Cancer Cell |CAR T細(xì)胞靶向GPC2根除神經(jīng)母細(xì)胞瘤

原創(chuàng)?huacishu?圖靈基因?2022-01-19 10:52

收錄于話題#前沿分子生物學(xué)機(jī)制

撰文：huacishu

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1壁公、作者開發(fā)了表達(dá)嵌合抗原受體（CAR）的T細(xì)胞妆毕，靶向glypican-2（GPC2），一種在神經(jīng)母細(xì)胞瘤（NB）和其他幾種實(shí)體瘤上表達(dá)的胎兒抗原贮尖。

2、作者使用標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計產(chǎn)生的CAR可以控制轉(zhuǎn)基因GPC2過表達(dá)的NB趁怔，但不能控制表達(dá)臨床相關(guān)的GPC2位點(diǎn)密度（5000分子/細(xì)胞湿硝，范圍1-6×103）的NB∪笈跨膜（TM）和共刺激結(jié)構(gòu)域的迭代工程加上c-Jun的過表達(dá)降低了GPC2-CAR抗原密度的閾值关斜，使表達(dá)臨床相關(guān)GPC2抗原密度的NB得到有效和持久的根除，而且沒有毒性铺浇。

3痢畜、這些研究強(qiáng)調(diào)了CAR設(shè)計和抗原密度閾值之間的關(guān)鍵相互作用，證明了適合臨床測試的主要GPC2-CAR候選者的有效療效和安全性鳍侣，并證明胎兒抗原是CAR T細(xì)胞治療實(shí)體瘤的一類有望靶點(diǎn)丁稀。

美國斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院Crystal L. Mackall教授課題組在國際知名期刊?Cancer Cell在線發(fā)表題為“GPC2-CAR T cells tuned for low antigen density mediate potent activity against neuroblastoma without toxicity”的論文。兒科癌癥通常模仿胎兒組織倚聚，并表達(dá)通常在產(chǎn)后沉默的蛋白質(zhì)线衫，可作為免疫靶標(biāo)。作者開發(fā)了靶向glypican-2(GPC2)的嵌合抗原受體(CAR) T細(xì)胞惑折，GPC2是一種在神經(jīng)母細(xì)胞瘤(NB)和其他實(shí)體瘤上表達(dá)的胎兒抗原授账。使用標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計的CARs控制過表達(dá)轉(zhuǎn)基因GPC2的NBs，而不是那些表達(dá)臨床相關(guān)GPC2位點(diǎn)的CARs惨驶“兹龋跨膜(TM)和共刺激域的迭代工程加上過表達(dá)c-Jun降低了GPC2- car抗原密度閾值，使臨床相關(guān)GPC2抗原密度的NBs得以有效和持久的消除粗卜，并且無毒性屋确。這些研究強(qiáng)調(diào)了CAR設(shè)計和抗原密度閾值之間的關(guān)鍵相互作用，證明了適合臨床測試的主要GPC2-CAR候選者的有效療效和安全性，并證明胎兒抗原是CAR T細(xì)胞治療實(shí)體瘤的一類有望靶點(diǎn)乍恐。

在人原始抗原結(jié)合片段(Fab)噬菌體文庫中鑒定了3個抗GPC2單鏈可變片段(scFvs) (GPC2.19, GPC2.27, GPC2.D4)和4個已報道的抗GPC2.D3片段(GPC2.D3)评疗。GPC2.D4和GPC2.27需要c -末端殘基(493-553)才能結(jié)合。GPC2.19?和GPC2.D3共享重疊的表位(圖1A)茵烈，包括殘基396-400(圖1B)百匆，這是GPC2.D3已知的成分。利用跨膜(TM)和4-1BB共刺激結(jié)構(gòu)域呜投，模擬tisagenlecleucel加匈，一種FDA批準(zhǔn)的CD19-CAR活性抗B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞胚性白血病(B- all)。作者設(shè)計了T細(xì)胞仑荐，以VH/VL和VL/VH方向表達(dá)包含每個scFv的GPC2 -CAR雕拼。具有優(yōu)良的生物物理性質(zhì)包括在原代激活的T細(xì)胞中穩(wěn)健表達(dá)和高抗原誘導(dǎo)的細(xì)胞因子產(chǎn)量。在沒有fc突變間隔區(qū)的情況下粘招，具有VL/VH定向的D3-CAR - T細(xì)胞被優(yōu)先用于進(jìn)一步的測試(圖1C)啥寇。作者測量了不同GPC2位點(diǎn)密度的NB細(xì)胞系的效價，包括高水平轉(zhuǎn)基因GPC2的等基因系NGP-GPC2 (GPC2hi, 34,052個分子/細(xì)胞);NBSD洒扎，表達(dá)中等水平GPC2的細(xì)胞系(GPC2mod, 20,270個分子/細(xì)胞);以及SMS-SAN辑甜，其低水平表達(dá)GPC2 (GPC2lo, 6873分子/細(xì)胞)(圖1D)，并觀察到GPC2產(chǎn)生細(xì)胞因子袍冷。D3-和GPC2.19-CARs與GPC2抗原密度直接相關(guān)(圖1E和1F)磷醋，這種依賴性在更大的NB細(xì)胞系中都成立。在體外低效靶比(1:5 E:T)下胡诗，GPC.D3-和GPC2.19-CARs能夠殺死GPC2hi邓线，但不能殺死GPC2mod或gpclo靶點(diǎn)(圖1G-1J)。gpc19 -CARs能夠控制GPC2hi異種移植煌恢，但不能控制GPC2mod和GPC2lo異種移植以來骇陈，體內(nèi)對高抗原密度的需求得到了證實(shí)(圖1K-1N)。

