎn)代表不同的細(xì)胞亞型

COVID-19 患者和對(duì)照組之間的差異表達(dá)途徑

通過(guò)STRING網(wǎng)絡(luò)分析否彩，發(fā)現(xiàn)除了呼吸和氧化磷酸化等基本代謝信號(hào)通路外，顯著富集的信號(hào)通路主要參與了5條通路的過(guò)度激活（圖 2c-j嗦随，補(bǔ)充圖S3 –S7)：

(1) 病毒基因組復(fù)制和感染（病毒 mRNA 翻譯列荔、肽鏈延長(zhǎng)和 SRP 依賴性共翻譯靶向膜蛋白，在 CD14+ 單核細(xì)胞枚尼、na?ve CD4+ T 細(xì)胞和其他細(xì)胞中高度表達(dá)）贴浙；

(2)I型干擾素信號(hào)（IFN-I）（在na?veB細(xì)胞和CD14+單核細(xì)胞中高表達(dá)）；

(3)絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）（還包括AP-1署恍、Jun和bZIP Maf轉(zhuǎn)錄因子）（在na?veB細(xì)胞崎溃、CD8+ T細(xì)胞和NKs中高表達(dá)）；

(4)淋巴樣和非淋巴樣細(xì)胞之間的免疫學(xué)相互作用（在終末CD8+效應(yīng)T細(xì)胞和na?veB細(xì)胞中高度表達(dá)）盯质；

(5) 主要組織相容性復(fù)合體 (MHC) II 類蛋白質(zhì)復(fù)合體（在 B 細(xì)胞中高度表達(dá)）****2c-j****袁串，補(bǔ)充圖****S8-S9****）概而。

然而，在治愈患者中MAPK通路基因的表達(dá)下調(diào)囱修，表明MAPK通路基因的表達(dá)降低是患者康復(fù)的好兆頭（圖****2j****）赎瑰。

COVID-19患者病情改善前后配對(duì)比較

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圖 3危重病人1改善前后動(dòng)態(tài)研究。動(dòng)態(tài)研究中確定的細(xì)胞類型

aTSNE 圖（P1-1破镰、P1-2餐曼、P1-3、P2-1鲜漩、P2-2源譬、m P2-3、P3-1孕似、P3-2踩娘、P6-1、 P6-2鳞青、P7-1霸饲、P7-2、P9-1臂拓、P9-2厚脉、P10-1 和 P10-2）。

b P1-1（臨界狀態(tài)）和P1-2（改善狀態(tài)）的TSNE圖胶惰，顯示了兩個(gè)樣品中的細(xì)胞類型分布傻工。c P1-2 和 P1-3（固化條件下）的 TSNE 圖，顯示了兩個(gè)樣品中的細(xì)胞類型分布孵滞。

d P1-1中捆、P1-2和P1-3所有細(xì)胞亞型的比較。

eP1-1 和 P1-2 之間與病毒 mRNA 翻譯坊饶、IFN-1泄伪、MAPK 靶標(biāo)和鐵死亡有關(guān)的基因的 UMI 計(jì)數(shù)的 Log2 倍變化。每個(gè)點(diǎn)代表不同的細(xì)胞亞型匿级。

f在 P1-2 和 P1-3 之間蟋滴，參與病毒 mRNA 翻譯、IFN-1痘绎、MAPK 靶標(biāo)和鐵死亡的基因的 UMI 計(jì)數(shù)的 Log2 倍變化津函。每個(gè)點(diǎn)代表不同的細(xì)胞亞型

與改善階段相比，包括病毒 mRNA 翻譯孤页、IFN-I 和 MAPK 在內(nèi)的途徑在關(guān)鍵階段顯著上調(diào)（圖 ****3e****）尔苦。KEGG 分析顯示，與改善階段相比，一種受調(diào)節(jié)的細(xì)胞死亡形式——鐵死亡——在疾病關(guān)鍵階段顯著上調(diào)（圖 ****3e****允坚，補(bǔ)充圖****S13****）魂那。與治愈階段相比，包括病毒 mRNA 翻譯屋讶、IFN-I 和 MAPK 在內(nèi)的途徑在改善階段也上調(diào)（圖 3f冰寻，補(bǔ)充圖S14- S15 )。鐵死亡涉及的基因表達(dá)譜在改善期和治愈期之間沒(méi)有顯著變化皿渗，表明鐵死亡主要發(fā)生在關(guān)鍵階段，并在改善階段逐漸恢復(fù)正常（圖3f）轻腺。在比較危重乐疆、改善和治愈階段時(shí)，在另一名危重患者 - 患者 2 中發(fā)現(xiàn)了類似的細(xì)胞類型和亞型贬养、途徑和基因表達(dá)模式的變化（補(bǔ)充圖S16- S 20）挤土。

