Biomamba薦語

這是一篇優(yōu)秀的粉絲來稿陷虎，詳略得當(dāng)?shù)貫槲覀冋故玖酥黝}為"單細(xì)胞測序揭示鼻咽癌微環(huán)境的基質(zhì)動力學(xué)和腫瘤特異性特征"的內(nèi)容，并且前來投稿時甚至排好了版面珊皿，點一個大大的贊截粗！該文又是一篇2021發(fā)表在Nature Communication》上的文章，我個人其實對NC的文章比較偏愛达吞，該雜志無論是寫作张弛、圖片的風(fēng)格都值得學(xué)習(xí)(況且一般都附帶一大堆的supplement來豐富內(nèi)容)。

doi:
10.1038/s41467-021-21795-z

鏈接：
https://www.nature.com/articles/s41467-021-21795-z

Abstract

鼻咽癌(NPC)的腫瘤微環(huán)境(TME)中存在著一個異質(zhì)性的酪劫、動態(tài)的基質(zhì)群體吞鸭。對這種腫瘤特異性生態(tài)系統(tǒng)的全面了解對提高癌癥診斷、治療和預(yù)后是必要的契耿。為了構(gòu)建完整的鼻炎基質(zhì)細(xì)胞浸潤的深入圖譜瞒大，作者對來自14例患者進(jìn)行了單細(xì)胞RNA測序，并結(jié)合了T和B細(xì)胞的克隆型鑒定搪桂。確定并描述了5個主要的基質(zhì)集群和36個不同的亞種群基于遺傳圖譜透敌。通過與非惡性微環(huán)境中的浸潤細(xì)胞進(jìn)行比較盯滚，得到了TME中具有高度代表性的特征，包括表型豐度酗电、遺傳變異魄藕、免疫動力學(xué)、克隆擴(kuò)增撵术、發(fā)育軌跡和分子相互作用背率，這些特征深刻影響患者的預(yù)后和治療結(jié)果。這些關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)在兩個單細(xì)胞RNA測序隊列和兩個批量RNA測序隊列中得到了進(jìn)一步獨立驗證嫩与。

Background

● 1 鼻咽癌相對于其他腫瘤具有強(qiáng)烈的免疫浸潤寝姿，并且分化程度較低；

● 2 eb病毒(EBV)感染（為什么提這個划滋？）可以通過慢性免疫激活改變鼻咽癌微環(huán)境影響腫瘤的進(jìn)展和治療結(jié)果饵筑。

● 3 放化療仍然是治療鼻咽癌的一線選擇，但對于晚期或轉(zhuǎn)移性腫瘤患者处坪，它往往不能達(dá)到最佳效果根资，免疫療法已成為治療許多癌癥的一種很有前途的策略。

免疫治療鼻咽癌的核心問題

缺乏對鼻咽癌微環(huán)境的全面認(rèn)識同窘，不斷阻礙著治療干預(yù)的優(yōu)化玄帕。

解決核心問題前需要做的事情

● ① 闡明鼻咽癌患者和非惡性患者腫瘤浸潤間質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)、動態(tài)和功能特征想邦。
● ②充分識別和鑒別鼻咽癌微環(huán)境中裤纹，其他駐留tme的淋巴細(xì)胞、髓系細(xì)胞和成纖維細(xì)胞案狠。

Results

● 1 單細(xì)胞RNA測序鑒定鼻咽癌微環(huán)境中的基質(zhì)細(xì)胞

● 本研究共納入14例患者服傍，其中11例診斷為鼻咽癌，其余診斷為NLH（鼻咽淋巴增生）骂铁。單細(xì)胞測序獲得66627個細(xì)胞吹零，其中50169個細(xì)胞(75%)來自NPC微環(huán)境，16458個細(xì)胞(25%)來自非惡性微環(huán)境拉庵，平均每個細(xì)胞檢測到1215個中位基因和99739個中位reads灿椅，使用Seurat R包(3.0版本)來執(zhí)行下游分析，通過marker 基因?qū)⑺屑?xì)胞劃分為6個主要的細(xì)胞群（T細(xì)胞钞支、B細(xì)胞茫蛹、NK細(xì)胞、髓原淋巴細(xì)胞烁挟、成纖維細(xì)胞（腫瘤微環(huán)境中的基質(zhì)細(xì)胞）以及腫瘤細(xì)胞）婴洼。患者間分析顯示撼嗓，T細(xì)胞和B細(xì)胞是鼻咽癌微環(huán)境中最主要的細(xì)胞類型柬采，而患者6是一種非常罕見的分化型鼻咽癌欢唾，其骨髓和B細(xì)胞浸潤異常，提示鼻咽癌分化程度可能影響TME間質(zhì)浸潤粉捻。