為了準(zhǔn)確測量患者NB細(xì)胞表面GPC2抗原密度症虑，作者開發(fā)了一種用于6種免疫治療相關(guān)抗原的抗原密度定量檢測方法缩歪。將此方法應(yīng)用于9個轉(zhuǎn)移性NB浸潤的骨髓標(biāo)本、一組細(xì)胞系和幾個病人來源的異種移植(PDX)腫瘤谍憔。選擇BM是因?yàn)樗荖B轉(zhuǎn)移的常見部位匪蝙，可以不經(jīng)組織酶解進(jìn)行分析。根據(jù)CD45的表達(dá)情況排除造血細(xì)胞习贫，根據(jù)CD13的表達(dá)情況排除NB不表達(dá)的骨髓基質(zhì)細(xì)胞(圖2A和2B)逛球。CD45- CD13-細(xì)胞共表達(dá)NCAM和GD2，這是已知的NB相關(guān)分子(圖2C)苫昌。在腫瘤人群中颤绕，測量了目標(biāo)特異性抗體發(fā)出的熒光團(tuán)信號，從而計算出每個細(xì)胞的目標(biāo)分子。轉(zhuǎn)移性NB在BM中顯示出4,262±469個GPC2分子/細(xì)胞(范圍為1,425-6,041)奥务，患者間變異很小物独，顯著低于大多數(shù)NB細(xì)胞株和PDX樣本同時評估的水平(圖2D)，接近于GPC2lo細(xì)胞株SMS-SAN的水平氯葬。還比較了GPC2與其他幾個免疫治療靶點(diǎn)的表達(dá)水平挡篓，并觀察到抗原之間的抗原密度有很大的差異。GPC2水平低于GD2帚称、NCAM和L1CAM官研，但高于間變性淋巴瘤激酶(ALK)和B7-H3。與GPC2相似闯睹，NCAM戏羽、L1CAM和B7-H3抗原密度顯示患者間差異很小，在轉(zhuǎn)移性NB中與細(xì)胞株和PDX樣本相比顯著降低(圖2D)楼吃。來自一名患者的配對診斷/復(fù)發(fā)樣本顯示始花，在復(fù)發(fā)時，除GPC2外孩锡，每個靶點(diǎn)的抗原密度都有所下降衙荐，而GPC2在復(fù)發(fā)樣本中略有增加「〈矗總之，這些數(shù)據(jù)強(qiáng)調(diào)了抗原密度在調(diào)節(jié)CAR-T細(xì)胞效力中的關(guān)鍵作用砌函，與轉(zhuǎn)移性NB相比斩披，細(xì)胞系和PDX樣本的水平不一致。

作者之前證明了CD28 TM結(jié)構(gòu)域降低了CAR - T細(xì)胞抗原密度閾值讹俊。因此垦沉，作者比較了GPC2.D3-和GPC2.19 car-T細(xì)胞與CD28 TM±a CD28共刺激的內(nèi)源性結(jié)構(gòu)域替換為原始的CD8a TM結(jié)構(gòu)(圖3A)。這些結(jié)構(gòu)變化對CAR表面表達(dá)仍劈、耗竭或T細(xì)胞分化表型沒有影響厕倍，但GPC2 -CAR結(jié)合CD28 TM結(jié)構(gòu)域，具有41BB或CD28共刺激結(jié)構(gòu)域贩疙，證實(shí)增強(qiáng)了對GPC2mod和GPC2lo靶標(biāo)的殺傷(圖3B)讹弯，同時也增加了對GPC2mod腫瘤細(xì)胞的IL-2和IFNg的產(chǎn)生。在體內(nèi)對GPC2lo?(SMS-SAN) NB轉(zhuǎn)移模型中也取得了類似的抗腫瘤作用(圖3H-3K)这溅。

