Nature Cancer | 雙重靶向CAR-T細(xì)胞增強抗腫瘤活性并防止實體瘤逃逸

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撰文：驕陽似我

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1.?本文展示了同時靶向兩種腫瘤相關(guān)抗原的CAR-T細(xì)胞，并提供反式作用CD28和4-1BB共刺激腔呜，同時共享相同的CD3ζ-鏈熬尺，可在體內(nèi)應(yīng)激條件下產(chǎn)生快速抗腫瘤作用估蹄，防止腫瘤再次激發(fā)磕蒲，并防止由于低抗原密度而導(dǎo)致的腫瘤逃逸。

2.?分子和信號學(xué)研究表明杭跪，采用CAR設(shè)計的T細(xì)胞表現(xiàn)出T細(xì)胞受體相關(guān)信號分子的持續(xù)磷酸化以及支持CAR-T細(xì)胞增殖和長期存活的分子標(biāo)記二拐。

3.?CAR-T細(xì)胞的代謝譜顯示誘導(dǎo)糖酵解，維持快速效應(yīng)T細(xì)胞功能涵但，但也保留氧化功能杈绸，這對T細(xì)胞的長期持久性至關(guān)重要。

嵌合抗原受體（CAR）-T細(xì)胞在惡性血液病中表現(xiàn)出極大的活性矮瘟。然而瞳脓，腫瘤細(xì)胞中的異質(zhì)性抗原表達(dá)和次優(yōu)的CAR-T細(xì)胞持續(xù)性仍然是實體瘤患者實現(xiàn)臨床反應(yīng)的關(guān)鍵方面。目前澈侠，一些針對實體瘤抗原的CAR正在進(jìn)行臨床研究劫侧，其主要終點是確定所選靶點的安全性。然而哨啃，同時識別至少兩種抗原的下一代CARs的最佳構(gòu)建以及適應(yīng)CARs胞漿內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域的最合適方式的定義仍然具有挑戰(zhàn)性烧栋。通過將抗原結(jié)合部分融合到一個提供共刺激和CD3ζ信號的單個CAR干細(xì)胞，產(chǎn)生了具有雙重靶向性的單CAR盒棘催。這種設(shè)計的主要缺點是難以維持具有去折疊固有特性的組裝抗原結(jié)合部分的結(jié)構(gòu)完整性劲弦。此外，盡管CD28或4-1BB內(nèi)域提供的T細(xì)胞共刺激在促進(jìn)B細(xì)胞惡性腫瘤患者的臨床緩解方面同樣有效醇坝，該領(lǐng)域普遍認(rèn)為邑跪，雙重CD28和4-1BB共刺激可通過CD28共刺激促進(jìn)腫瘤快速消退，但可能需要4-1BB來維持CAR-T細(xì)胞的長期持久性呼猪。

最佳的T細(xì)胞共刺激是在實體瘤的腫瘤微環(huán)境中對抗免疫抑制的第一個關(guān)鍵事件画畅。CAR-T細(xì)胞中的多重共刺激是通過兩個或三個共刺激內(nèi)域（第三代CARs）串聯(lián)包含或在表達(dá)CD28作為共刺激內(nèi)域的CAR-T細(xì)胞中過度表達(dá)4-1BB配體實現(xiàn)的。然而宋距，報告的臨床數(shù)據(jù)并未顯示第三代CAR-T細(xì)胞在客觀臨床反應(yīng)方面的優(yōu)勢轴踱，但表明在cis中，共刺激內(nèi)域可能無法提供促進(jìn)最佳T細(xì)胞活化和存活所需的CD28和4-1BB共刺激的空間分布谚赎。

