周三了丐黄，又是新的一周的最黃金的時(shí)間纷宇，不知道為什么，29歲的自己如此的焦慮秽荞，可能自己是個(gè)loser吧骤公，又到了我們單細(xì)胞空間聯(lián)合分析的內(nèi)容了，今天分享的文章在Integrative single cell and spatial transcriptomic analysis reveal reciprocal microglia-plasma cell crosstalk in the mouse brain during chronic Trypanosoma brucei infection扬跋，顯然阶捆，現(xiàn)在做單細(xì)胞空間發(fā)的雜志影響因子都太高了，希望大家好好努力。

這里的重點(diǎn)就是體現(xiàn)配受體分布的空間特性

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Abstract

Human African trypanosomiasi或昏睡病是由原生動(dòng)物Trypanosoma brucei引起的趁猴，當(dāng)parasite定植于中樞神經(jīng)系統(tǒng)時(shí)刊咳，會(huì)引起神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的強(qiáng)烈反應(yīng)和神經(jīng)炎癥。然而儡司，大腦對慢性 T. brucei infected的轉(zhuǎn)錄和功能反應(yīng)仍然知之甚少。通過整合小鼠大腦的單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)余指，發(fā)現(xiàn)由infected觸發(fā)的神經(jīng)膠質(zhì)反應(yīng)很容易在腦室周圍器官附近檢測到捕犬，包括側(cè)腦室和第三腦室。這與 T. brucei 細(xì)長和粗短形式的空間定位相吻合酵镜。此外碉碉，計(jì)算機(jī)預(yù)測和功能驗(yàn)證確定了由 IL-10 和 B 細(xì)胞激活因子 (BAFF) 信號傳導(dǎo)介導(dǎo)的穩(wěn)態(tài) Cx3cr1+ 小膠質(zhì)細(xì)胞和 Cd138+ 漿細(xì)胞之間先前未知的crosstalk。

Introduction

單細(xì)胞 RNA 測序 (scRNAseq) 的應(yīng)用對理解阿爾茨海默病等腦部疾病具有變革性意義淮韭，最近也被應(yīng)用于理解對病毒infected的免疫反應(yīng)垢粮。然而，scRNAseq 的一個(gè)主要限制是它不能保留起源組織中的空間分布靠粪。scRNAseq 與空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)的整合能夠在區(qū)域和全局范圍內(nèi)表征細(xì)胞和組織對infected的反應(yīng)蜡吧。然而，尚未實(shí)施類似的方法來研究組織對原生動(dòng)物parasite的反應(yīng)占键。在這里昔善，提出了一個(gè)空間分辨的鼠 CNS 單細(xì)胞圖譜，以響應(yīng) T. brucei畔乙。這種綜合方法發(fā)現(xiàn)由infected引發(fā)的神經(jīng)膠質(zhì)反應(yīng)不僅限于下丘腦君仆，而且在靠近腦室器官 (CVO) 的地方也可以很容易地檢測到，這與 T. brucei 的細(xì)長和粗壯形式的定位相吻合牲距。此外返咱，確定了由 IL-10 和 B 細(xì)胞激活因子 (BAFF) 信號傳導(dǎo)介導(dǎo)的穩(wěn)態(tài) Cx3cr1+ 小膠質(zhì)細(xì)胞和 Cd138+ 漿細(xì)胞之間以前未知的相互作用。時(shí)空圖譜為慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)infected期間先天免疫和適應(yīng)性免疫之間的相互作用提供了新的見解牍鞠，并代表了一種資源咖摹，可以提高對infected后大腦中觸發(fā)的分子和細(xì)胞反應(yīng)的理解.