為了進(jìn)一步評估共刺激內(nèi)域的影響组民，在體外壓力測試中比較了結(jié)合?CD28?和?41BB?內(nèi)域的?GPC2.19.CD28TM-CAR?的殺傷效果。對GPC2mod和GPC2lo?NB系使用1:8 E:T比悲靴，觀察到結(jié)合?CD28?共刺激內(nèi)域的?GPC2-CAR?具有出色的殺傷力（圖?3C）臭胜。雖然兩者都在體內(nèi)對具有GPC2mod抗原密度的患者來源的異種移植物（圖?2D）在具有中度或高腫瘤負(fù)荷的動物中介導(dǎo)了顯著的腫瘤消退，但含有CD28內(nèi)域的動物則更為優(yōu)越（圖?4A-4E）∷嗜總之乱陡，這些結(jié)果表明，迭代?CAR?工程可以調(diào)整抗原密度閾值仪壮，從而能夠以大約?5x103個分子/細(xì)胞有效靶向表達(dá)GPC2的細(xì)胞憨颠，遠(yuǎn)低于標(biāo)準(zhǔn)CD8a TM和41BB-CAR配置可以靶向和接近的水平。

在?GPC2.19.28TM.28z CAR T?細(xì)胞中觀察到的腫瘤消退睛驳，將目標(biāo)抗原密度閾值調(diào)整到正常水平烙心，這預(yù)示著臨床活動的良好前景，但由于CAR T細(xì)胞耗竭的發(fā)展乏沸，這種結(jié)構(gòu)與較短的持久性有關(guān)淫茵，并可能導(dǎo)致獲得性抵抗。在GPC2.19.28TM.28z CAR T細(xì)胞誘導(dǎo)CR后長期跟蹤動物蹬跃，并研究了一小部分動物的復(fù)發(fā)情況（圖?5A）匙瘪。復(fù)發(fā)性腫瘤的免疫組織化學(xué)?(IHC)?和流式細(xì)胞術(shù)顯示GPC2表達(dá)降低，伴有大量CAR T細(xì)胞浸潤（圖?5B-5D）蝶缀，而其他抗原如NCAM丹喻、L1CAM?或GD2的表達(dá)沒有改變（圖?5C、5D?）翁都。重新植入非CAR T細(xì)胞小鼠后碍论，復(fù)發(fā)腫瘤上的GPC2表達(dá)恢復(fù)到基線，表明在CAR T細(xì)胞免疫壓力介導(dǎo)的GPC2表達(dá)調(diào)節(jié)中腫瘤細(xì)胞具有高可塑性（圖?5D）柄慰。

最近發(fā)現(xiàn)c-Jun過表達(dá)（OE）增強(qiáng)了CAR T細(xì)胞對低抗原腫瘤細(xì)胞的效力和持久性鳍悠；因此，生成了雙順反子c-Jun.GPC2.19.28z-CAR結(jié)構(gòu)（cJun.GPC2）并測試其是否增強(qiáng)了抗GPC2lo?NBs的體內(nèi)抗腫瘤活性和減少復(fù)發(fā)坐搔。和c-Jun.GPC2.19.28z相比藏研，GPC2顯示出類似的細(xì)胞表面CAR表達(dá)（圖6A和6B），在不同水平抗原的殺傷能力方面優(yōu)于所有其他結(jié)構(gòu)概行。為了研究臨床相關(guān)模型中的功能蠢挡，將從腫瘤復(fù)發(fā)患者ST16治療后的BM中分離的患者源性NB細(xì)胞（ST16-BM4224）植入，并以準(zhǔn)原位方式將GFP-Luc導(dǎo)入腎包膜（圖6C）凳忙。有趣的是业踏，在體外擴(kuò)增過程中，每個細(xì)胞的GPC2分子增加了23個（原發(fā)性NB為5450個涧卵，擴(kuò)增后為10843個）堡称，并且兩種CAR結(jié)構(gòu)有效地清除了腫瘤（圖6D）。GPC2-CAR T細(xì)胞表現(xiàn)出顯著增強(qiáng)的抗腫瘤活性艺演、CAR擴(kuò)增和持久性（圖6E–6G）却紧，并且在對抗表達(dá)更低抗原水平的GPC2ultralo腫瘤（3425個分子/細(xì)胞）時也顯著優(yōu)于原始構(gòu)建物桐臊。此外，GPC2 CARs介導(dǎo)了高負(fù)荷GPC2hi-NB（圖6H-6J）原位移植動物疾病控制持續(xù)時間和CAR持續(xù)時間的延長晓殊，并且當(dāng)它們共同移植時断凶，GPC2hi和GPC2lo腫瘤（4460個分子/細(xì)胞）清除效果相同，而GPC2.19.8TM.41BBz構(gòu)建選擇性靶向GPC2hi腫瘤巫俺，但完全保留GPC2lo腫瘤（圖6K-6O）认烁。這些數(shù)據(jù)表明，c-Jun OE提高了GPC2-CAR T細(xì)胞的效力介汹，并介導(dǎo)了針對表達(dá)臨床相關(guān)GPC2抗原密度的NBs的持久抗腫瘤活性却嗡，因此成為臨床試驗(yàn)的主要候選藥物。