與第一輪分析中的正常對(duì)照相比，癥狀嚴(yán)重的患者3顯示淋巴細(xì)胞擴(kuò)增误算；他的淋巴細(xì)胞擴(kuò)增在治愈階段減少（圖4a仰美、b）。與治愈階段相比儿礼，包括病毒 mRNA 翻譯咖杂、IFN-I 和 MAPK 在內(nèi)的途徑在嚴(yán)重階段顯著上調(diào)（圖4c）。然而蚊夫，ferroptosis 信號(hào)通路在疾病嚴(yán)重階段只是略微上調(diào)（補(bǔ)充圖S21- S 22）诉字，這可能是因?yàn)樗牧馨图?xì)胞細(xì)胞的擴(kuò)張。對(duì)于三名 COVID-19 中度患者——患者 6知纷、7 和 9——與治愈階段相比壤圃，IFN-I 和 MAPK 通路在疾病階段均顯著上調(diào)（圖4d-f，補(bǔ)充圖S23- S 30 )琅轧。與患者 6 和 7 的治愈階段相比伍绳，病毒 mRNA 翻譯和鐵死亡途徑在疾病階段顯著上調(diào)。然而乍桂，與治愈階段相比冲杀，疾病階段病毒 mRNA 翻譯和鐵死亡沒(méi)有顯著上調(diào)∧＠患者 9漠趁，這可能是由于她相對(duì)較高的 T 和 B 細(xì)胞擴(kuò)增（補(bǔ)充圖S27- S 29）。病情較輕的患者——患者 10——表現(xiàn)出輕度的免疫反應(yīng)忍疾。

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圖 4重癥患者3和中度患者6的疾病和治愈情況的動(dòng)態(tài)研究闯传。

在對(duì) P3-1（嚴(yán)重疾病）和 P3-2（治愈疾猜倍省）進(jìn)行動(dòng)態(tài)研究的患者中鑒定的細(xì)胞類型TSNE 圖甥绿。

b P3-1和P3-2所有細(xì)胞亞型的比較字币。

c P3-1 和 P3-2 之間病毒 mRNA 翻譯、IFN-1 和 MAPK 靶標(biāo)基因的 UMI 計(jì)數(shù)的 Log2 倍數(shù)變化共缕。每個(gè)點(diǎn)代表不同的細(xì)胞亞型洗出。對(duì)于對(duì)照組，僅繪制 DE 基因（FDR < 0.05）图谷。細(xì)胞亞型如圖 1 所示翩活。

d對(duì) P6-1 和 P6-2 進(jìn)行動(dòng)態(tài)研究的患者中鑒定的細(xì)胞類型的 TSNE 圖，顯示了兩種狀態(tài)下的細(xì)胞類型分布便贵。

e P6-1 和 P6-2 的所有細(xì)胞亞型的比較菠镇。f與病毒 mRNA 翻譯、IFN-1承璃、MAPK 靶標(biāo)和 P6-1 和 P6-2 之間的鐵死亡有關(guān)的基因的 UMI 計(jì)數(shù)的 Log2 倍變化利耍。每個(gè)點(diǎn)代表不同的細(xì)胞亞型。對(duì)于對(duì)照組盔粹，僅繪制 DE 基因（FDR < 0.05）隘梨。細(xì)胞亞型如圖 1 所示。

COVID-19 患者的 TCR 和 BCR 擴(kuò)增

從 19 名參與者獲得的 28 個(gè)樣本中檢測(cè)到 185,430 個(gè)克隆型 T 細(xì)胞和 28,802 個(gè)克隆型 B 細(xì)胞舷嗡。

COVID-19 患者和對(duì)照患者的庫(kù)顯示每個(gè)人的克隆型 T 細(xì)胞和 B 細(xì)胞存在很大差異轴猎。

每個(gè)患者的克隆型 T 細(xì)胞分布如圖 5a（補(bǔ)充表S7）。

通過(guò)比較7例患者病情好轉(zhuǎn)前后的克隆型T細(xì)胞咬崔，我們發(fā)現(xiàn)患者的克隆型T細(xì)胞的相對(duì)數(shù)量從疾病到痊愈呈下降趨勢(shì)（圖5b）税稼。