● 結(jié)果圖中的邏輯關(guān)系

● A為單細(xì)胞測序的流程圖礁遣，并且根據(jù)marker將腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞分為了6組，接著通過TCR和BCR的識別肩刃，看T細(xì)胞和B細(xì)胞的擴(kuò)增祟霍，這是本文的一個核心的流程圖；B圖從左往右分別是主要細(xì)胞譜系(左)盈包、樣本類型(中)和相應(yīng)的患者(右)進(jìn)行顏色編碼沸呐，來做初步的可視化，樣本的主要組分相差不大呢燥。彼此之間可以做進(jìn)一步的比較垂谢。C圖是在a中定義的主要譜系的標(biāo)記基因表達(dá)情況，進(jìn)一步確定B中聚類的結(jié)果與分成的6個細(xì)胞組分是對應(yīng)的疮茄，MS4A1是B細(xì)胞特異表達(dá)的，JCHAIN是樹突狀細(xì)胞的分子marker根暑。D圖使用柱狀圖量化了不同的微環(huán)境中主要細(xì)胞的相對豐度力试，發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞和B細(xì)胞是最主要的細(xì)胞類型。E圖對每一個樣本中微環(huán)境中的主要細(xì)胞占比進(jìn)行量化排嫌，并且通過F圖HE染色發(fā)現(xiàn)鼻咽癌微環(huán)境基質(zhì)浸潤程度很高畸裳。

● 2 鼻咽癌和非惡性微環(huán)境中T細(xì)胞多樣性的鑒定和表征

● 從32,656個T細(xì)胞中提取了14個亞群，這些細(xì)胞群代表鼻咽微環(huán)境中最常見和最多樣化的細(xì)胞類型淳地，這些亞群中鑒別出三個不同的耗竭T細(xì)胞亞群他們的標(biāo)記分子分別是LAG3, HAVCR2和TOX怖糊，這些T細(xì)胞的亞群在患者之間的異質(zhì)性并不強(qiáng)，并且在惡性以及非惡性腫瘤微環(huán)境中也相對統(tǒng)一颇象，但相對豐度和激活/抑制特征存在顯著差異伍伤。

● 在鼻咽癌微環(huán)境中高度富集了兩個耗竭的T細(xì)胞亞群，特征是高表達(dá)免疫檢查點HAVCR2和耗竭相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子TOX遣钳，與HAVCR2耗竭T細(xì)胞持續(xù)分布于所有鼻咽癌患者不同的是扰魂，在9號患者中發(fā)現(xiàn)了廣泛浸潤的TOX耗竭T細(xì)胞，這表明它們是一個高度的患者特異性亞型蕴茴，其他類型的T細(xì)胞劝评，包括調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和激活T細(xì)胞，也優(yōu)先浸潤在TME中倦淀，而na?ve T細(xì)胞和中央記憶T細(xì)胞更可能駐留在非惡性微環(huán)境中蒋畜，耗竭性和抑制性T細(xì)胞亞型在鼻咽癌患者中高度富集。作者進(jìn)一步通過CD3撞叽、CD8姻成、FOXP3和PD-1的多色免疫熒光驗證了耗竭T細(xì)胞和Treg細(xì)胞在NPC腫瘤微環(huán)境有富集的情況插龄，并且得到的結(jié)果與單細(xì)胞測序一致。這些實驗結(jié)果提示功能障礙和免疫抑制T細(xì)胞向腫瘤微環(huán)境的浸潤在很大程度上影響了T細(xì)胞對鼻咽癌的免疫佣渴。