Results

Single cell transcriptomic analysis of the mouse hypothalamus over the course of T.brucei infection

為了以盡可能多的singularity和空間分辨率解決中樞神經(jīng)系統(tǒng)對 T. brucei infected的反應(yīng)所涉及的不同細(xì)胞類型和轉(zhuǎn)錄途徑的復(fù)雜性，采用了結(jié)合單細(xì)胞 (scRNAseq) 和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)的方法皮服，從采集的樣本中提取中樞神經(jīng)系統(tǒng)階段的開始 (25dpi) 和神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的出現(xiàn) (45dpi)楞艾。在這些時(shí)間點(diǎn)通過組織學(xué)檢查證實(shí)了腦神經(jīng)實(shí)質(zhì)和腦膜間隙的整體炎癥。為了進(jìn)一步完善 scRNAseq 數(shù)據(jù)集龄广，專注于下丘腦硫眯，因?yàn)樗诳刂茣円构?jié)律行為方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用≡裢總共獲得了 13,195 個(gè)細(xì)胞两入，平均每個(gè)細(xì)胞有 500 個(gè)基因和 1,500 個(gè)轉(zhuǎn)錄本/細(xì)胞∏貌牛總體而言裹纳，確定了跨越 8 種細(xì)胞類型的 11 個(gè)clusters择葡，包括小膠質(zhì)細(xì)胞（clusters 0、1剃氧、6 和 9）敏储、少突膠質(zhì)細(xì)胞/B 細(xì)胞（cluster 7）、星形膠質(zhì)細(xì)胞（clusters 2 和 5）朋鞍、T 細(xì)胞（clusters 3）和血管相關(guān)細(xì)胞已添，包括內(nèi)皮細(xì)胞（cluster 4）、周細(xì)胞（cluster 8）和室管膜細(xì)胞（cluster 10）滥酥。小膠質(zhì)細(xì)胞亞群主要表達(dá)putative的標(biāo)志物更舞，包括 C1qa、Lyz2坎吻、Aif1 和 Cx3cr1缆蝉，而星形膠質(zhì)細(xì)胞群的特征是成熟星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物表達(dá)，包括 Gfap 和 Agt瘦真。血管相關(guān)細(xì)胞進(jìn)一步分為三個(gè) Cldn5+ 內(nèi)皮細(xì)胞亞群刊头，兩個(gè)代表 Pdgfrb+ 周細(xì)胞/tanycytes 的clusters，一個(gè)代表 Acta2+ 周細(xì)胞的cluster和一個(gè) Ccdc153+ 室管膜細(xì)胞cluster吗氏。這些數(shù)據(jù)與先前在健康小鼠下丘腦中報(bào)道的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞類型的多樣性一致芽偏。

疾病狀態(tài)分析顯示，與na?ve controls 相比弦讽，infected樣本中小膠質(zhì)細(xì)胞污尉、B 細(xì)胞和 T 細(xì)胞clusters內(nèi)的細(xì)胞分布不同。此外往产，通過計(jì)算基因模塊評分來評估炎癥介質(zhì)（例如細(xì)胞因子和趨化因子）的整體表達(dá)水平被碗，發(fā)現(xiàn)在小膠質(zhì)細(xì)胞中主要觀察到對慢性 T. brucei infected（25 和 45 dpi）的反應(yīng)亞群（特別是小膠質(zhì)細(xì)胞 1 和 2），在內(nèi)皮細(xì)胞仿村、T 細(xì)胞和適應(yīng)性免疫細(xì)胞中的程度較低锐朴，并且顯著高于na?ve對照（ANOVA，p < 2.2^-16）蔼囊》僦荆總之，數(shù)據(jù)表明畏鼓，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的 T. brucei infected主要在小膠質(zhì)細(xì)胞以及 T 細(xì)胞和 B 細(xì)胞中誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)酱酬，在內(nèi)皮細(xì)胞中的程度較低。值得注意的是云矫，沒有在 scRNAseq 數(shù)據(jù)集中檢測到足夠的 T.brucei reads以進(jìn)行下游分析膳沽，這可能是由于腦實(shí)質(zhì)中的parasite負(fù)擔(dān)低；然而，能夠在空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)集中檢測到它們(看來空間的優(yōu)勢還是很大的).

