文獻(xiàn)

2019

Genome Biology

Cold stress induces enhanced chromatin accessibility and bivalent histone modifications H3K4me3 and H3K27me3 of active genes in potato

研究背景

真核生物的染色質(zhì)開(kāi)放區(qū)域富含順式作用元件（CRE），這些開(kāi)放的染色質(zhì)對(duì)各種核酸酶（包括DNaseI和Tn5）的切割表現(xiàn)出明顯的敏感性喝噪，而與核小體緊密結(jié)合的染色質(zhì)對(duì)這些核酸酶的敏感性大大降低。這些基因組區(qū)域被稱為DNaseI敏感位點(diǎn)(DHSs)，可以通過(guò)DNase-seq或ATAC-seq進(jìn)行鑒定。DHS中明顯富含CRE景醇，包括啟動(dòng)子和增強(qiáng)子伶棒。?

組蛋白修飾在基因響應(yīng)環(huán)境和發(fā)育信號(hào)的表觀遺傳調(diào)控中起著重要作用。同一核小體上同時(shí)含有激活型和抑制型組蛋白修飾被稱為二價(jià)結(jié)構(gòu)域莽囤。H3K4me3和H3K27me3標(biāo)記的二價(jià)結(jié)構(gòu)域首次在小鼠胚胎干細(xì)胞（ESCs）中被發(fā)現(xiàn)。在哺乳動(dòng)物中切距，H3K4me3-H3K27me3二價(jià)結(jié)構(gòu)域主要與ESCs中譜系特異性基因的啟動(dòng)子重疊朽缎，這些基因的表達(dá)水平較低，以維持ESCs的多能性。二價(jià)結(jié)構(gòu)域中的H3K4me3標(biāo)記被認(rèn)為是平衡基因的激活话肖，而H3K27me3則保持它們的抑制北秽。?

馬鈴薯是最重要的非谷物糧食作物。馬鈴薯塊莖必須儲(chǔ)存在低溫下最筒，以防止發(fā)芽贺氓，減少損失。但是冷藏會(huì)引發(fā)還原糖的積累床蜘，這被稱為冷致甜味(CIS)辙培，CIS是馬鈴薯產(chǎn)業(yè)面臨的最緊迫最持久的挑戰(zhàn)。了解馬鈴薯在冷藏過(guò)程中的基因表達(dá)和調(diào)控十分重要邢锯！

結(jié)論1 DHSs的鑒定及注釋

Fig S3

對(duì)三種材料進(jìn)行Dnase-seq測(cè)序扬蕊，分別為室溫下儲(chǔ)存的塊莖（稱為RT），4℃下儲(chǔ)存的塊莖（cold tubers）和葉片（leaves）丹擎，每種材料兩個(gè)生物學(xué)重復(fù)尾抑。測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)到參考基因組DM v4.04，使用Popera軟件鑒定DHSs.只有在兩個(gè)生物重復(fù)中獨(dú)立鑒定的一致DHSs才保留用于下游分析蒂培。DHSs的密度與基因密度正相關(guān)再愈，與轉(zhuǎn)座子密度負(fù)相關(guān)（Fig S3）。

Fig 1

通過(guò)Fig 1的注釋可以看到护戳，來(lái)自RT的大約20.4%的DHSs被定位在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1kb內(nèi)翎冲。大部分DHSs (42.5%)位于基因間區(qū)（定義為距離任何TSS或轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)至少1kb）。葉片和RT的DHSs分布類似媳荒，冷塊莖和RT以及葉片的DHSs分布存在明顯不同府适。

結(jié)論2 基因區(qū)DHSs與基因表達(dá)的關(guān)系

Fig S4

超過(guò)一半的低溫塊莖DHSs是低溫條件下特有的，并且38.5%的低溫塊莖DHSs位于基因的外顯子和內(nèi)含子上（Fig S4）肺樟。相比之下檐春，42.4%的DHSs是RT特有的，但只有14.5%位于基因的內(nèi)含子和外顯子么伯。

Fig 2

在7314個(gè)外顯子或內(nèi)含子中含有冷塊莖特異性DHSs的基因中疟暖，超過(guò)69%的基因在冷塊莖中存在差異表達(dá)和普遍上調(diào)，在RT中發(fā)現(xiàn)了類似的規(guī)律田柔。

作者發(fā)現(xiàn)俐巴，與RT相比，冷處理塊莖中共有7096個(gè)基因上調(diào)硬爆，6622個(gè)基因下調(diào)欣舵。與下調(diào)基因相比，上調(diào)基因更頻繁地與位于外顯子和內(nèi)含子上的溫度特異性DHSs相關(guān)（z檢驗(yàn)缀磕，p<0.0002缘圈，F(xiàn)ig 2a）