然而，在危急情況下（患者 1-1 和患者 2-1）檢測(cè)到較低的克隆型細(xì)胞垮斯，這可能是由于該疾病階段的淋巴細(xì)胞耗竭所致郎仆。在中度患者 9 中檢測(cè)到最高相對(duì)數(shù)量的克隆型 T 細(xì)胞（圖5a、b)兜蠕，這可能是由于她的淋巴細(xì)胞的擴(kuò)張扰肌。

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圖 5T 淋巴細(xì)胞和 B 淋巴細(xì)胞 V(D)J 克隆擴(kuò)增和 COVID-19 患者 5'mRNA、T 細(xì)胞受體 (TCR) 和 B 細(xì)胞受體 (BCR) 綜合分析的 TSNE 圖熊杨。

a V(D)J 在每位患者中檢測(cè)到的 T 細(xì)胞克隆數(shù)

b患者 1曙旭、2、3晶府、6桂躏、7、9川陆、10 的疾病狀況和康復(fù)情況檢測(cè)到的 T 細(xì)胞克隆數(shù)

c V(D)J 在每個(gè)患者中檢測(cè)到的 B 細(xì)胞克隆數(shù)剂习。d在患者1，2，3鳞绕，6失仁，7，9疾病和恢復(fù)條件的B細(xì)胞克隆的數(shù)量進(jìn)行檢測(cè)们何，10萄焦。

è克隆在每個(gè)患者相關(guān)的IgH序列

F不同 COVID-19 患者 IgH 基因可變區(qū)的突變數(shù)量。統(tǒng)計(jì)顯著性是指對(duì)同一患者不同病程的動(dòng)態(tài)分析數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)冤竹。* P < 0.05拂封，** P < 0.01，*** P < 0.001贴见；t檢驗(yàn)烘苹。

g住院患者的克隆型 T 細(xì)胞

h治愈患者的克隆型 T 細(xì)胞

i住院患者的克隆型 B 細(xì)胞

j治愈患者的克隆型 B 細(xì)胞

住院患者：P1-1、P1-2片部、P2-1、P2-2霜定、P3-1档悠、P6-1、P7-1望浩、P9-1辖所、P10-1。治愈患者：P1-3磨德、P2-3缘回、P3-2、P6-2典挑、P7-2酥宴、P9-2、P10-2您觉。這些患者的詳細(xì)細(xì)胞類型如圖 1 所示拙寡。

k克隆型 T 細(xì)胞（末端效應(yīng) CD8 T 細(xì)胞）的 TSNE 圖：CVVNYYKAAGNKLTF_CASSSLGSAPRELFF（TRAV12-101、TRAJ1701 和 P2-1琳水、P2-2 和 P2-3 中的 TRAC*010）

與克隆型 T 細(xì)胞相比肆糕，檢測(cè)到的克隆型 B 細(xì)胞的總數(shù)要低得多（圖****5c, d****, 補(bǔ)充表****S8**** )≡谛ⅲ患者總克隆型 B 細(xì)胞的相對(duì)數(shù)量隨著病情的改善而增加（圖 ****5d****）诚啃。

免疫球蛋白 (Ig) 基因的 V(D)J 片段以有序的方式重新排列，以在 B 細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中與抗原相遇之前產(chǎn)生主要的 Ig 庫(kù)私沮；

在免疫反應(yīng)過(guò)程中始赎，活化的 B 細(xì)胞在生發(fā)中心內(nèi)進(jìn)行克隆擴(kuò)增，Ig 基因的可變區(qū)可以進(jìn)一步突變以產(chǎn)生高親和力的抗體。

詳細(xì)分析表明极阅，幾乎所有這些 COVID-19 患者都產(chǎn)生了與克隆相關(guān)的 IgH 基因（圖5e）胃碾。所有患者的 IgH 基因的可變區(qū)均高度突變，每個(gè)基因平均有 9.39 個(gè)核苷酸（圖 5f）筋搏。

通過(guò)在 5' 基因表達(dá)文庫(kù) scRNA 的 TSNE 圖中繪制克隆型 T 細(xì)胞和克隆型 B 細(xì)胞仆百，進(jìn)一步對(duì) 5' 基因表達(dá)文庫(kù)、T 細(xì)胞受體 (TCR) 和 B 細(xì)胞受體 (BCR) 數(shù)據(jù)進(jìn)行了綜合分析數(shù)據(jù)（圖3a) 比較住院條件下相同患者的TCR和BCR擴(kuò)增條件奔脐。住院條件下的克隆型 T 細(xì)胞主要是終末 CD8 + 效應(yīng) T 細(xì)胞（圖****5g****); 在治愈條件下俄周，除終末CD8+效應(yīng)T細(xì)胞外，還檢測(cè)到Th1/Th17/Tregs中的高頻克隆型T細(xì)胞（圖****5h髓迎，****紅色箭頭）峦朗。