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Spatial transcriptomics reveals both T. brucei long slender and stumpy forms predominantly in the circumventricular organs

在分析空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)集時(shí)挑社，注意到受infected樣本中多個(gè) T. brucei特異性基因的表達(dá)陨界，尤其是在 45dpi 時(shí)。大多數(shù) T. brucei 特異性基因分布在小鼠前腦的離散位置痛阻。例如菌瘪，通常與細(xì)長形式相關(guān)的 Tb927.6.4280 (GAPDH) 在空間clusters 0、1录平、4麻车、10、14 和 17 中高度表達(dá)斗这，這些空間clusters定義了對應(yīng)于大腦尾殼或紋狀體、丘腦的解剖區(qū)域啤斗，海馬表箭、大腦皮層、下丘腦和腦室周圍器官（CVO钮莲；包括側(cè)腦室和第三腦室）免钻。類似地，Tb927.7.5940 (PAD2) 被限制在clusters 17崔拥。parasite在 45dpi 時(shí)在這些腦區(qū)的定位至少部分與炎癥介質(zhì)在幾個(gè)腦區(qū)（包括cluster 4和cluster 17 周圍）的表達(dá)增加一致（兩個(gè)與 CVO 相關(guān)的clusters）极舔。使用 smFISH 對與纖細(xì)（GAPDH 和 PYK1）或矮胖（PAD2 和 EP1）生命周期階段相關(guān)的parasite特異性標(biāo)記基因和獨(dú)立的組織學(xué)評分進(jìn)一步證實(shí)了T. brucei不同發(fā)育階段的空間分布。這些觀察證實(shí)链瓦，除了通過血腦屏障外拆魏， T. brucei還利用 CVO 作為進(jìn)入 CNS 的點(diǎn)。

為了深入了解腦內(nèi) T. brucei的潛在多樣性慈俯，包括不同發(fā)育階段的存在渤刃，根據(jù)其相對空間分布對最豐富的 T. brucei轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行了基因GO通路分析√欤總體而言卖子，觀察到 CVO 中通常與代謝活性parasite相關(guān)的基因過多，例如蛋白質(zhì)翻譯 (p adj = 3.35-57) 和生物合成過程 (p adj = 1.05-24)刑峡，無論其空間分布如何洋闽。此外，CVO 中parasite的轉(zhuǎn)錄組主要受與翻譯（p adj = 9.14-22）突梦、基因表達(dá)控制（p adj = 2.23-04）和生物合成過程（p adj = 3.46- 08）诫舅，表明居住在 CVO 的parasite具有代謝活性。值得注意的是阳似，CVO 中的parasite還表達(dá)了被認(rèn)為是parasite分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子的基因骚勘，例如 RBP7A 和 RBP7B（分別由 Tb927.10.12090 和 Tb927.10.12100 編碼）、PAD1（由 Tb927.7.5930 編碼）和 PAD2（由Tb927.7.5940) 。Together, these results provide an overview of the spatial distribution of African trypanosomes in the mouse forebrain and support the hypothesis that the majority of brain-dwelling trypanosomes display features of replicative slender forms, protein translation and control of gene expression, together with differentiation commitments in the CVOs.

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Infection-associated microglia and border-associated macrophages occupy spatial niches in proximity to the ventricular spaces