近期淫僻，在Nature cancer雜志上發(fā)表了一篇名為“Dual-targeting CAR-T cells with optimal co-stimulation and metabolic fitness enhance antitumor activity and prevent escape in solid tumors”的文章诱篷，提出了一種基于雙靶向、分裂共刺激信號和共享CD3ζ鏈的方法雳灵，該方法專門針對神經(jīng)母細(xì)胞瘤（NB）疾病模型中的兩種臨床相關(guān)抗原GD2和B7-H3棕所，并進(jìn)一步用另一對靶點間皮素（MSLN）和硫酸軟骨素蛋白多糖4驗證了該方法（CSPG4）。文章證明所設(shè)計的策略可以實現(xiàn)快速和持續(xù)的抗腫瘤作用悯辙，這是通過優(yōu)化信號琳省、效應(yīng)分子簽名和CAR-T細(xì)胞的代謝適應(yīng)度來維持的。此外躲撰，當(dāng)腫瘤細(xì)胞中抗原表達(dá)異質(zhì)時针贬，雙抗原靶向可防止腫瘤逃逸。

本文使用NB作為腫瘤模型拢蛋，特別是兩種腫瘤細(xì)胞系（CHLA-255和LAN-1）桦他，共表達(dá)兩種靶向抗原GD2和B7-H3。當(dāng)CAR-T細(xì)胞用于應(yīng)激條件下時瓤狐，與GD2.BBζ瞬铸、B7-H3.28ζ和B7-H3.BBζCAR-T細(xì)胞相比，GD2.28ζCAR-T細(xì)胞表現(xiàn)出更好的腫瘤控制能力础锐。由于GD2.28ζCAR-T細(xì)胞顯示出最顯著的抗腫瘤活性嗓节，但在低劑量下不能完全根除腫瘤，因此本文測試了添加4-1BB共刺激是否可導(dǎo)致如前所述的腫瘤根除皆警。本文以第三代CAR（GD2.28.BBζ）的形式提供了4-1BB共刺激拦宣。還構(gòu)建了同時編碼GD2.28ζ和B7-H3.BBζCARs（GD2.28ζ/B7-H3.BBζ）的載體，以使用兩個獨立的CAR分子提供雙重特異性和雙重共刺激信姓。結(jié)果表明鸵隧，與應(yīng)激條件下的GD2.28ζCAR-T細(xì)胞相比，GD2.28.BBζ和GD2.28ζ/B7-H3.BBζCAR-T細(xì)胞沒有表現(xiàn)出優(yōu)越的抗腫瘤活性意推《固保總的來說，這些數(shù)據(jù)表明GD2.28ζCAR-T細(xì)胞在低劑量下最有效地控制腫瘤生長菊值，但不能根除腫瘤外驱。此外，以第三代CARs或雙CARs形式提供的4-1BB共刺激不會增強治療效果腻窒。圖1 |單或雙抗原靶向以及單或雙CD28或4-1BB共刺激不會在應(yīng)激條件下根除腫瘤昵宇。

假設(shè)GD2.28ζ/B7-H3.BBζCAR-T細(xì)胞可能接收到過多的CD3ζ信號，這損害了雙重靶向和雙重共刺激的有益效果儿子。因此瓦哎，本文生成了一系列編碼在單個逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中的雙CAR，以評估共享的CD3ζ鏈?zhǔn)欠褡阋詾殡p抗原靶向提供最佳激活信號，以及每個單抗原識別和雙靶形式共刺激的作用蒋譬。發(fā)現(xiàn)GD2.28ζ割岛、GD2.28ζ/B7-H3.BB和GD2.28ζ/dNGFR.BB CAR-Ts能夠像預(yù)期的那樣識別腫瘤細(xì)胞，因為它們表達(dá)功能完整的GD2.CAR羡铲。類似地蜂桶，B7-H3.BBζCAR-T細(xì)胞識別腫瘤細(xì)胞，因為它們表達(dá)完全功能的B7-H3.CAR也切，而B7-H3.BB CAR-T細(xì)胞沒有殺死腫瘤，因為CAR缺乏CD3ζ腰湾。值得注意的是雷恃，本文發(fā)現(xiàn)當(dāng)B7-H3.BB CAR-T細(xì)胞共表達(dá)dNGFR.28ζ或28ζ時，它們獲得細(xì)胞溶解活性并向B7-H3+腫瘤細(xì)胞釋放細(xì)胞因子费坊。這表明與抗原結(jié)合的不完全B7-H3.BB CAR可以使用由不直接識別抗原的另一部分提供的順式表達(dá)的CD3ζ倒槐。此外，當(dāng)B7-H3.BB CAR與GD2.28ζCAR共表達(dá)且兩個CAR同時結(jié)合其抗原時附井，與GD2.28ζCAR-T細(xì)胞相比讨越，CAR-T細(xì)胞釋放更高水平的細(xì)胞因子，表明4-1BB提供了額外的共刺激效應(yīng)永毅。在共表達(dá)GD2.28ζCAR和dNGFR.BB（阻止B7-H3結(jié)合）的T細(xì)胞中把跨，4-1BB在促進(jìn)更高細(xì)胞因子釋放方面的額外作用被取消，這表明4-1BB的共刺激作用僅在兩種CAR結(jié)合其靶抗原時介導(dǎo)沼死。圖2 |一條單一共享CD3ζ鏈足以在雙特異性CAR-T細(xì)胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)激活信號着逐。