相比之下劣光，上調(diào)和下調(diào)基因與位于啟動(dòng)子（TSS上游1kb）和基因間區(qū)域的溫度特異性DHSs的關(guān)聯(lián)頻率相似（Fig 2a），這些結(jié)果表明糟把，溫度誘導(dǎo)的DHSs在基因區(qū)域的變化通常與基因表達(dá)的變化有關(guān)绢涡。

定義：RT與葉片之間的差異表達(dá)基因?yàn)榻M織特異性基因，RT與冷處理塊莖之間的差異表達(dá)基因?yàn)闇囟忍禺愋曰颉?/p>

通過(guò)Fig 2b可以看出位于基因區(qū)域的DHSs與溫度特異性的DEG更相關(guān)遣疯，而位于非基因區(qū)域的DHSs與組織特異性DEG更相關(guān)雄可。

進(jìn)一步，作者選取的一組與碳水化合物合成相關(guān)的基因缠犀，這些基因在RT和冷處理塊莖中存在差異表達(dá)数苫，并且碳水化合物代謝途徑是冷脅迫下反應(yīng)之一。因此辨液，這些與碳水化合物相關(guān)的基因可以代表那些對(duì)冷應(yīng)激作出反應(yīng)的基因虐急。同樣，作者從光合途徑中選擇了52個(gè)DEG來(lái)代表組織特異性基因室梅。然后，我們將光合作用基因中的DHS模式與碳水化合物相關(guān)基因中的DHS模式進(jìn)行了比較（Fig 3c）疚宇。結(jié)果表明亡鼠，17%和6%的光合基因外顯子和內(nèi)含子中分別含有組織特異性DHSs。相比之下敷待，37%和36%的碳水化合物相關(guān)基因在外顯子和內(nèi)含子中分別含有溫度特異性DHSs间涵，顯著高于光合基因（z檢驗(yàn)，p<0.0002）榜揖。此外勾哩，與碳水化合物相關(guān)基因相比，位于TSS和TTS上下游1kb的組織特異性DHSs與光合基因的關(guān)聯(lián)比例更高（z檢驗(yàn)举哟，p<0.0002)思劳。

結(jié)論3 冷處理特異性DHS的基序分析

Fig 3

作者檢測(cè)了位于啟動(dòng)子區(qū)域的前1000個(gè)冷特異性DHSs（根據(jù)讀取密度排序選擇）中富集的DNA基序，并將其與已發(fā)表的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合基序進(jìn)行了比較妨猩。Dof 轉(zhuǎn)錄因子家族靶向基序在14.4%的DHSs中富集程度最高（e value=3.0e?76）潜叛，Dof家族已經(jīng)被證實(shí)在多種脅迫（如冷、熱壶硅、干旱）的響應(yīng)中發(fā)揮重要作用威兜。

GATA家族的結(jié)合motif在外顯子區(qū)域的冷處理特異性DHSs中顯著富集。植物種特有的GATA轉(zhuǎn)錄因子庐椒，如ZML1和ZML2椒舵，可以響應(yīng)多種環(huán)境脅迫，如冷约谈、凍笔宿、傷口等犁钟。因此馬鈴薯種GATA的同源基因可能對(duì)冷脅迫起調(diào)控作用。

在內(nèi)含子的冷處理特異性DHSs種顯著富集到一個(gè)單核苷酸G的motif措伐，該motif與MYB55的結(jié)合基序類似特纤。

結(jié)論4 Dnase I 敏感性的升高與冷處理塊莖種基因表達(dá)的關(guān)系

Fig S6

在三種材料中將基因按照表達(dá)量分成四份，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的基因具有更高的Dnase I敏感性侥加，并且在TSS上游200bp的區(qū)域敏感性最高（Fig S6）捧存。

Fig 4

作者比較了RT和冷處理塊莖中所有基因DNase I 敏感性水平。發(fā)現(xiàn)無(wú)論是表達(dá)的基因還是始終沉默的基因担败，都表現(xiàn)出在冷處理后TSS上游1k以及TTS下游1k 敏感性的降低以及基因體上敏感性的上升（Fig 4a）昔穴。

用類似的方法比較的葉片和RT，發(fā)現(xiàn)不表達(dá)的基因Dnase I敏感性基本不變提前，表達(dá)的基因在TSS上游和TTS下游在葉片中敏感性更高吗货。

