這篇文章于2023年6月發(fā)表于The?Journal?of?Clinical?Investigation（IF=15.9澳泵，Monocyte-derived macrophages orchestrate multiple cell-type interactions to repair necrotic liver lesions in disease models）哄孤，主要探究了參與肝損傷修復(fù)的細(xì)胞及其具體機(jī)制购对，作者尋找新功能相關(guān)細(xì)胞群體的推導(dǎo)和驗(yàn)證過程值得學(xué)習(xí)借鑒。

研究意義：肝臟具有極強(qiáng)的自我再生能力篮幢。肝臟部分切除和其它急性肝損傷模型常用于肝臟再生的相關(guān)研究丈积，由于后者能誘發(fā)人類肝臟疾补碛啤（病毒性肝炎、酒精性肝病捌木、非酒精性脂肪肝油坝、自體免疫肝病和藥物引起的肝損傷等）進(jìn)展過程里常見的組織壞死，因此是更加理想的研究模型刨裆。雖然多種肝臟疾病會(huì)誘發(fā)組織壞死澈圈，但壞死組織消融和修復(fù)的機(jī)制未知。

炎癥會(huì)使肝損傷惡化帆啃，同時(shí)又促進(jìn)肝損傷修復(fù)和纖維化消融极舔。本文作者用注射T細(xì)胞絲裂原concanavalin A (ConA) 探究肝損傷修復(fù)過程免疫細(xì)胞消融和修復(fù)壞死組織的機(jī)制。已知注射ConA后链瓦，肝臟會(huì)出現(xiàn)大量組織壞死拆魏，且壞死組織在數(shù)天內(nèi)消融修復(fù)盯桦，但其機(jī)制未知。作者的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示渤刃，單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞（MoMFs）是包裹壞死組織的主要細(xì)胞拥峦。正常肝組織主要含駐留的巨噬細(xì)胞Kupffer細(xì)胞，只有少量MoMFs卖子。但肝損傷發(fā)生后略号，大量MoMFs通過CCL-2-CCR2受配體對浸潤到肝臟。已知Kupffer細(xì)胞和MoMFs在加重局部炎癥的同時(shí)洋闽，亦促進(jìn)組織修復(fù)玄柠。之前的研究主要集中在浸潤MoMFs免疫和吞噬功能改變，對其促進(jìn)壞死組織消融和修復(fù)的研究較少诫舅。

研究策略：?作者以“肝損傷誘發(fā)的肝組織壞死消融和修復(fù)機(jī)制”為科學(xué)問題羽利，利用多個(gè)轉(zhuǎn)基因小鼠和腺病毒介導(dǎo)的組織特異性基因敲除，以及免疫組化刊懈、免疫熒光等實(shí)驗(yàn)技術(shù)系統(tǒng)性地探討了參與肝損傷組織修復(fù)的細(xì)胞組分和來源这弧，以及各組分細(xì)胞促進(jìn)組織修復(fù)的機(jī)制，最后再結(jié)合其它肝損傷模型驗(yàn)證自己理論模型的普適性虚汛。

研究方法：

1匾浪、MoMFs are aggregated and encapsulate the necrotic lesions following immune-mediated liver injury.

用ConA誘導(dǎo)小鼠發(fā)生肝組織壞死發(fā)現(xiàn)，壞死組織修復(fù)過程中會(huì)出現(xiàn)一群包裹壞死組織的CD45+免疫細(xì)胞卷哩，可將壞死組織和正常組織分割開來（圖1A）蛋辈。分析包裹細(xì)胞成分顯示，MoMFs（IBA1+CLEC4F–：IBA1為巨噬細(xì)胞marker将谊，CLEC4F為Kupffer細(xì)胞marker）從24h開始出現(xiàn)并逐漸增加冷溶，使用GFP+骨髓細(xì)胞進(jìn)行移植實(shí)驗(yàn)顯示，包裹壞死組織的細(xì)胞是骨髓來源的MoMFs（圖1B-C）瓢娜」衣澹活化肝星狀細(xì)胞（aHSCs，Desmin+α-SMA+）和中性粒細(xì)胞（MPO+）主要出現(xiàn)在后期（72-96h眠砾，圖1B）虏劲。Kupffer細(xì)胞主要位于未損傷組織，表明它們在肝損傷時(shí)被破壞褒颈，而且正常組織的Kupffer細(xì)胞不會(huì)遷移到壞死組織（圖1B）柒巫。Kupffer細(xì)胞通過分泌促炎因子誘發(fā)ConA引起的肝損傷，檢測發(fā)現(xiàn)谷丸，Kupffer活化和吞噬功能相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)在ConA注射6h后增加堡掏，隨后不再發(fā)生顯著改變（圖1D）。用Ccr2-/-刨疼、Cx3cr1-/-和Ccl2Hep-/-小鼠探究肝損傷募集MoMFs機(jī)制結(jié)果顯示泉唁，包裹壞死組織的肝細(xì)胞通過分泌CCL2募集MoMFs鹅龄，敲除Ccr2能顯著抑制MoMFs向壞死組織浸潤，但對Kupffer細(xì)胞沒有顯著影響（圖1E-G）亭畜。因此扮休，骨髓來源的MoMFs在肝損傷后被募集到壞死組織并將其包裹。

