單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組測序（Single Nuclei RNA Sequencing，snRNA-seq）：通過提取樣本單細(xì)胞核，然后分離、標(biāo)記細(xì)胞核牛曹，在單細(xì)胞水平研究核基因表達(dá)檢測的技術(shù)。為腦組織醇滥、心臟黎比、腎臟等復(fù)雜組織或一些珍稀凍存樣品提供了單細(xì)胞水平研究應(yīng)用平臺，可挖掘更多潛在的致病細(xì)胞類型鸳玩，更易于探討腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性和致病機理阅虫。
單細(xì)胞核測序（snRNA-seq）的優(yōu)點
- 細(xì)胞核的獲得比細(xì)胞懸液的獲得簡單
單細(xì)胞懸液制備過程往往是造成實驗可變性的主要因素。如何獲得足質(zhì)足量的單細(xì)胞懸液不跟？這是實驗面臨的第一個難題颓帝，特別是那些稀有細(xì)胞或難以解離的細(xì)胞；細(xì)胞核膜相比細(xì)胞膜更為堅固窝革，因此购城，凍存組織細(xì)胞膜破裂后細(xì)胞核則能夠保持完整，由于僅涉及機械破碎和簡單的純化虐译，snRNA-seq操作步驟相對簡化瘪板，便于開展實驗，其穩(wěn)定性相比scRNA-seq大大提高漆诽。
- 適用的樣本類型擴大
單細(xì)胞核測序snRNA-seq由于是抽提細(xì)胞核進(jìn)行測序侮攀，所以可以應(yīng)用于凍存的樣本，極大的利用了那些生理病理數(shù)據(jù)清晰的凍存樣本厢拭；對于那些新鮮樣本解離成功率低的樣本兰英；或者是樣本的收集難度大，收集周期長供鸠，比如一個樣本不同階段的評估畦贸，或者根據(jù)治療結(jié)果決定前端樣本是否入組等情況；亦或是細(xì)胞體積大回季，形狀不規(guī)則的樣本都可以用snRNA-seq來解決家制。
- 降低人為引入的轉(zhuǎn)錄偏差
因為組織可以直接從凍存狀態(tài)開始抽核，此狀態(tài)下細(xì)胞轉(zhuǎn)錄活動已經(jīng)被抑制并固定泡一，因此不會再發(fā)生轉(zhuǎn)錄狀態(tài)改變，結(jié)果真實性提高觅廓。
- 能夠鑒定到的細(xì)胞類型更為全面和完整
直接對細(xì)胞進(jìn)行機械法或者化學(xué)法破碎鼻忠，不會引入解離偏好性，理論上來講所有細(xì)胞類型都能得到回收，能夠獲得更加完整和全面的細(xì)胞圖譜帖蔓。
單細(xì)胞核測序（snRNA-seq）的缺點
- snRNA-seq會有檢測到的基因偏少的風(fēng)險
雖然有一些比較單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）和單細(xì)胞核（snRNA-seq）測序的研究表明矮瘟，轉(zhuǎn)錄本在整個細(xì)胞和細(xì)胞核中的表達(dá)程度相當(dāng)；理論上來講塑娇，缺失了細(xì)胞質(zhì)中的RNA分子澈侠，snRNA-seq在鑒定細(xì)胞轉(zhuǎn)錄狀態(tài)中可能不如scRNA-seq，同時由于細(xì)胞核中帶有polyA尾的成熟mRNA比例更低埋酬，因此對于某些樣本而言哨啃，采用snRNA-seq每個細(xì)胞核中檢測到的基因可能會有偏少的風(fēng)險，不利于細(xì)胞亞型的鑒定写妥。
- snRNA-seq對免疫細(xì)胞類型的獲得不友好
雖然snRNA-seq能夠獲得更加全面完整的細(xì)胞類型拳球，但是對于某些細(xì)胞類型的獲得比例不如scRNA-seq，主要表現(xiàn)為免疫細(xì)胞珍特。
Slyper, M., Porter, C.B.M., Ashenberg, O. et al. A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nat Med 26, 792–802 (2020). https://doi.org/10.1038/s41591-020-0844-1
以上這篇文章對8個腫瘤類型祝峻，同時進(jìn)行scRNA-seq和snRNA-seq，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：scRNA-seq數(shù)據(jù)中神經(jīng)嵴扎筒、神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞大幅度減少莱找、實質(zhì)細(xì)胞大幅度減少；snRNA-seq數(shù)據(jù)中T細(xì)胞大幅度減少嗜桌、B細(xì)胞和NK細(xì)胞消失奥溺、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞增加症脂。
https://zhuanlan.zhihu.com/p/394585391
單細(xì)胞核核轉(zhuǎn)錄組的基因組比對
這里主要講一下核mRNA和細(xì)胞mRNA的區(qū)別：在細(xì)胞和里面主要有大量的pre-mRNA谚赎，這部分有內(nèi)含子信息。一般的數(shù)據(jù)經(jīng)驗是PBMC內(nèi)含子比對上的約為20%诱篷，核轉(zhuǎn)錄組45%壶唤。
要理解這個過程，需要了解意向mRNA的形成和核運輸?shù)幕緳C制棕所。同時要知道被我們捕獲的PolyA是什么時候加到3‘端的闸盔。這里推薦閱讀《基因X》。
琳省。
然后我們看看文章里面是如何做的：
- 更改GTF迎吵。把注釋部分的內(nèi)含子改為對應(yīng)的轉(zhuǎn)錄本
- 在比對時候，比對到內(nèi)含子上针贬。
考慮到核mRNA的差異击费，在下游分析的時候還是有一些需要注意的地方的。
Habib, N., Avraham-Davidi, I., Basu, A. et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nat Methods 14, 955–958 (2017). https://doi.org/10.1038/nmeth.4407
雖然單細(xì)胞核的平均表達(dá)譜與單個細(xì)胞的平均表達(dá)譜高度相關(guān)(Pearson r=0.87)桦他，但在細(xì)胞核(如lncRNAs Malat1和Meg3)或細(xì)胞(線粒體基因Mt-nd1蔫巩、Mt-nd2、Mt-nd4、Mt-nd4)中表達(dá)顯著較高的基因(如lncRNAs Malat1和Meg3)或細(xì)胞(線粒體基因Mt-nd1圆仔、Mt-nd2垃瞧、Mt-nd4、Mt-cytb)與已知的核與非核的明顯富集相一致坪郭。
單細(xì)胞核測序能不能測到 線粒體基因个从？ 讓我們看一個實例：
Al-Dalahmah, O., Sosunov, A.A., Shaik, A. et al. Single-nucleus RNA-seq identifies Huntington disease astrocyte states. acta neuropathol commun 8, 19 (2020). https://doi.org/10.1186/s40478-020-0880-6
Nuclei with percent exonic reads from all reads in the range of 25–75% were included. Nuclei with percent mitochondrial reads aligning to mitochondria genes of more than 14% were excluded. Genes were filtered by keeping features with >?10 counts per row in at least in 31 cells.