確定了小膠質(zhì)細(xì)胞在infected時(shí)表現(xiàn)出高炎癥評分俏讹，并且在 CVO 中或周圍發(fā)現(xiàn)了細(xì)長和短粗的 T. brucei 形式当宴，接下來query不同小膠質(zhì)細(xì)胞clusters的空間分布是否與前腦中parasite的分布相關(guān)。再亞群分析后泽疆，確定了六個(gè)離散的骨髓亞群户矢，這些亞群顯示出顯著的差異基因表達(dá)特征。例如殉疼，cluster 1 和cluster 2 表達(dá)高水平的假定穩(wěn)態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記基因梯浪，包括 P2ry12、Trem119 和 Cx3cr1瓢娜，并且可能對應(yīng)于不同的穩(wěn)態(tài)subcluster挂洛。cluster 1 中的細(xì)胞表達(dá)高水平的 Tgfbr1、Ifngr1 和 Il6ra眠砾，而cluster 2 表達(dá)高水平的 Il10ra虏劲，表明對細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)的潛在不同反應(yīng)（例如，cluster 1 中的干擾素 γ (IFNg) 與cluster 2 中的 IL-10 ）褒颈。cluster 3 的特點(diǎn)是表達(dá)單核細(xì)胞特異性譜系標(biāo)記柒巫，包括 Cd14、Ccrl2谷丸、Fcgr2b 和幾種 MHC-II 相關(guān)分子（H2-Aa1堡掏、H2-Ab1）。clusters 4 和 5 表達(dá)高水平的 Aif1刨疼，以及典型的促炎趨化因子和先天免疫介質(zhì)（Ccl5泉唁、Mif、Cxcl13）币狠、補(bǔ)體級聯(lián)的成分（C1qa游两、C1qb）、抗原加工和呈遞基因（H2- Ab1漩绵、H2-Eb1）贱案、幾種干擾素刺激基因（Ifitm3、Ifih1）和疾病相關(guān)小膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物（Apoe止吐、Itgax宝踪、Trem2、Cst7）碍扔，但小膠質(zhì)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)標(biāo)志物的表達(dá)降低瘩燥。最后，cluster 6 表達(dá)與邊緣相關(guān)巨噬細(xì)胞相關(guān)的推定標(biāo)記基因不同，例如 Lyz2厉膀、Ms4a7溶耘、Ms4a6c、Tgfbi服鹅、H2-Ab1 和 Lyz2凳兵，以及具有抗炎反應(yīng)特征的基因，例如 Chil3企软、Arg1 和Vegfa庐扫，指示抗炎表型≌躺冢基于這些結(jié)果形庭，將cluster1 到 6 分類如下：Cx3cr1+ 1 (29.5%)、Cx3cr1+ 2厌漂、(30.4%)萨醒、Cd14+ 單核細(xì)胞 (27.6%)、Arg1+ 邊界相關(guān)巨噬細(xì)胞 (Arg1+ BAM苇倡；12.6%)验靡、Aif1+ 1 (10.5%)、Aif1+ 2 (4.85%)雏节。值得注意的是，Cx3cr1+ 小膠質(zhì)細(xì)胞 1 和 2高职，以及 Cd14+ 單核細(xì)胞占在穩(wěn)態(tài)條件下檢測到的所有小膠質(zhì)細(xì)胞的約 75%钩乍，但 Aif1+ 小膠質(zhì)細(xì)胞 1 和 2，以及 Arg1+ BAMs 亞群在infected過程中的頻率逐漸增加怔锌，表明采用infected相關(guān)的表型寥粹。在空間背景下，發(fā)現(xiàn) Aif1埃元、Adgre1（Aif1+1 和 Aif1+2 subcluster的特異性標(biāo)記基因）的基因表達(dá)在 25dpi 和 45dpi 時(shí)在海馬體涝涤、CVO 和尾殼核周圍高度表達(dá)，與幼稚對照相比岛杀。同樣阔拳，Arg1 + BAM 的推定標(biāo)記基因 Arg1 和 Chil3 主要位于受infected大腦的側(cè)腦室和背側(cè)第三腦室，通過對獨(dú)立腦切片的免疫熒光分析進(jìn)一步證實(shí)类嗤『Γ總之，綜合分析表明遗锣，在靠近 CVO 的區(qū)域檢測到infected相關(guān)的骨髓亞群（Aif1+1货裹、Aif1+2 和 Arg1+BAM），與 T. brucei的空間分布相一致精偿，并suggesting a functional compartmentalisation of the myeloid subsets in responses to infection弧圆。

Microglial responses to T. brucei infection share common transcriptional features with neurodegeneration diseases