圖1

2拴鸵、MoMFs trigger the formation of a cell death–resistant SOX9+hepatocyte layer encapsulating the necrotic areas via the JAG1/NOTCH2 pathway at early time points.

SOX9是肝祖細(xì)胞（LPCs）和膽管上皮細(xì)胞的特異性marker玷坠，激活NOTCH信號(hào)通路可以調(diào)控其表達(dá)，從而調(diào)控成肝細(xì)胞向膽管細(xì)胞（BDCs）分化劲藐。結(jié)果顯示八堡，正常肝臟僅BDCs表達(dá)SOX9，但肝損傷組織的BDCs和包裹壞死組織的細(xì)胞在損傷后48-72h均表達(dá)SOX9（圖2A-B聘芜，原文將SOX9和肝細(xì)胞兄渺、LPCs以及BDCs的特異性marker進(jìn)行了共染，僅肝細(xì)胞和BDCs與SOX9存在共定位）厉膀。由于MoMFs和SOX9+肝細(xì)胞共定位溶耘，作者在注射ConA 8h后清除小鼠巨噬細(xì)胞二拐，結(jié)果顯示服鹅，SOX9+肝細(xì)胞顯著減少（圖2B-C）。此外百新，敲除CCR2同樣使SOX9+肝細(xì)胞顯著減少企软，但敲除CX3CR1對其沒有影響（圖2D）。接著饭望，作者對SOX9表達(dá)調(diào)控機(jī)制進(jìn)行探究仗哨。分選MoMFs并對能誘導(dǎo)SOX9表達(dá)的因子進(jìn)行檢測，NOTCH信號(hào)通路的配體JAG1在ConA處理后顯著增加铅辞，且NOTCH信號(hào)通路其它靶基因表達(dá)顯著增加（圖2E）厌漂。JAG1高表達(dá)在壞死包裹區(qū)免疫細(xì)胞和ConA處理小鼠SOX9+肝細(xì)胞周圍，在沒有損傷肝臟組織里的表達(dá)極弱（圖2F）斟珊。用RFP標(biāo)記小鼠CCR2并注射ConA苇倡，結(jié)果顯示，RFP與CCR2有顯著共表達(dá)囤踩，且注射ConA后共表達(dá)細(xì)胞比例增加（圖2G）旨椒。隨后，作者用JAG1受體敲除小鼠進(jìn)行驗(yàn)證堵漱，敲除小鼠JAG1受體顯著降低SOX9+肝細(xì)胞數(shù)量（圖2H）综慎。因此，MoMFs通過JAG1/NOTCH信號(hào)通路誘導(dǎo)SOX9+肝細(xì)胞生成并包裹壞死區(qū)勤庐。

圖2

3示惊、SOX9+hepatocytes are derived from mature hepatocytes and limit liver injury by activating survival signaling without contributing to hepatocyte proliferation.