對(duì)于克隆型 B 細(xì)胞，在這些患者的住院條件下未發(fā)現(xiàn)過(guò)度高頻擴(kuò)增（圖 5i）排龄。然而波势，在這些患者的治愈情況下，可以在na?veB細(xì)胞中檢測(cè)到高頻克隆型B細(xì)胞（圖5j橄维， 紅色箭頭）尺铣。

這些結(jié)果呈現(xiàn)了 T 和 B 淋巴細(xì)胞的細(xì)胞擴(kuò)增動(dòng)態(tài)景觀。

COVID-19患者隨著病情好轉(zhuǎn)表現(xiàn)出不同程度的特異性記憶T細(xì)胞擴(kuò)增或保存争舞。使用 scRNA-seq 數(shù)據(jù)凛忿，我們可以識(shí)別不同疾病條件下記憶克隆型 T 細(xì)胞中的抗原受體序列。

具有以下TCR可變序列的克隆型效應(yīng)記憶CD8 T細(xì)胞在疾病的不同階段在危重患者2中顯著增加竞川。

(1) CVVNYYKAAGNKLTF_CASSSLGSAPRELFF (TRAV12-101, TRAJ1701 和 TRAC*01) 在 P2-1（關(guān)鍵）中有 11 個(gè)克隆店溢，在 P2-2（改進(jìn)）中有 88 個(gè)克隆（FDR = 5.99 × 10 -4 , P2- 1 vs. P2-2委乌，調(diào)整二項(xiàng)式概率床牧，下同），P2-3（治愈）222個(gè)克赂Ｔ琛（FDR = 9.48 × 10 -39叠赦，P2-2 vs. P2-3）（圖5k）。這些克隆從終末效應(yīng) CD8 T 細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)樾?yīng)記憶 CD8 T 細(xì)胞革砸，從疾病狀態(tài)到治愈狀態(tài)（圖 5k）除秀。

(2) CAMKTSYDKVIF_CASTPGDTIYF (TRAV12-301, TRAJ5001, TRAC*01)在P2-1中有6個(gè)克隆，在P2-2中有23個(gè)克滤憷（FDR = 3.92 × 10 -5册踩，P2-1 vs. P2-2 )，以及 P2-3 中的 50 個(gè)克滦谩（FDR = 8.32 × 10 -6暂吉，P2-2 vs. P2-3）胖秒。

(3) CAFRKDTGRRALTF_CASSPQGGGGYTF (TRAV2401, TRAJ501, TRAC*01)在P2-1中有4個(gè)克隆，在P2-2中有12個(gè)克履降摹（FDR = 9.75 × 10 -4阎肝，P2-1 vs. P2-2），和 P2-3 中的 24 個(gè)克掳菇帧（FDR = 0.01风题，P2-2 與 P2-3）。這些克隆型細(xì)胞的擴(kuò)增和保存可能與患者對(duì) SARS-CoV-2 抗原的記憶有關(guān)嫉父。

通過(guò)分析在疾病過(guò)程中發(fā)生變化的 Ig 編碼基因沛硅，我們發(fā)現(xiàn)變化最大的基因?qū)儆?IGHV3 家族（IGHV3-21、IGHV3-22绕辖、IGHV3-30摇肌、IGHV3-48、IGHV3-49仪际、IGHV3-72围小， 等等）。其他家族树碱，如IGKV1吩抓、IGKV3、IGLV2赴恨、IGLV3、IGLV1和IGHV4伴栓，在不同的疾病條件下也發(fā)生了很大的變化（圖S31a）伦连。這些樣品的 IgG 和 IgM 值顯示在補(bǔ)充圖S31b 中. 在最近治愈的情況下，患者具有比正常對(duì)照更多的 Ig 基因（補(bǔ)充圖S32）钳垮』蟠荆總之，參與 B 細(xì)胞抗體產(chǎn)生的適應(yīng)性免疫可能在對(duì)抗 SARS-COV-2 中發(fā)揮關(guān)鍵作用饺窿。

IFN-I和MAPK信號(hào)的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)