為了在分子水平上更全面地了解小膠質(zhì)細(xì)胞對infected的反應(yīng)赋兵，分析了小膠質(zhì)細(xì)胞亞型響應(yīng) T. brucei infected的差異表達(dá)基因 (DEG)，定義為 Log2 倍數(shù)變化 >0.25 或 <-0.25 的基因調(diào)整后的 p 值 < 0.05搔预。大多數(shù)上調(diào)的 DEG 在 Cx3cr1+ 1霹期、Cx3cr1+ 2 和 Cd14+ 單核細(xì)胞亞群中檢測到，并且與 MHC-II 介導(dǎo)的抗原呈遞（iH2-Aa1斯撮、H2-Ab1）经伙、中性粒細(xì)胞趨化性（Ccl2、Ccl4）的上調(diào)有關(guān)勿锅、適應(yīng)性免疫反應(yīng)（Cd274帕膜、Mif、Tnfsf13b）和對 IFNg 的反應(yīng)（Ifitm3溢十、Aif1）垮刹。隨著infected的進(jìn)展，我們注意到與神經(jīng)退行性疾病相關(guān)的基因通路富集张弛，包括肌萎縮側(cè)索硬化癥荒典、亨廷頓病、帕金森病和阿爾茨海默病吞鸭，包括 Apoe寺董、Trem2、Psen2 和 Cd22刻剥。這些細(xì)胞還下調(diào)與器官發(fā)育（Tgfbr1遮咖、Mertk、Fos）造虏、神經(jīng)元穩(wěn)態(tài)（Cx3cr1御吞、Itgam）和對 cAMP 的反應(yīng)相關(guān)的穩(wěn)態(tài)過程±炫海總體而言陶珠，數(shù)據(jù)證明了在 T. brucei infected期間小膠質(zhì)細(xì)胞的動(dòng)態(tài)反應(yīng)。在 CNS 階段 (25dpi) 開始期間享钞，穩(wěn)態(tài) Cx3cr1+ 小膠質(zhì)細(xì)胞上調(diào)與抗原加工揍诽、呈遞和適應(yīng)性免疫反應(yīng)發(fā)展相關(guān)的轉(zhuǎn)錄程序，同時(shí)下調(diào)與穩(wěn)態(tài)相關(guān)的基因嫩与。隨著infected的進(jìn)展（45dpi）寝姿，小膠質(zhì)細(xì)胞特征與神經(jīng)退行性疾病中發(fā)現(xiàn)的特征有許多共同點(diǎn)，與這些動(dòng)物臨床癥狀的發(fā)展相吻合划滋。這些數(shù)據(jù)表明對中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥過程的常見轉(zhuǎn)錄反應(yīng)饵筑。其他骨髓細(xì)胞類型，例如 Cd14+ 單核細(xì)胞和 Arg1+ BAM处坪，構(gòu)成了對infected的額外反應(yīng)者根资，盡管具有相反的效果架专； Cd14+ 單核細(xì)胞和 Arg1+ BAM 分別顯示促炎和抗炎表型。

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Chronic T. brucei infection recruits follicular-like regulatory Cd4+ T cells and cytotoxic Cd8+ T cells into the CNS