接下來嘹承，作者試圖評估低抗原密度調(diào)節(jié)的GPC2-CAR T細(xì)胞靶向和非腫瘤毒性的可能性窗价。據(jù)報道，使用IHC叹卷，發(fā)現(xiàn)GPC2的蛋白表達(dá)在正常成人和兒童組織中非常有限撼港。與此相一致，人類器官發(fā)育過程中GPC2基因表達(dá)的已發(fā)表數(shù)據(jù)庫顯示骤竹，表達(dá)僅限于發(fā)育中的大腦帝牡，在9周左右達(dá)到高峰，然后在出生后逐漸減少并完全缺失蒙揣，這一模式反映在小鼠發(fā)育中的組織中靶溜。質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫中的蛋白質(zhì)表達(dá)證實(shí)了這一模式，表明GPC2的表達(dá)僅限于胎兒大腦懒震，出生后僅在成人睪丸中存在墨技。通過產(chǎn)前、嬰兒和兒童腦組織的IHC染色挎狸，進(jìn)一步證實(shí)了GPC2表達(dá)與胎齡之間的負(fù)相關(guān)（圖7A），并發(fā)現(xiàn)NBs上的GPC2水平顯著高于兒童和嬰兒腦（圖7B和7C）断楷，其中H分?jǐn)?shù)始終<100锨匆。大量RNA測序（RNA-seq）數(shù)據(jù)集的分析可以掩蓋罕見細(xì)胞類型中的基因表達(dá)。因此冬筒，分析了胎兒和成人大腦的單細(xì)胞（sc）RNA序列數(shù)據(jù)集恐锣。在胎兒人腦樣本中，通過統(tǒng)一流形近似和投影（UMAP）聚類確定的14個不同細(xì)胞群中舞痰，GPC2主要在神經(jīng)元祖細(xì)胞中表達(dá)土榴，在由雙皮質(zhì)素（DCX）表達(dá)驅(qū)動的簇中表達(dá)（圖7D–7E），在小鼠發(fā)育中腦中也觀察到這種模式响牛。DCX是一種微管相關(guān)蛋白玷禽，存在于未成熟赫段、遷移的神經(jīng)元祖細(xì)胞中，隨著神經(jīng)元成熟而下調(diào)矢赁，但在成人大腦的單個細(xì)胞中仍保持低水平表達(dá)糯笙，不再伴隨GPC2表達(dá)（圖6F和6G）×靡總之给涕，這些數(shù)據(jù)證實(shí)GPC2是一種神經(jīng)發(fā)育抗原，出生后在組織中的表達(dá)不顯著额获，因此可能是CAR T細(xì)胞治療的安全靶點(diǎn)够庙。