接著作者用Sox9 CreERTRosa26-EYFP報(bào)告小鼠對SOX9+肝細(xì)胞來源進(jìn)行追溯（該示蹤小鼠能讓70%的CK19+表達(dá)EYFP好港，CK19+主要表達(dá)在BDCs、LPCs以及部分門靜脈周圍肝細(xì)胞）米罚。注射ConA產(chǎn)生的SOX9+肝細(xì)胞不表達(dá)EYFP蛋白（圖3A）媚狰。作者接著用 AAV-TBG-Cre+Rosa-EYFP報(bào)告小鼠進(jìn)行追溯（標(biāo)記肝細(xì)胞）。注射ConA產(chǎn)生的SOX9+肝細(xì)胞表達(dá)EYFP蛋白（圖3B）阔拳。雖然有報(bào)道指出門靜脈周圍SOX9+肝細(xì)胞有更強(qiáng)的再生能力崭孤，但注射ConA產(chǎn)生的SOX9+肝細(xì)胞沒有增殖能力（圖3C）。相反糊肠，未損傷肝組織存在大量增殖活躍的肝細(xì)胞辨宠，表明SOX9-而非SOX9+肝細(xì)胞是替代壞死組織的主要肝細(xì)胞來源（圖3C）。接著作者探究了SOX9對壞死組織的影響货裹。利用AAV8-TBG-Cre特異性敲除肝細(xì)胞的SOX9并注射ConA發(fā)現(xiàn)嗤形，敲除SOX9顯著擴(kuò)大壞死區(qū)，肝細(xì)胞增殖顯著減少弧圆，血液ALT水平和小鼠死亡率顯著升高（圖3D-F）赋兵。SOX9如何影響肝細(xì)胞存活呢？作者檢測了STAT3磷酸化和BCL-xL兩個(gè)抗凋亡蛋白表達(dá)搔预。包裹壞死區(qū)的SOX9+肝細(xì)胞表達(dá)pSTAT3和BCL-xL霹期，敲除SOX9或者其上游NOTCH2則阻滯其表達(dá)（圖3G-H）。因此拯田，SOX9+肝細(xì)胞來源于成熟肝細(xì)胞历造，它高表達(dá)抗凋亡蛋白因而具有很強(qiáng)的抗凋亡能力，從而抑制肝臟組織壞死船庇。

圖3

4吭产、aHSCs encapsulate the necrotic areas with strong cell contraction?signal activation during the resolution phase to promote necrotic? area?resolution?which?is?induced?by?MoMFs.

aHSCs和MoMFs是包裹壞死區(qū)的主要細(xì)胞，desmin+HSC表達(dá)高水平的α-SMA和BrdU鸭轮，表明肝損傷后HSCs開始增殖且活化（圖4A）臣淤。此外，aHSCs（α-SMA+desmin+）高表達(dá)與收縮功能相關(guān)的活化YAP以及pMLC（圖4B）窃爷。通過激活pMLC引起HSCs收縮的ECE1蛋白在包裹區(qū)表達(dá)顯著增加邑蒋，且壞死后期與MoMFs存在顯著共定位（圖4C）。那么aHSC的產(chǎn)生是否與MoMFs有關(guān)吞鸭？敲除小鼠的CCR2使α-SMA+HSCs（aHSCs）顯著減少寺董，但敲除CX3CR1則沒有影響（圖4D）。用clodronate去除MoMF顯著抑制壞死組織修復(fù)（圖4E-F）刻剥。因此遮咖，MoMFs和aHSCs組成的包裹結(jié)構(gòu)對肝損傷修復(fù)非常重要，且MoMFs對aHSCs產(chǎn)生至關(guān)重要造虏。

圖4

5御吞、Identification of 2 clusters of necrosis-associated MoMF populations?by scRNA-Seq, including C1q+?MoMFs and Pdgfb+?MoMFs, and?hypoxia-driven C1q+?MoMFs facilitate?dead cell removal and promote liver lesion repair.

用單細(xì)胞測序?qū)Π鼔乃绤^(qū)的MoMFs亞群進(jìn)行分析麦箍，結(jié)果顯示有兩群MoMFs細(xì)胞在處理后顯著增加（C1q+MoMFs和Pdgfb+MoMFs，圖5A）陶珠。C1q的主要功能是清除死細(xì)胞挟裂，Pdgfb的主要功能是促進(jìn)HSCs生長和活化。作者對這兩群細(xì)胞的功能進(jìn)行了驗(yàn)證揍诽。因?yàn)?i>C1q+MoMFs細(xì)胞表達(dá)C1q和Ctsb這些補(bǔ)體和蛋白酶诀蓉，作者構(gòu)建了C1q-/-小鼠/用Ctsb抑制劑處理小鼠。敲除Clq/抑制Ctsb顯著抑制壞死組織的修復(fù)（圖5B）暑脆。壞死區(qū)通常處于缺氧狀態(tài)渠啤，作者探究了缺氧與C1q+MoMFs形成的關(guān)系。結(jié)果顯示添吗，MoMFs和壞死區(qū)的其它細(xì)胞均處于缺氧狀態(tài)沥曹，MoMFs的HIF1α（低氧激活的轉(zhuǎn)錄因子）顯著活化，但未損傷區(qū)Kupffer細(xì)胞的HIF1α卻未被激活（圖5C）碟联。構(gòu)建髓系細(xì)胞特異性敲除HIF1a（Hif1amye-/-）的小鼠并注射ConA發(fā)現(xiàn)妓美，除了其經(jīng)典下游CTSB和ECE1表達(dá)顯著減少外，C1q鲤孵、LGMN和MAFB（C1q上游分子）表達(dá)均顯著下調(diào)（圖5D）壶栋。用死肝細(xì)胞和/或HIF激動(dòng)劑處理巨噬細(xì)胞，上述兩個(gè)細(xì)胞亞群的大部分特征基因表達(dá)顯著上調(diào)（圖5E）裤纹。此外委刘，HIF1a敲除的MoMFs吞噬能力顯著下降丧没，且髓系細(xì)胞特異性敲除HIF1a小鼠其肝壞死組織的修復(fù)顯著減慢（圖5F-G）鹰椒。因此，作者驗(yàn)證出C1q+MoMFs和Pdgfb+MoMFs兩個(gè)MoMFs亞群細(xì)胞參與肝壞死組織的修復(fù)呕童，C1q+MoMFs的出現(xiàn)與組織缺氧有關(guān)漆际，可以促進(jìn)死細(xì)胞清除和組織修復(fù)。