● 隨后作者比較了鼻咽癌和非惡性微環(huán)境來源的T細(xì)胞中的標(biāo)志通路辫狼，來尋找鼻咽癌和非惡性腫瘤微環(huán)境中T細(xì)胞中的相關(guān)信號通路的差異。途徑分析顯示辛润，干擾素-γ (IFN-γ)反應(yīng)和干擾素-α (IFN-α)反應(yīng)在npc來源的T細(xì)胞中上調(diào)膨处，提示由于慢性激活導(dǎo)致的1型和2型干擾素(IFNs)的過量產(chǎn)生可能顯著影響浸潤T細(xì)胞的組成和功能狀態(tài)，來源于非惡性微環(huán)境的T細(xì)胞主要受核因子κ -輕鏈活化B細(xì)胞(NF-κB)通路的影響砂竖，其他途徑真椿，如糖酵解、同種異體排斥反應(yīng)和氧化磷酸化在TME駐留的T細(xì)胞中表現(xiàn)出較高的偏好乎澄。

● 進(jìn)一步證實鼻咽癌浸潤與非惡性微環(huán)境中T細(xì)胞的分子差異突硝。作者通過MAST分析來識別T細(xì)胞中的差異表達(dá)基因(DEGs)，在所有的DEGs中置济，通過RegNetwork預(yù)測了前30個上調(diào)基因的上游轉(zhuǎn)錄因子解恰，并通過Cytoscape構(gòu)建了基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)CXCL13和LGALS1在NPC來源的 T細(xì)胞中顯著上調(diào)浙于。CXCL13是卵泡T輔助細(xì)胞的基因標(biāo)志之一护盈，但也發(fā)現(xiàn)它在耗盡的T細(xì)胞，特別是PD-1+ T細(xì)胞上高度表達(dá)羞酗，作者根據(jù)基因表達(dá)的中位數(shù)將鼻咽癌患者分為cxcl13 -高和cxcl13 -低兩組腐宋，觀察到cxcr13 -高的患者CXCR5+ B細(xì)胞的比例明顯更高，此外檀轨，CXCL13的高表達(dá)與鼻咽癌患者更好的無進(jìn)展生存相關(guān)胸竞，這表明CXCL13高耗盡的T細(xì)胞可能仍然有利于免疫調(diào)節(jié)。LGALS1在npc相關(guān)的treg中高表達(dá)参萄，在lgals1高的患者中卫枝，免疫抑制的Treg的比例明顯高于靜止的Treg，這表明它可能在Treg激活中發(fā)揮重要作用讹挎。此外剃盾，基于基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)S100A11和S100A4在LGALS1+ Treg中表達(dá)上調(diào)淤袜，并預(yù)測其與LGALS1相互作用痒谴，表明其調(diào)控作用可能通過鈣通道依賴過程發(fā)揮作用（可能的機(jī)制提出，背景知識是：CXCL13與CCR5之間的關(guān)系是什么铡羡？為什么去檢查CCR5的含量积蔚？）。

● 3 功能模塊烦周、克隆分析和發(fā)育軌跡揭示了耗竭T細(xì)胞和Treg在鼻咽癌微環(huán)境中的動態(tài)變化

●作者構(gòu)建了包含與代表性基因相關(guān)度最高的10個基因的基因圖譜尽爆≡豕耍基于這些基因圖譜，利用glm函數(shù)在na?ve T細(xì)胞漱贱、細(xì)胞毒性T細(xì)胞槐雾、耗盡T細(xì)胞和treg中建立了廣義線性模型。廣義線性模型根據(jù)基因圖譜中的每個基因的表達(dá)權(quán)重分配一個不同的參數(shù)幅狮。隨后募强，根據(jù)模型估計的參數(shù)計算功能評分，這些參數(shù)代表某些細(xì)胞類型的相對豐度崇摄。

● ① 功能模塊：首先對CD8+ T細(xì)胞簇內(nèi)的細(xì)胞毒性程序進(jìn)行了定量比較擎值。結(jié)果表明，耗竭的T細(xì)胞簇(C5逐抑、C6和C7)維持著中到高的細(xì)胞毒性活性鸠儿，而不是終末期功能失調(diào)，這表明可能存在一個過渡過程厕氨，在TME中进每，效應(yīng)T細(xì)胞由于慢性激活和腫瘤依賴機(jī)制而逐漸失去細(xì)胞毒性，說明從激活到耗竭的轉(zhuǎn)變確實是一個動態(tài)過程命斧，T細(xì)胞可以處于前期耗竭品追、中期耗竭或晚期耗竭狀態(tài)；na?ve程序?qū)λ蠺細(xì)胞的定量分析顯示冯丙，CD4+和CD8+ na?ve T細(xì)胞的na?ve評分較高。對Treg程序的分析表明遭京，抑制Treg比休眠Treg具有更強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)能力（如何得到這一結(jié)論的胃惜？）。同時作者還使用了數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)驗證了線性模型的可靠性哪雕。