為了評估B7-H3.BB CAR提供的4-1BB共刺激是否增強GD2.28ζCAR-T細(xì)胞的抗腫瘤活性，本文比較了體外和體內(nèi)GD2.28ζ/B7-H3.BB CAR-T細(xì)胞和GD2.28ζCAR-T細(xì)胞的功能性意蛀。發(fā)現(xiàn)所有CAR均在T細(xì)胞中表達(dá)耸别，未觀察到細(xì)胞亞群組成的改變。在與NB腫瘤細(xì)胞的重復(fù)多輪共培養(yǎng)實驗中县钥，在第四輪共培養(yǎng)中秀姐，只有GD2.28ζ/B7-H3.BB CAR-T細(xì)胞繼續(xù)清除NB細(xì)胞。此外若贮，在第三輪和第四輪共培養(yǎng)中省有，表達(dá)GD2.28ζ/B7-H3.BB的T細(xì)胞顯示出最高的T細(xì)胞計數(shù)和最高的IFN-γ和IL-2釋放。在攜帶CHLA-255的NSG小鼠中兜看，GD2.28ζ/B7-H3.BB CAR-T細(xì)胞不僅表現(xiàn)出優(yōu)越的抗腫瘤活性锥咸，可在應(yīng)激條件下消除原發(fā)腫瘤，還可在腫瘤再次激發(fā)時控制腫瘤生長细移，從而提高存活率搏予。在第14天，用GD2.28ζ/B7-H3.BB CAR-T細(xì)胞治療的小鼠顯示出循環(huán)T細(xì)胞的最高頻率弧轧，并且在第28天雪侥，它們繼續(xù)具有較高循環(huán)T細(xì)胞的趨勢碗殷。圖3 |具有分裂共刺激和共享單個CD3ζ的雙重靶向促進(jìn)持續(xù)抗腫瘤活性。

本文進(jìn)行RNA-seq分析以研究B7-H3的添加方式速缨。BB-CAR對GD2.28ζ-CAR增強了CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤活性和持久性锌妻。在沒有CAR參與的情況下，發(fā)現(xiàn)GD2.28ζ/B7-H3.BB CAR-T細(xì)胞顯示出與GD2.28ζCAR-T細(xì)胞不同的基因表達(dá)模式旬牲》麓猓基因集富集分析（GSEA）表明，糖酵解途徑和IFN-γ信號在GD2.28ζ/B7-H3.BB CAR-T細(xì)胞中升高原茅。由于糖酵解和IFN-γ途徑都被T細(xì)胞受體（TCR）信號激活吭历，使用T細(xì)胞激活基因集測試了本文的數(shù)據(jù)集。與表達(dá)GD2.28ζCAR的細(xì)胞相比擂橘，表達(dá)GD2.28ζ/B7-H3.BB的CAR-T細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組富含在T細(xì)胞激活時上調(diào)的基因晌区，而在T細(xì)胞激活時下調(diào)的基因富集在GD2.28ζCAR-T細(xì)胞中。這些數(shù)據(jù)表明GD2.28ζ/B7-H3.BB CAR-T細(xì)胞具有較高的TCR激活信號基礎(chǔ)水平通贞，這與CAR-CD3ζ鏈和下游信號激酶（如ERK和Akt）的磷酸化增強平行朗若。圖4 |分裂共刺激和共享D3ζ促進(jìn)TCR緊張信號的雙重靶向。