結(jié)論5 低溫塊莖中H3K27me3在活性基因的基因體區(qū)域累積

Fig 5

染色質(zhì)修飾，包括組蛋白修飾狈网，在植物對(duì)環(huán)境脅迫的反應(yīng)中起著不可或缺的作用宙搬。作者想進(jìn)一步研究在冷處理塊莖中觀察到的不同DHS模式（Fig 4a）是否與任何特定的組蛋白修飾有關(guān)。有趣的是拓哺，冷塊莖中表達(dá)基因的基因體區(qū)域（FPKM >1）富集了H3K27me3（Fig 5）勇垛。低溫塊莖中高表達(dá)的基因與5‘和3’端相對(duì)較低水平的H3K27me3相關(guān)，這種獨(dú)特的H3K27me3富集在RT或葉片中的活性基因中沒(méi)有觀察到士鸥。

Fig 6

在RT中組成型沉默的基因明顯與H3K27me3相關(guān)（Fig 6a）闲孤，與活性基因相關(guān)的H3K27me3的平均水平與基因間序列相似。相比之下烤礁，冷處理塊莖活性基因上的H3K27me3表達(dá)水平顯著高于組成型沉默基因（Fig 6b）讼积。對(duì)比RT和冷塊莖的H3K27me3信號(hào)發(fā)現(xiàn)，只有活性基因在冷塊莖中顯著富集H3K27me3 （Fig 6c）脚仔，而這些基因的核小體密度在RT和冷塊莖中保持相似勤众，這表明冷塊莖中H3K27me3的富集而不是核小體的富集。

Fig S8

Fig S9

此外鲤脏，無(wú)論差異表達(dá)方向如何决摧，所有在冷脅迫下表達(dá)的基因都表現(xiàn)出類似的H3K27me3富集增加（Fig S8），對(duì)基因體區(qū)域H3K27me3信號(hào)強(qiáng)度的定量分析顯示凑兰，在冷脅迫下掌桩，92%活性基因的H3K27me3水平升高（Fig S9），而大多數(shù)組成性沉默基因和基因間區(qū)域顯示H3K27me3水平降低姑食。這些結(jié)果共同表明波岛，在冷脅迫下，H3K27me3優(yōu)先沉積到活性基因的基因體區(qū)域音半。

結(jié)論6 冷處理塊莖中活性基因的H3K4me3模式

在RT中则拷，H3K4me3僅與活性轉(zhuǎn)錄基因相關(guān)（Fig 6d）贡蓖，與在模式動(dòng)物和植物物種中的觀察結(jié)果一致。

在冷塊莖中煌茬，H3K4me3更廣泛地分布在所有活性基因的基因體區(qū)域中心（Fig 5斥铺，F(xiàn)ig 6e），有趣的是坛善，在冷塊莖中觀察到H3K4me3在組成性沉默基因中的沉積（Fig 6e）晾蜘。

結(jié)論7 冷處理塊莖中二價(jià)性標(biāo)記與活躍基因

Fig S11

H3K4me3和H3K27me3在同一核小體上共存，被稱為二價(jià)組蛋白標(biāo)記眠屎。眾所周知剔交，二價(jià)性組蛋白標(biāo)記與哺乳動(dòng)物干細(xì)胞分化和發(fā)育的平衡基因的啟動(dòng)子有關(guān)。

兩種組蛋白修飾信號(hào)都在核小體上表現(xiàn)出震蕩改衩，并且K4和K27的震蕩峰幾乎重疊岖常，表明K4和K27可能在冷脅迫后沉積在相同的核小體上。為了檢驗(yàn)K4和K27的二價(jià)標(biāo)記是否真的沉積在同一個(gè)核小體上葫督，作者進(jìn)行了Sequential ChIP竭鞍，先使用K4的抗體，再使用K27的抗體橄镜，通過(guò)兩個(gè)不同抗體和兩次 ChIP 反應(yīng)偎快，得到K4和K27同時(shí)存在的DNA片段。對(duì)照是在第二次ChIP中不加K27抗體蛉鹿。另外滨砍，還反著做了一次往湿，即先加K27抗體妖异，再加K4抗體，對(duì)照是只加K27抗體领追。