● ② 克隆分析：為了描述浸潤T細(xì)胞在鼻咽癌和非惡性微環(huán)境中的克隆多樣性船殉，作者系統(tǒng)地分析了通過耦合V(D)J譜分析獲得的單個T細(xì)胞上的TCRs的身份∷购浚總的來說利虫，平均每個病人身上檢測到2071個獨特的克隆型。正如預(yù)期的那樣堡僻，克隆型在不同的患者中高度可變糠惫，但克隆大小的組成在鼻咽癌和NLH患者中保持相對一致。因此钉疫，根據(jù)每個克隆分配的細(xì)胞數(shù)將克隆型分為三類(參考克隆大小≥3硼讽，=2，=1)牲阁，在鼻咽癌患者中發(fā)現(xiàn)較大克隆大小(克隆大小≥3和=2)的比例顯著富集固阁，表明在TME中T細(xì)胞克隆擴(kuò)增強(qiáng)烈壤躲，相比之下，T細(xì)胞在非惡性微環(huán)境中的擴(kuò)張相對靜態(tài)备燃，因為其主要以克隆性小的T細(xì)胞為主(克隆大小= 1)碉克，隨后計算了4-13例患者的衰竭和Treg評分，發(fā)現(xiàn)這兩個評分都與大克隆性呈正相關(guān)并齐。這一結(jié)果表明漏麦，耗盡的T細(xì)胞和treg在TME中進(jìn)行了快速的克隆擴(kuò)增，最終導(dǎo)致這些T細(xì)胞亞型在鼻咽癌患者中更高的豐度冀膝。

● 為了進(jìn)一步了解克隆擴(kuò)增及其對T細(xì)胞動力學(xué)的影響唁奢，作者將每個患者中最大的前三個克隆及其對應(yīng)的克隆型投影到UMAP上。在大多數(shù)鼻咽癌患者中窝剖，激活的(C2和C3) T細(xì)胞和耗竭的(C5麻掸、C6和C7) T細(xì)胞具有相同的克隆型，驗證了激活-耗盡過渡的存在赐纱。同時作者還發(fā)現(xiàn)大量的tox2耗竭T細(xì)胞與havcr2耗竭T細(xì)胞具有相同的克隆型脊奋。由此，不同簇中耗竭T細(xì)胞并不是完全獨立的疙描，從一個耗竭的亞型到另一個耗竭的亞型可能發(fā)生狀態(tài)轉(zhuǎn)換诚隙，即從havcr2耗竭到tox耗竭，或從havcr2耗竭到tox耗竭起胰。同時實驗中還發(fā)現(xiàn)久又，大量增殖的T細(xì)胞也與耗竭的T細(xì)胞共享相同的克隆型，這表明耗竭的程序經(jīng)常伴隨著增殖的升高效五。隨后地消，作者進(jìn)行了TCR基序分析，發(fā)現(xiàn)盡管大多數(shù)基序在來自NPC或NLH微環(huán)境的T細(xì)胞中是一致的畏妖，但仍有一小部分TCR模式是NPC特異性的脉执。C5-LAG3、C6-HAVCR2和C7TOX不同轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的耗竭T細(xì)胞表現(xiàn)出不同的細(xì)胞毒性和耗竭活性戒劫，這表明耗竭T細(xì)胞的異質(zhì)性可能是由于從激活到耗竭的過渡和擴(kuò)增克隆引起的半夷。

● ③ 發(fā)育軌跡：通過Monocle v2對CD8+ T細(xì)胞和CD4+ T細(xì)胞進(jìn)行獨立的偽時間發(fā)育軌跡，這一發(fā)育軌跡提供了一種獨特的可視化方法來推斷鼻咽癌和非惡性微環(huán)境中T細(xì)胞的譜系結(jié)構(gòu)迅细。CD8+ T細(xì)胞軌跡顯示巫橄，HAVCR2耗竭、Tox3耗竭茵典、LAG3耗竭的T細(xì)胞和TRM嗦随？分別位于不同分支的末端，表明了它們不同的發(fā)育過程，效應(yīng)T細(xì)胞和記憶效應(yīng)T細(xì)胞位于兩者之間枚尼，表明它們處于中間發(fā)育狀態(tài)贴浙。進(jìn)一步證明耗竭是CD8+ T細(xì)胞發(fā)育的終末階段。CD4+ T細(xì)胞也表現(xiàn)出從na?ve T細(xì)胞到Treg細(xì)胞署恍、中央記憶T細(xì)胞和T濾泡輔助細(xì)胞的過渡過程崎溃。靜息態(tài)Tregs被認(rèn)為較早發(fā)展的亞型，抑制態(tài)Tregs作為一種更成熟的形式盯质，具有更強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)能力袁串，并具有更強(qiáng)的克隆擴(kuò)增能力。