與單獨表達(dá)GD2.28ζCAR的T細(xì)胞相比昌罩，GD2.28ζ/B7-H3.BB CAR-T細(xì)胞的這種效應(yīng)進(jìn)一步增強哭懈。盡管在基礎(chǔ)靜息狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄組存在差異，初始CAR介導(dǎo)的刺激同樣激活了表達(dá)GD2.28ζ/B7-H3.BB CAR或GD2.28ζCAR的T細(xì)胞峡迷，作為具有任一CAR的T細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組在第1天聚集银伟。然而，在去除抗原刺激后的第5天绘搞，表達(dá)GD2.28ζ/B7-H3.BB CAR或GD2.28ζCAR的T細(xì)胞之間的基因表達(dá)出現(xiàn)差異彤避。表達(dá)GD2.28ζ/B7-H3.BB的CAR-T細(xì)胞在第5天時在與細(xì)胞周期和TCR信號相關(guān)的途徑中表現(xiàn)出富集，表明抗原去除后持續(xù)增殖夯辖。主成分分析確定第0天琉预、第1天和第5天的CAR-T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組之間的相對關(guān)系。本文的數(shù)據(jù)集轉(zhuǎn)錄組的變異主要由PC1（x軸）上捕獲的CAR激活控制蒿褂。在第0天和第5天圆米，與GD2.28ζCAR-T細(xì)胞相比，GD2.28ζ/B7-H3.BB CAR-T細(xì)胞顯示出更高的PC1分?jǐn)?shù)啄栓，這與發(fā)現(xiàn)的活躍TCR信號一致娄帖。值得注意的是，表達(dá)GD2.28ζ/B7-H3.BB的CAR-T細(xì)胞與表達(dá)GD2.28ζCAR的T細(xì)胞獲得了額外的轉(zhuǎn)錄組差異昙楚，后者在PC2（y軸）中被捕獲近速。與細(xì)胞周期相關(guān)途徑的富集一致，發(fā)現(xiàn)GD2.28ζ/B7-H3.BB CAR-T細(xì)胞的CAR交聯(lián)后第6天T細(xì)胞持續(xù)增殖，并且與GD2.28ζCAR-T細(xì)胞相比削葱，第6天的T細(xì)胞計數(shù)幾乎增加了兩倍奖亚，顯示出更好的擴(kuò)增。在代謝分析中析砸，與刺激后第0天和第5天表達(dá)GD2.28ζ/B7-H3.BB的CAR-T細(xì)胞相比昔字，表達(dá)GD2.28ζ/B7-H3.BB的CAR-T細(xì)胞顯示出更高的糖酵解活性，而在第1天首繁，當(dāng)表達(dá)GD2.28ζ/B7-H3.BB CAR或GD2.28ζCAR的T細(xì)胞的激活信號達(dá)到最大值時作郭，僅觀察到適度的差異。值得注意的是蛮瞄，在表達(dá)GD2.28ζ/B7-H3.BB的CAR-T細(xì)胞中觀察到的糖酵解增強并未破壞先前描述的由4-1BB內(nèi)域維持的前氧磷代謝曲線所坯，因為與表達(dá)GD2.28ζ的CAR-T細(xì)胞相比，這些細(xì)胞在CAR刺激前后表現(xiàn)出增加的氧消耗率挂捅。總之堂湖，轉(zhuǎn)錄分析闲先、T細(xì)胞信號和代謝表明，雙靶向无蜂、分裂共刺激信號和一個單一共享CD3ζ結(jié)構(gòu)域維持T細(xì)胞中的強直TCR信號和代謝適應(yīng)性伺糠，并將其轉(zhuǎn)化為有效和持續(xù)的抗腫瘤活性。圖5 |具有分裂共刺激和共享CD3ζ的雙重靶向促進(jìn)CAR-T細(xì)胞增殖以及糖酵解和氧化代謝斥季。