圖5

6夺饲、PDGFB derived from MoMFs in necrotic area promotes HSC?activation and contraction, thereby accelerating liver lesion resolution.

接下來奸汇，作者對Pdgfb+MoMFs的功能進(jìn)行了探討。Pdgfb+MoMFs表達(dá)高水平的PDGFB往声，而PDGF可以通過PDGFR激活HSCs擂找。作者構(gòu)建了特異性敲除髓系細(xì)胞PDGFB（Pdgfbmye-/-）以及HSC的PDGFRA（PdgfraHSC-/-）小鼠。敲除小鼠包裹壞死組織的結(jié)構(gòu)中與MoMFs共定位的aHSCs顯著減少浩销，Desmin+BrdU+的HSCs顯著減少（圖6A-B）贯涎。Pdgfbmye-/-和PdgfraHSC-/-小鼠注射ConA后，壞死區(qū)面積顯著增加（圖6C）慢洋。此外塘雳，Hif1amye-/-小鼠的PDGFb表達(dá)減少陆盘，表明低氧調(diào)控PDGFb表達(dá)（圖6D）。因此败明，Pdgfb+MoMFs可以激活HSCs隘马，從而促進(jìn)組織修復(fù)。

圖6

7妻顶、Aggregation of IBA1+MoMFs, SOX9+hepatocytes, and α-SMA+HSCs surrounding necrotic lesions is also detected in other liver-injury models.

為了證明“IBA+MoMF酸员、SOX9+肝細(xì)胞和aHSCs相互作用促進(jìn)肝損傷修復(fù)”的普適性，作者用肺炎克雷伯菌感染讳嘱、缺血/再灌注以及具有肝臟毒性的藥物（CCl4和APAP）構(gòu)建了肝損傷模型沸呐。肺炎克雷伯菌感染和缺血/再灌注誘發(fā)的肝損傷能觀察到明顯的IBA+MoMF、SOX9+肝細(xì)胞和aHSCs在壞死組織包裹區(qū)聚集呢燥，但CCl4和APAP卻沒有這個(gè)現(xiàn)象崭添，作者推測是因?yàn)檫@類藥物主要靶向肝細(xì)胞，因而有不同的修復(fù)機(jī)制叛氨。因此呼渣，“IBA+MoMF、SOX9+肝細(xì)胞和aHSCs促進(jìn)肝損傷修復(fù)”這一機(jī)制具有普適性寞埠。

圖7

Take-home message：

本文緊扣“肝損傷組織的快速消融和修復(fù)機(jī)制”屁置，構(gòu)建了大量敲除和示蹤轉(zhuǎn)基因小鼠，結(jié)合大量的免疫組化/免疫熒光等染色技術(shù)仁连，在體內(nèi)水平全面而確鑿的為自己的觀點(diǎn)提供了論據(jù)蓝角。從其模型動(dòng)物的使用，以及對肝損傷修復(fù)過程參與細(xì)胞的推理可以看出饭冬，該課題組在此方向深耕多年（詳情見Bin?Gao老師簡歷頁https://irp.nih.gov/pi/bin-gao）使鹅。雖然實(shí)驗(yàn)技術(shù)的使用略顯單調(diào)且很常見，但“好的科學(xué)問題+可信度高的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?“言簡意賅”的實(shí)驗(yàn)技術(shù)驗(yàn)證“所得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果卻是最直接昌抠、可信度最高的患朱。當(dāng)然，能被選為JCI雜志的封面文章炊苫，充分體現(xiàn)了其發(fā)現(xiàn)的新穎性裁厅，以及對肝損傷修復(fù)相關(guān)研究的重大意義。