● 4 B細(xì)胞特異性特征和B細(xì)胞亞型的NPC相關(guān)功能的預(yù)后價值

● ① NPC中B細(xì)胞特異性特征

●以前認(rèn)為腫瘤微環(huán)境中B細(xì)胞是相對同質(zhì)的細(xì)胞群體呼巷，作者在11種不同的亞型中檢測到了27,506個B細(xì)胞囱修，這是TME中第二大和第二主要的基質(zhì)細(xì)胞類型，在鼻咽癌組織中有獨特的先天性B細(xì)胞簇和生發(fā)中心B細(xì)胞簇王悍∑屏患者2、患者6和患者7的血漿B細(xì)胞特異性富集压储，主要參與了細(xì)胞間的相互作用B細(xì)胞在鼻咽癌微環(huán)境中的異質(zhì)性鲜漩。血漿B細(xì)胞和切換記憶B細(xì)胞數(shù)量在TME中明顯增加，但由于患者間差異較大集惋，未達(dá)到統(tǒng)計學(xué)意義孕似。在非惡性微環(huán)境中，共發(fā)現(xiàn)na?ve B細(xì)胞和固有樣B細(xì)胞富集刮刑，而在NPC中喉祭， ifn誘導(dǎo)的B細(xì)胞(包括na?ve形式)和雙陰性B細(xì)胞富集，從批量RNA測序數(shù)據(jù)中雷绢，反褶積分析證實血漿B細(xì)胞和雙陰性B細(xì)胞更容易滲透到鼻咽癌微環(huán)境中泛烙，而泛B細(xì)胞，包括na?ve B細(xì)胞习寸、未活化B細(xì)胞和固有樣B細(xì)胞，在非惡性微環(huán)境中優(yōu)先富集傻工。

●此外霞溪，NPC來源的B細(xì)胞和NLH來源的B細(xì)胞之間的遺傳差異很少，說明B細(xì)胞的腫瘤相關(guān)功能可能在很大程度上取決于其豐度中捆，而不是遺傳調(diào)控或細(xì)胞因子分泌的差異鸯匹。NPC來源的B細(xì)胞中差異表達(dá)基因主要為干擾素誘導(dǎo)和免疫球蛋白編碼基因，包括IFITM1泄伪、IFI44L殴蓬、IGHA1、IGKC和IGHG3，與T細(xì)胞亞群的結(jié)果一致染厅。B細(xì)胞通路分析顯示痘绎，NPC來源的B細(xì)胞也很大程度上受IFN-γ和IFN-α過量釋放的影響，而NLH來源的B細(xì)胞則因炎癥紊亂而改變肖粮。（2）B細(xì)胞亞型的NPC相關(guān)功能的預(yù)后價值

●腫瘤浸潤B細(xì)胞的存在通常與更好的總體生存和治療結(jié)果相關(guān)孤页，我們選擇了幾種具有代表性的B細(xì)胞標(biāo)記(CD79A, MS4A1, IGHD, nd FCRL4)，并檢查它們在鼻咽癌患者中的預(yù)后價值涩馆。生存分析顯示行施，特征基因與鼻咽癌患者較好的無進(jìn)展生存顯著相關(guān)，提示B細(xì)胞在抗鼻咽癌免疫中發(fā)揮積極作用魂那。

●為了進(jìn)一步了解浸潤B細(xì)胞的功能蛾号，作者進(jìn)行了克隆分析，以量化每個患者克隆型的分布和多樣性涯雅，作者平均在每個患者檢測到2419個獨特的克隆型鲜结，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，較大的B細(xì)胞克隆在鼻咽癌患者中顯著富集斩芭，而較小的B細(xì)胞克隆在NLH患者中富集轻腺。隨后，作者對B細(xì)胞的發(fā)育軌跡進(jìn)行了研究划乖，揭示了從na?ve B細(xì)胞到不同類型成熟B細(xì)胞的發(fā)育譜系贬养，包括血漿B細(xì)胞、切換記憶B細(xì)胞和ifn誘導(dǎo)的B細(xì)胞琴庵。同時還發(fā)現(xiàn)許多B細(xì)胞亞型處于中間發(fā)育狀態(tài)误算，如未激活B細(xì)胞、生發(fā)中心B細(xì)胞和雙陰性B細(xì)胞迷殿。