接下來評估了GPC2的特異性。通過膜蛋白質(zhì)組陣列抄邀，測試GPC2.19-IgG1單克隆抗體對超過5300個人類膜蛋白庫的反應(yīng)性耘眨，包括94%的所有單程、多程和糖基磷脂酰肌醇（GPI）錨定蛋白撤摸。在mAB濃度高達(dá)1.25 mg/mL時毅桃，未觀察到脫靶結(jié)合。在>5mg/mL時准夷，觀察到低水平的脫靶結(jié)合到電壓門控氫通道1（HVCN1）钥飞，其主要表達(dá)在B細(xì)胞和粒細(xì)胞上。然而衫嵌，GPC2.19-IgG1僅顯示與B細(xì)胞和粒細(xì)胞的最小結(jié)合读宙，而CAR T細(xì)胞不介導(dǎo)針對這些細(xì)胞類型的細(xì)胞毒性，表明沒有生物學(xué)上顯著的交叉反應(yīng)楔绞。由于人類和小鼠GPC2在器官發(fā)育過程中的基因表達(dá)譜具有可比性结闸，使用小鼠模型來評估潛在的非靶向和靶向非腫瘤相關(guān)毒性。GPC2.19對人（KD 11.0±3）和小鼠GPC2（77.2±10.2）以及GPC2具有高結(jié)合親和力酒朵。利用先前建立的準(zhǔn)原位腎包膜異種移植模型桦锄，測試了最有效的GPC2的毒性。盡管具有強(qiáng)大的抗腫瘤作用（圖8C蔫耽、8D）结耀，但動物體重沒有減輕或出現(xiàn)臨床毒性跡象（圖8B），血細(xì)胞計數(shù)或肝功能參數(shù)也沒有顯著變化（圖8E）匙铡。在接受c-Jun图甜、GPC2-CAR T細(xì)胞治療的動物的肝（2/3）和肺（3/3）中觀察到細(xì)胞浸潤，然而鳖眼，所有組織黑毅，包括肝臟、睪丸和中樞神經(jīng)系統(tǒng)钦讳，均在正常范圍內(nèi)矿瘦。CTRL治療的動物枕面，由盲法病理學(xué)家評估（圖8F）。作者得出結(jié)論匪凡，GPC2.19.28z CAR T可以在沒有毒性證據(jù)的代表性疾病模型中有效控制腫瘤膊畴。

總之，這項(xiàng)工作強(qiáng)調(diào)了抗原密度對CAR T細(xì)胞效力的深刻影響病游，并說明了準(zhǔn)確定量臨床樣本上的抗原密度和針對抗原密度閾值的CAR T細(xì)胞迭代工程的重要作用唇跨。證明了許多可獲得的解決方案可用于根據(jù)所需抗原密度閾值調(diào)節(jié)CAR T細(xì)胞。使用嚴(yán)格的療效和毒性模型衬衬，作者已經(jīng)確定了有效的GPC2-CAR买猖，這些可以用于NB的臨床試驗(yàn)，以及標(biāo)準(zhǔn)療法不足以治療的其他多種目前致命的癌癥滋尉。最后玉控，這些數(shù)據(jù)也證明了癌胚抗原是一類非突變靶點(diǎn)，適合于以CAR T細(xì)胞為靶點(diǎn)的治療狮惜。

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教授介紹

Crystal L. Mackall博士是斯坦福大學(xué)的兒科和內(nèi)科學(xué)教授高诺。她擔(dān)任Stanford Center for Cancer Cell Therapy的創(chuàng)始主任、Stanford Cancer Institute的副主任碾篡、Cancer Immunology and Immunotherapy Program的負(fù)責(zé)人虱而。在27年的任期中，她在NCI兒科腫瘤分部擔(dān)任主任开泽，現(xiàn)在在斯坦福大學(xué)Mackall實(shí)驗(yàn)室牡拇，她領(lǐng)導(dǎo)了一個國際公認(rèn)的基礎(chǔ)和轉(zhuǎn)化研究項(xiàng)目，重點(diǎn)關(guān)注腫瘤免疫學(xué)穆律。她的工作確定了胸腺在人類T細(xì)胞再生中的重要作用惠呼，并發(fā)現(xiàn)IL-7作為T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)因子。她進(jìn)行了大量的早期和首次在人類和兒童的臨床試驗(yàn)峦耘，涵蓋了樹突狀細(xì)胞疫苗剔蹋、細(xì)胞因子和使用NK細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因T細(xì)胞的過繼免疫療法。她的團(tuán)隊(duì)已經(jīng)確定T細(xì)胞衰竭是限制CAR - T細(xì)胞活性的一個主要特征辅髓，并開發(fā)了新的方法來防止和逆轉(zhuǎn)人類T細(xì)胞衰竭泣崩。

參考文獻(xiàn)

Heitzeneder S, Bosse KR, Zhu Z, et al. GPC2-CAR T cells tuned for lowantigen density mediate potent activity against neuroblastoma without toxicity.Cancer Cell. 2021;S1535-6108(21)00658-9. doi:10.1016/j.ccell.2021.12.005