Fig 7

33%的活躍基因（6442/19482）在冷脅迫后在同一核小體上表現(xiàn)出二價(jià)性標(biāo)記的富集（Fig 7）

Fig S13

二價(jià)H3K4me3-H3K27me3結(jié)構(gòu)域在人類CD4 +記憶T細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)與組蛋白修飾H3K4me1相關(guān)他膳。因此，作者也進(jìn)行了H3K4me1 ChIP-seq來(lái)檢測(cè)該標(biāo)記與冷塊莖中二價(jià)標(biāo)記相關(guān)基因的潛在關(guān)聯(lián)绒窑。有趣的是棕孙，冷脅迫下H3K4me1只在二價(jià)標(biāo)記相關(guān)基因中富集（Fig S13a），而其余活性基因與H3K4me1水平降低相關(guān)（Fig S13b）些膨。因此蟀俊，冷塊莖中的二價(jià)H3K4me3-H3K27me3標(biāo)記與先前在人類CD4 +記憶t細(xì)胞中觀察到的H3K4me1的關(guān)聯(lián)模式相似。

結(jié)論8 二價(jià)基因的表達(dá)特性

Fig S14

之前的研究發(fā)現(xiàn)订雾，在哺乳動(dòng)物中K4和K27的二價(jià)性修飾會(huì)抑制基因表達(dá)肢预，但是作者在這里發(fā)現(xiàn)冷處理塊莖的二價(jià)性修飾導(dǎo)致47.5%的基因上調(diào)，31%的基因下調(diào)洼哎，21.5%的基因沒(méi)有顯著變化烫映。雖然這三組基因的表達(dá)水平存在顯著變化沼本，但是二價(jià)修飾的信號(hào)沒(méi)有顯著差異（Fig S14），這說(shuō)明二價(jià)組蛋白修飾水平傾向獨(dú)立于基因表達(dá)水平的變化锭沟。

Fig 8

通過(guò)GO富集抽兆，作者發(fā)現(xiàn)冷處理塊莖中的二價(jià)性基因，特比是表達(dá)上調(diào)的二價(jià)性基因主要與應(yīng)激反應(yīng)和代謝相關(guān)（Fig 8）族淮。下調(diào)的基因與發(fā)育和生殖過(guò)程相關(guān)辫红，這與K4-K27二價(jià)性標(biāo)記抑制胚胎干細(xì)胞和精子的發(fā)育相關(guān)基因但使其快速激活一致。

結(jié)論9 二價(jià)基因的染色質(zhì)可及性

Fig S15a-c

為了進(jìn)一步研究二價(jià)性基因是否更容易接近瞧筛，作者比較了二價(jià)性基因和其他活性基因在基因區(qū)域的DNase I敏感性水平（即染色質(zhì)開(kāi)放程度）厉熟。對(duì)于在冷處理塊莖中上調(diào)和不變的二價(jià)性基因，整體看來(lái)有更高的染色質(zhì)可及性较幌，而下調(diào)的二價(jià)性基因染色質(zhì)可及性相似（Fig S15a-c）揍瑟。

Fig S15d-f

此外，作者比較了低溫塊莖和RT中基因的染色質(zhì)可及性乍炉，發(fā)現(xiàn)低溫脅迫下二價(jià)標(biāo)記相關(guān)基因DNase I敏感性的顯著升高绢片，包括上調(diào)、下調(diào)和組成型表達(dá)基因（Fig S15d-f）岛琼。這些結(jié)果表明底循，二價(jià)標(biāo)記相關(guān)基因的染色質(zhì)在冷脅迫下變得更容易接近。

Fig S15g-i

有趣的是槐瑞，在冷脅迫下與其他下調(diào)和組成表達(dá)的基因相比熙涤，二價(jià)基因下調(diào)和組成表達(dá)的基因在表達(dá)上的變化更小（Fig S15g-i）困檩，這表明二價(jià)標(biāo)記相關(guān)基因中DNase I敏感性的更高升高似乎與轉(zhuǎn)錄的更大變化無(wú)關(guān)祠挫。

以上結(jié)果暗示二價(jià)組蛋白修飾可能通過(guò)提高染色質(zhì)可及性，作為對(duì)冷脅迫的反應(yīng)悼沿。

總結(jié)

（1）冷脅迫下產(chǎn)生了大量的可及性區(qū)域等舔，這些可及性區(qū)域富集在冷脅迫誘導(dǎo)的差異表達(dá)基因附近。

（2）活躍基因在冷脅迫下表現(xiàn)出染色質(zhì)可及性增強(qiáng)糟趾。

（3）冷處理塊莖中大量的活躍基因與gene body區(qū)域的二價(jià)性組蛋白修飾相關(guān)慌植。

（4）與二價(jià)修飾相關(guān)的冷處理后上調(diào)的基因與參與應(yīng)激反映，下調(diào)的基因參與發(fā)育過(guò)程义郑。?

（5）與二價(jià)修飾相關(guān)的基因在冷脅迫下染色質(zhì)可及性更高蝶柿。