● 5 鼻咽癌微環(huán)境中髓系亞群的異質(zhì)性和動態(tài)

●3671個骨髓細(xì)胞聚集在11個亞群中儿礼，作者發(fā)現(xiàn)95%的細(xì)胞來自鼻咽癌患者，這表明骨髓積累是一個依賴于鼻咽癌的過程庆寺，單細(xì)胞數(shù)據(jù)顯示蚊夫，存在三種主要的髓系成分，包括骨髓源性抑制細(xì)胞(MDSCs)懦尝、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞(DCs)知纷。與T細(xì)胞和B細(xì)胞亞群相比，髓系細(xì)胞陵霉，尤其是TAMs琅轧，在患者間變異和組織特異性的驅(qū)動下表現(xiàn)出廣泛的異質(zhì)性。NPC源性髓系細(xì)胞和NLH源性髓系細(xì)胞通路的富集證實了IFNs的存在也嚴(yán)重地改變了鼻咽癌患者的髓系結(jié)構(gòu)踊挠，MAST分析和基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)顯示M2和M1極化相關(guān)基因在TAM中共表達(dá)乍桂，包括FCGR3A、FCGR2A、TREM2和APOC1睹酌，提示TAM亞群可能比傳統(tǒng)的M1/M2分類更為復(fù)雜权谁，其發(fā)育軌跡驗證了髓系細(xì)胞的動力學(xué)。

●反褶積分析顯示MDSC在鼻咽癌患者中高度富集忍疾，dc不僅存在于TME中闯传，而且在非惡性微環(huán)境中也經(jīng)常浸潤，沒有統(tǒng)計學(xué)意義卤妒。巨噬細(xì)胞主要為肝細(xì)胞甥绿、肝細(xì)胞、肝細(xì)胞则披、肝細(xì)胞和肝細(xì)胞共缕。c1 -FOLR2和C2CCL20 TAMs發(fā)育程序不同，C3-FCGR2B TAMs主要位于中間士复，表明其發(fā)育處于中間狀態(tài)图谷。包括C10-S100A9和C11-NFKB1在內(nèi)的MDSCs主要位于第4支末端，這表明它們是發(fā)育相似但轉(zhuǎn)錄不同的亞型阱洪。

● 6 成纖維細(xì)胞和NK細(xì)胞作為鼻咽癌治療的微環(huán)境靶點

●在鼻咽癌微環(huán)境中便贵，成纖維細(xì)胞和NK細(xì)胞代表兩種小亞群，MAST分析揭示了成纖維細(xì)胞和NK細(xì)胞中不同的基因表達(dá)譜(補(bǔ)充圖S7e)冗荸。編碼細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分的基因如COL1A1承璃、COL1A2、LUM和FN1在成纖維細(xì)胞中特異表達(dá)蚌本，這表明在鼻鼻癌微環(huán)境中的ECM是高度復(fù)雜的盔粹，可能通過整合素信號與周圍的腫瘤和基質(zhì)細(xì)胞相互作用。因此程癌，抑制腫瘤和免疫細(xì)胞上特定的整合素受體可能是一個潛在的治療靶點舷嗡，以破壞ecm依賴的腫瘤進(jìn)展和抑制免疫調(diào)節(jié)。與效應(yīng)T細(xì)胞類似嵌莉，NK細(xì)胞通常表達(dá)高水平的細(xì)胞毒性基因进萄，包括NKG7、GZMA锐峭、GZMB和GZMH中鼠。而GNLY和KLRD1在NK細(xì)胞中優(yōu)先表達(dá)。研究進(jìn)展表明只祠，NK細(xì)胞在慢性激活后也可以表現(xiàn)為KIR兜蠕、NKG2A扰肌、LAG3和HAVCR243抛寝、44的上調(diào)，但我們沒有觀察到這些衰竭標(biāo)志物在NK細(xì)胞中上調(diào)。此外盗舰，NK細(xì)胞差異表達(dá)趨化因子編碼基因XCL1和XCL2晶府，這是先前報道的招募CCR5+ DCs。由此可見钻趋，NK細(xì)胞在鼻咽癌微環(huán)境中仍然保持免疫激活狀態(tài)川陆，可能在鼻咽癌免疫應(yīng)答中發(fā)揮正向調(diào)節(jié)作用。