從 scRNA-seq 分析中歧焦，參與 IFN-I、MAPK 通路的基因在 COVID-19 患者中穩(wěn)定上調(diào)肚医。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一發(fā)現(xiàn)(real-time RT-PCR) 檢測(cè)另一組 38 名 COVID-19 患者中相關(guān)基因的表達(dá)绢馍，其中包括 3 名重癥、3重癥患者肠套、19 名中度患者舰涌、3 名輕度患者和 10 名治愈的 COVID-19 患者和 35 名正常對(duì)照組（圖 6a）。IFI27cRNA-seq 數(shù)據(jù)中 COVID-19 患者中最強(qiáng)的上調(diào)基因你稚。與正常對(duì)照組相比瓷耙，重癥患者上調(diào)8.1倍朱躺，重癥患者51.7倍，中度患者39.9倍搁痛，輕癥患者38.6倍长搀，治愈患者29.5倍（圖6a）。免疫熒光染色顯示IFI27在 COVID-19 患者的淋巴細(xì)胞中高表達(dá)鸡典，但在對(duì)照組的淋巴細(xì)胞中僅部分表達(dá)（圖6b源请、c）。與對(duì)照組相比轿钠，IFN-I 通路中的另一個(gè)基因BST2在 COVID-19 患者中也顯示出上調(diào)（圖 6a）巢钓。這些結(jié)果表明IFI27和BST2是 SARS-CoV-2 感染的候選標(biāo)記基因。FOS是一種介導(dǎo) MAPK 途徑的轉(zhuǎn)錄因子疗垛，在 COVID-19 患者中顯示出顯著上調(diào)症汹，但在康復(fù)患者中通過(guò)實(shí)時(shí) RT-PCR 分析顯示出明顯下調(diào)（圖 6a）。這表明FOS是 COVID-19 患者康復(fù)的候選標(biāo)志物贷腕。

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圖 6IFN-I信號(hào)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證背镇。

a干擾素途徑中的IFI27和BST2以及MAPK 途徑中的FOS的實(shí)時(shí) PCR 驗(yàn)證。IFI27和BST2在 COVID-19 患者中上調(diào)泽裳。FOS被上調(diào)在住院患者但是在治愈的患者（下調(diào)? = 3為關(guān)鍵瞒斩，? = 3嚴(yán)重，? 中度= 19涮总，? = 3溫和胸囱，? = 10用于固化患者COVID-19和35正常控制）瀑梗。* P < 0.05烹笔，** P < 0.01，*** P < 0.001; 學(xué)生t檢驗(yàn)抛丽。

b比較 COVID-19 和正常對(duì)照的 IFI27 免疫熒光信號(hào)的統(tǒng)計(jì)顯著性谤职。* p < 0.05；** p < 0.01亿鲜；*** p < 0.001允蜈。

c COVID-19 患者和正常對(duì)照的 PBMC中IFI27 的免疫熒光染色。

d ELISA檢測(cè)的257例COVID-19和106例匹配的COVID-19患者血清中IFN-α濃度蒿柳，包括重癥和危重癥組（12.02 ug/mL ± 2.80饶套，N = 68）、中度組（23.99 g/mL ± 4.840其馏，N = 133 例）凤跑、輕度組（20.29 ug/mL ± 7.732，N = 34 例）和治愈組（9.637 ug/mL ± 1.184叛复，N = 22 名患者）仔引。* P < 0.05扔仓，** P < 0.01，*** P < 0.001咖耘；單向方差分析

ELISA進(jìn)一步測(cè)量了 257 名 COVID-19 患者和 106 名匹配對(duì)照者血清中的總 IFN-α 濃度翘簇。將患者分為四組：重癥組、中度組儿倒、輕度組和治愈組版保。我們發(fā)現(xiàn)患者的總 IFN-α 水平顯著高于對(duì)照組（p < 0.001, 17.79 ug/mL ± 2.55 vs. 6.42 ug/mL ± 0.703）。中度組（p < 0.001夫否，23.99 ug/mL ± 4.840彻犁，N = 133 名患者）和輕度（p < 0.001，20.29 ug/mL ± 7.732凰慈，N = 34 名患者）患者的IFN-α 顯著增加（圖 6d）汞幢。重癥組和重癥組血清中IFN-α濃度為12.02 ug/mL ± 2.80 ( N = 68) ，治愈組為9.637 ug/mL ± 1.184 ( N = 22, p < 0.05,)（圖6d）微谓。這一結(jié)果表明森篷，中度患者產(chǎn)生的 IFN-α 水平最高.

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