南京傲因生物
供稿：黃立婷冲甘、常樂 江醇、詹夢濤
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Highly Multiplexed Image Analysis of Intestinal Tissue Sections in Patients With Inflammatory Bowel Disease
多通路成像分析炎癥性腸病患者的組織切片
期刊：Gastroenterology
IF：33.883 (1區(qū)Q1)
DOI ：10.1053/j.gastro.2021.08.055
01研究背景—————————————————————————
炎癥性腸病（inflammatory bowel disease, IBD）首次病例出現(xiàn)于1859年，經過多年研究条辟，發(fā)病機制涉及遺傳和環(huán)境因子羽嫡。當前厂僧，主要的直接治療方式靶向過度活躍的免疫反應颜屠。盡管如此，哪種免疫系統(tǒng)對IBD的發(fā)生和發(fā)展的理解尚不明確粗井。其中一個挑戰(zhàn)是IBD的異質性浇衬，簡而言之耘擂，就是免疫細胞之間的相互作用醉冤。為理解是免疫細胞之間的相互作用蚁阳，在本文中螺捐，作者使用多通路成像技術椿疗。選取6例無炎癥的正常樣本作為基準届榄，以及6例潰瘍性結腸炎（Ulcerative Colitis, UC）6例和克羅恩猜撂酢（Crohn’s Disease, CD）班缰。樣本使用H&E染色，最終得到超過30萬個獨立細胞莹妒。
結果：IBD引起腸道上皮增殖和HLA-DR表達旨怠，以上兩種現(xiàn)象與炎癥有極大的正相關鉴腻。臨近分析表明T細胞相互作用CD68和CD4在兩種IBD均有出現(xiàn)爽哎。
結論：IMC是一個強大的IBD分析平臺。本文中产镐，作者通過IMC詳細描述了CD和UC患者的組織學特征和細胞譜癣亚，同時使用31種抗體同時分析上皮細胞述雾、間質細胞和免疫細胞群玻孟。目的是通過進行高度多路圖像分析表征IBD炎癥環(huán)境的能力，包括上皮細胞增殖匣掸、鈣粘蛋白表達碰酝、HLA-DR表達送爸、免疫細胞組成和Treg在細胞間的相互作用。
02研究結果—————————————————————————
Imaging Mass Cytometry Captures Major Epithelial, Stromal, and Immune Cell Populations in Inflammatory Bowel Disease
IMC捕獲IBD的主要上皮細胞嵌器、間質細胞爽航、免疫細胞群
樣本信息：6 CI 末端回腸; 6 CD 末端回腸; 6 CC 結腸; 6 UC 結腸
首先，作者用31種針對結構衷佃、上皮和免疫細胞類型的特異性抗體對組織切片進行染色氏义，在過濾掉具有高惯悠、非特異性自身熒光信號的細胞并去除低質量圖像后筒严，從48張圖像中獲取了396,890個細胞鸭蛙。并通過Boolean方法一共鑒定到13個不同的細胞亞群娶视，包括上皮細胞(epithelial cell)、αSMA+肌成纖維細胞(A.SMA+ cell)贪磺、間質細胞(stromal cell)寒锚、神經性粘附因子(NCAM)、CD8+ T細胞(CD8+ T cell)喇喉、CD4+ T細胞(CD4+ T cell)拣技、調節(jié)性T細胞(regulatory T cell)膏斤、CD20+B細胞(CD20+ B cell)、漿細胞(plasma cell)沮榜、CD68+巨噬細胞(CD68+ macrophage)蟆融、CD14+單核細胞(CD14+ monocyte)、CD16+髓細胞(CD16+ myeloid cell)冕末、CD11b+髓細胞(CD11b+ myeloid cell)（Fig 1）。
Histologic Assessment Reveals Variable Active and Chronic Inflammation Severity in Inflammatory Bowel Tissues
組織學評估顯示炎癥性腸組織存在不同程度的活動性和慢性炎癥嚴重程度，由于不同患者的IBD表現(xiàn)不同州弟，作者通過評估鄰近HE染色切片的組織病理學特征，對48張圖像進行了炎癥分級啃奴。
Epithelial Proliferation and HLA-DR Expression Are Increased in Inflammatory Bowel Disease and Correlated With Severity of Inflammation
炎癥性腸病中上皮增殖和HLA-DR表達增加，并與炎癥的嚴重程度相關
通過量化Ki67上皮細胞的比例揖膜，比較CD與CI壹粟、UC與CC的增殖活性洪添，觀察到CD和UC的上皮細胞增殖均較各自的對照組增加干奢。E-cadherin是維持上皮結構完整性所需的細胞黏附分子忿峻，因此上皮屏障功能下降是IBD發(fā)病的觸發(fā)因素之一；HLA-DR是一種MHCⅡ類蛋白绰寞，正常表達于IBD上皮細胞可升高的抗原提呈細胞表面。研究二者的上皮表達水平是否改變件缸，發(fā)現(xiàn)E-cadherin表達不變停团，HLA-DR在CD和UC上皮細胞較對照組明顯升高（Fig 2A-E）。
研究上皮增殖率舌胶、E-cadherin表達、HLA-DR表達與炎癥嚴重程度是否相關履恩。發(fā)現(xiàn)UC結腸中炎癥和非炎癥的上皮增殖率相似飒筑，而CD回腸中上皮增殖率與炎癥強度明顯相關协屡。此外，HLA-DR的表達與回腸和結腸炎癥強度相關补憾，比較同一患者不同程度炎癥的圖像時盈匾，也能夠發(fā)現(xiàn)炎癥與上皮增生/HLA-DR表達呈正相關（Fig 2F-J）毙沾。