● 7 免疫動力學(xué)與患者生存的相關(guān)性蛮位，以及浸潤免疫細(xì)胞中的細(xì)胞-細(xì)胞通訊

●通過CIBERSORTx對88例鼻咽癌患者的rnas測序數(shù)據(jù)進(jìn)行反卷積较沪，估計免疫豐度，根據(jù)免疫豐度將患者進(jìn)一步分為三組失仁，分別為激活的腫瘤免疫微環(huán)境(TIME尸曼，聚類1和2)或滅活的腫瘤免疫微環(huán)境(聚類3)。計算每個患者的功能評分并歸一化萄焦，用于表征T細(xì)胞的動態(tài)狀態(tài)控轿。

●隨后，我們評估了每個免疫亞型和患者群體的風(fēng)險比拂封。結(jié)果顯示耗竭的T細(xì)胞與更好的無進(jìn)展生存相關(guān)茬射，而其他T細(xì)胞亞型與生存沒有顯著相關(guān)性。此外冒签，血漿B細(xì)胞在抛、dc和巨噬細(xì)胞豐度較高也與預(yù)后較好有關(guān)。與之前的研究一致镣衡，鼻咽癌患者中雙陰性B細(xì)胞和MDSCs比例較高預(yù)示無進(jìn)展生存較差霜定。因此，靶向雙陰性B細(xì)胞和MDSCs可能是一種有前景的鼻咽癌治療方法廊鸥，但需要進(jìn)一步研究以充分了解這些亞型在鼻咽癌微環(huán)境中的分子機(jī)制望浩。此外，t免疫評分低或TIME滅活的患者預(yù)后較差惰说。目前還缺乏鼻咽癌患者分層磨德、生存預(yù)測和治療評價的臨床模型。結(jié)合功能模塊的單細(xì)胞轉(zhuǎn)移方法增強(qiáng)了其作為疾病分類吆视、預(yù)測生存和治療結(jié)果的集成和可行模型的可靠性典挑，但仍需要在更大的臨床隊列中驗證我們的研究結(jié)果。

●為了描述來自鼻咽癌微環(huán)境和來自NLH微環(huán)境的細(xì)胞之間的分子相互作用的差異啦吧，我們應(yīng)用CellPhoneDB在38個確定的亞群中通過已知的配體受體對構(gòu)建了一個細(xì)胞-細(xì)胞通信網(wǎng)絡(luò)您觉，作者可視化了主要T和B亞群中的細(xì)胞通信。結(jié)果表明授滓，TME中三個耗竭的T細(xì)胞簇(HAVCR2琳水、TOX和LAG3)優(yōu)先與記憶B細(xì)胞肆糕、先天樣B細(xì)胞、未激活B細(xì)胞在孝、ifn誘導(dǎo)的B細(xì)胞相互作用诚啃，但與血漿B細(xì)胞、na?ve B細(xì)胞和雙陰性B細(xì)胞不相互作用私沮，因為這些亞型缺乏相互作用對始赎。此外，還發(fā)現(xiàn)了在T細(xì)胞和B細(xì)胞通信中不斷參與的特異性配體-受體對仔燕。并且發(fā)現(xiàn)造垛，與抑制型treg相比，休眠型treg與耗竭型T細(xì)胞的交互配對要少得多晰搀，這表明它們是一種不那么有活力和免疫抑制的亞型筋搏。與上述研究結(jié)果一致，在TME中厕隧，HAVCR2和TOX耗竭的T細(xì)胞與不同的B細(xì)胞亞群表現(xiàn)出強(qiáng)烈的相互作用奔脐，主要通過CXCL13-CXCR5軸。值得注意的是吁讨，與非惡性T細(xì)胞相比髓迎，來自NPC的耗竭T細(xì)胞和抑制treg細(xì)胞擁有更多的配體受體對，而休息treg細(xì)胞建丧、雙陰性B細(xì)胞和組織常駐T細(xì)胞擁有的配體受體對更少排龄。