為了評估GD2.28ζ/B7-H3.BB CAR-T細(xì)胞是否因腫瘤細(xì)胞中可變抗原表達(dá)而阻止腫瘤逃逸训桶，本文利用了NB中GD2表達(dá)的異質(zhì)性水平。將表達(dá)GD2.28ζ或GD2.28ζ/B7-H3.BB的CAR-T細(xì)胞與顯示GD2異質(zhì)性表達(dá)的NB細(xì)胞系SH-SY5Y共同培養(yǎng)酣倾。GD2.28ζ/B7-H3.BB CAR-T細(xì)胞表現(xiàn)出最高的抗腫瘤作用和1型輔助性T細(xì)胞因子釋放舵揭。接下來，本文評估了GD2.28ζ/B7-H3.BB CAR-T細(xì)胞是否能夠在體內(nèi)防止腫瘤逃逸躁锡。在攜帶SH-SY5Y的NSG小鼠的低腫瘤負(fù)荷模型中午绳，表達(dá)GD2.28ζ/B7-H3.BB的CAR-T細(xì)胞完全控制腫瘤生長。在用GD2.28ζCAR-T細(xì)胞治療的小鼠中映之，與用CD19特異性CAR-T細(xì)胞治療的對照小鼠相比拦焚，生長中的腫瘤顯示暗淡的GD2表達(dá)。相反杠输，B7-H3在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)保持不變赎败，因為該抗原在注入GD2.28ζCAR-T細(xì)胞的小鼠中沒有靶向性。這些數(shù)據(jù)表明蠢甲，當(dāng)腫瘤含有靶向抗原弱表達(dá)的細(xì)胞時僵刮，表達(dá)具有分裂共刺激信號和單個CD3ζ結(jié)構(gòu)域的雙靶向CARs的T細(xì)胞具有優(yōu)越的抗腫瘤活性，這可能導(dǎo)致腫瘤逃避單靶向CAR-T細(xì)胞治療。圖6 |雙靶向妓笙、分裂信號和一個單一CD3ζ內(nèi)域可防止因抗原丟失而導(dǎo)致的腫瘤逃逸若河。

由于抗原表達(dá)的異質(zhì)性，防止腫瘤逃逸并提供最佳的T細(xì)胞共刺激仍然是實體瘤中CAR-T細(xì)胞實現(xiàn)臨床反應(yīng)的關(guān)鍵方面寞宫。本文通過獨立激活CD28和4-1BB通路并調(diào)節(jié)CD3ζ鏈介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)萧福，生成了同時針對兩種抗原并提供最佳共刺激和T細(xì)胞代謝適應(yīng)度的CAR-T細(xì)胞。

教授介紹：

Gianpietro Dotti, MD

Gianpietro Dotti是North Carolina大學(xué)教堂山分校醫(yī)學(xué)教授辈赋，主要研究免疫治療策略鲫忍，以治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者，包括淋巴瘤和白血病钥屈，以及神經(jīng)母細(xì)胞瘤等實體瘤悟民。特別是，他在貝勒醫(yī)學(xué)院開發(fā)了CD19特異性嵌合抗原受體的程序篷就，并克隆了一種針對人類免疫球蛋白輕鏈的新型嵌合抗原受體射亏。這種植入人類T淋巴細(xì)胞的嵌合分子允許選擇性地清除表達(dá)人類免疫球蛋白kappa輕鏈的腫瘤細(xì)胞，同時保留表達(dá)lambda輕鏈的B淋巴細(xì)胞的正常間隔竭业。

Dotti博士還參與開發(fā)基于CAR的策略智润，以針對實體腫瘤，如兒童患者的神經(jīng)母細(xì)胞瘤和成人患者的三陰性乳腺癌未辆。

在與Brenner博士的合作下窟绷，他還開發(fā)了一種基于人caspase-9的新型T細(xì)胞安全開關(guān)的臨床階段。Dotti博士研究的一個重要重點是開發(fā)旨在克服腫瘤微環(huán)境免疫抑制機(jī)制的T細(xì)胞工程策略咐柜。

參考文獻(xiàn)：

Koichi Hirabayashi兼蜈，Hongwei Du，Gianpietro Dotti et al. Dual-targeting CAR-T cells withoptimal co-stimulation and metabolic fitness enhance antitumor activity andprevent escape in solid tumors.[J] Nature Cancer | VOL 2 | September 2021 | 904–918 | www.nature.com/natcancer