Inflammatory Bowel Disease Tissues Exhibit Unique Immune Cell Profiles Based on Disease Type and Inflammation
炎癥性腸病組織表現(xiàn)出基于疾病類型和炎癥的獨特免疫細胞譜
免疫細胞在IBD的發(fā)病中起重要作用担钮，固有免疫和適應性免疫反應的過度激活導致黏膜組織的損傷狭姨。作者鑒定了主要的免疫細胞群，包括CD4+T輔助細胞师抄、CD8+細胞毒性T細胞教硫、Foxp3+ 調節(jié)性T細胞叨吮、CD20-/CD27+ / CD38+漿細胞、CD6+駐留巨噬細胞瞬矩、CD14+單核細胞（Fig 1）茶鉴。并對這些細胞類型進行量化，發(fā)現(xiàn)CD4+T細胞在CD中顯著增加而UC中不明顯涵叮，CD8+T細胞在不同疾病組中存在差異；CD68+巨噬細胞在正常腸道內呈穩(wěn)態(tài)，且CD相較對照組增加围肥；CD14+單核細胞剿干、漿細胞和Treg在CD和UC均有增加，一般來說穆刻，三者在CD和UC中隨著炎癥程度的增加而增加（Fig 3A）置尔。
根據(jù)免疫細胞組成譜對所有圖像進行分層聚類，以在疾病組和炎癥狀態(tài)之間進行比較氢伟，顯示(1)對照組與疾病圖像分開聚類榜轿；(2)CD慢性炎癥表現(xiàn)為CD4+T細胞和Treg頻率增高；(3)UC慢性和活動性炎癥的圖像以漿細胞和CD14單核細胞頻率增高為標志朵锣；(4)4張慢性炎癥CD圖像和2張慢性炎癥和活動性炎癥UC圖像顯示Tregs谬盐、漿細胞和CD14單核細胞增多（Fig 3B）。
Tissue-Resident Macrophages and CD8+ T Cells Exhibit Increased Inflammatory Activity in the Lamina Propria of Patients With Inflammatory Bowel Disease
組織駐留巨噬細胞和CD8+ T細胞在炎癥性腸病患者的固有層中表現(xiàn)出增加的炎癥活性
接下來诚些，通過根據(jù)細胞狀態(tài)和活性標志物的表達情況飞傀，對CD8+T細胞亞群和CD68+巨噬細胞亞群進行分析，來判斷免疫細胞組成是否能夠更好地可視化诬烹。
CD38在T淋巴細胞中的表達在炎癥粘膜中已被證明增高砸烦，CD69是淋巴細胞短暫活化的標志之一，顆粒酶granzyme B是CD8+T細胞和其他免疫細胞表達的細胞毒性蛋白绞吁，可破壞感染宿主細胞幢痘。溶菌酶lysozyme C是小腸Paneth細胞為保護黏膜層免受外來病原體入侵而分泌的一種抗菌蛋白，但也是巨噬細胞在炎癥環(huán)境中產生的家破，一旦被吞噬體中的細胞攝取颜说，就會破壞病原體。
定量CD38+汰聋、CD69+和granzyme B+CD8+T細胞门粪，顯示在CD和UC中均表現(xiàn)為CD38+和granzyme B+CD8+T細胞增加，其他無變化（Fig 4A,C）烹困。定量lysozyme C+和granzyme B+巨噬細胞庄拇，顯示在CD和UC中均發(fā)現(xiàn)lysozyme C+巨噬細胞增加，而granzyme B+巨噬細胞僅在UC中增加（Fig 4A-D）韭邓。這些結果表明措近，CD8+T細胞和CD68+巨噬細胞這兩種細胞類型均增加了IBD炎癥和抗菌活性增強的標志物表達水平。
Neighborhood Analysis Shows Selective Interactions of Regulatory T Cells With Immune Cell Populations
鄰域分析顯示調節(jié)性T細胞與免疫細胞群的選擇性相互作用
利用IMC所保留的空間信息女淑，作者希望確定Tregs（調節(jié)性T細胞）與某些免疫細胞類型的相互作用在各疾病組中是否發(fā)生頻率高于預期瞭郑。為此，進行了鄰近分析來量化Foxp3+ Treg鄰居間不同免疫細胞類型的富集情況鸭你。結果顯示屈张，在CD和UC中擒权，與隨機分布相比，CD68+巨噬細胞阁谆、CD4+T細胞和漿細胞的Tregs鄰居均顯著富集碳抄；而與CD14+單核細胞和CD8+T細胞鄰居的Tregs，在CD中顯著富集场绿，UC中不富集（Fig 5A,C）剖效。
最后，為了確定Tregs是否更容易與活化的免疫細胞亞群發(fā)生相互作用焰盗，作者在CD和UC中進行了以Tregs為中心同CD38+CD8+T細胞璧尸、CD38-CD8+T細胞、 lysozyme C+CD68+巨噬細胞以及l(fā)ysozyme C-CD68+巨噬細胞的相互作用熬拒。研究發(fā)現(xiàn)爷光，在CD中，Tregs與lysozyme C+CD68+巨噬細胞的相互作用顯著高于lysozyme C-CD68+巨噬細胞澎粟，但在UC中這種作用并不成立蛀序。兩組均未見與CD38+CD8+T細胞鄰居的Tregs高于與CD38-CD8+T細胞鄰居的富集（Fig 5B,C）。
[參考文獻]
Kondo A, Ma S, Lee M Y Y, et al. Highly multiplexed image analysis of intestinal tissue sections in patients with inflammatory bowel disease[J]. Gastroenterology, 2021, 161(6): 1940-1952.