接下來玄帕，試圖表征數(shù)據(jù)集中識別的適應(yīng)性免疫細(xì)胞群部脚。根據(jù) T 細(xì)胞標(biāo)記基因（如 Trac 和 Cd3g）的表達(dá)鑒定了三個(gè) T 細(xì)胞亞群。由于缺乏可識別的標(biāo)記基因裤纹，cluster 0 (44%) 被丟棄委刘。cluster 1 (18%) 和 2 (18.5%) 表達(dá)與細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞相關(guān)的標(biāo)記基因，例如 Cd8a 和 Gzmb鹰椒。cluster 2 中的細(xì)胞還表達(dá)高水平的與細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞活化和效應(yīng)功能相關(guān)的基因（Ccl5锡移、Klrd1）、γ TCR 受體亞基（Trgv2）漆际、干擾素刺激基因（Ifitm1）和高水平的 Cd52淆珊，其中涉及在 T 細(xì)胞效應(yīng)功能中。這表明cluster 2 中的細(xì)胞可能代表一個(gè)專門的細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞亞群奸汇。最后施符，除 Cd4 外，cluster 3 中的細(xì)胞（18.5%）表達(dá)高水平的與調(diào)節(jié)性 CD4+ T 細(xì)胞相關(guān)的基因擂找，包括表面標(biāo)志物（Cd5戳吝、Ctla4、Icos贯涎、Cd274）骨坑、轉(zhuǎn)錄因子（Mxd1、Izkf2）和效應(yīng)分子（Il10柬采、Areg、Il21）且警。值得注意的是粉捻，這些調(diào)節(jié)性 Cd4+ T 細(xì)胞還表達(dá)高水平的標(biāo)記基因，這些基因通常與濾泡輔助 T 細(xì)胞如 Maf 和 Slamf5 相關(guān)斑芜。這些濾泡樣調(diào)節(jié)性 CD4+ T 細(xì)胞亞群已被假定為淋巴器官適應(yīng)性反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子肩刃，但迄今為止尚未在infected期間在大腦中報(bào)告。這些population在infected過程中似乎是動(dòng)態(tài)的杏头，與其他亞群相比盈包，慢性階段與 Cd4+ T 細(xì)胞的豐度增加了兩倍（幼稚、25dpi 和 45dpi 分別為 8.2%醇王、19.3% 和 20.85%） )呢燥，與之前的報(bào)道一致。值得注意的是寓娩，被鑒定為cluster 2 Cd8+ T 細(xì)胞（Cd8+ 2 T 細(xì)胞）的亞群僅在infected樣本中檢測到叛氨，但在幼稚對照中未檢測到（在 25 dpi 和 45dpi 時(shí)分別為 23% 和 20%）呼渣，表明存在與疾病相關(guān)的 T 細(xì)胞大腦中的子集。在空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)集中對整個(gè)大腦進(jìn)行比較時(shí)寞埠，Cd4+ T 細(xì)胞亞群主要在幼稚和infected樣本的側(cè)腦室屁置、外囊和尾殼中檢測到，而 Cd8+ T 細(xì)胞亞群在腦實(shí)質(zhì)仁连。

與幼稚對照相比蓝角，使用 NicheNet 的細(xì)胞間相互作用分析揭示了infected樣本中 T 細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和脈管系統(tǒng)之間的分子通訊網(wǎng)絡(luò)饭冬。例如使鹅，室管膜細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞分別表達(dá)高水平的 Cxcl10 和 Cxcl12，它們是神經(jīng)炎癥期間淋巴細(xì)胞募集到腦實(shí)質(zhì)的關(guān)鍵介質(zhì)伍伤。小膠質(zhì)細(xì)胞還表達(dá)其他趨化因子亞群（Ccl2并徘、Ccl3、Ccl4）扰魂，與在血管相關(guān)細(xì)胞中檢測到的沒有重疊麦乞，這可能表明infected期間 T 細(xì)胞募集到腦實(shí)質(zhì)的非冗余機(jī)制。此外劝评，內(nèi)皮細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)高水平的細(xì)胞粘附標(biāo)志物姐直，包括 Icam1、Icam2 和 Pecam1蒋畜，它們介導(dǎo)免疫細(xì)胞跨內(nèi)皮和血管外組織遷移声畏。還檢測到 T 細(xì)胞活化的其他介質(zhì)，包括內(nèi)皮細(xì)胞衍生的 Il15 和星形膠質(zhì)細(xì)胞衍生的 Il18姻成，它們參與 T 細(xì)胞活化和增強(qiáng) IFNg 產(chǎn)生插龄。總之科展，數(shù)據(jù)提供了慢性 T.brucei infected期間 CNS 中 T 細(xì)胞多樣性的概述均牢，包括在 T. brucei infected過程中在大腦中積累的調(diào)節(jié)性 Cd4+ T 細(xì)胞。此外才睹，配體-受體介導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞通訊表明徘跪，小膠質(zhì)細(xì)胞、室管膜細(xì)胞琅攘、內(nèi)皮細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞在慢性 T. brucei病期間參與了 T 細(xì)胞向大腦的募集和激活垮庐，盡管通過不同的信號分子.

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Cd138+ plasma cells are detected in the mouse brain during chronic T. brucei infection

接下來，表征 cluster 7中表達(dá)的基因的細(xì)胞坞琴。這似乎代表了表達(dá)高水平的少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物（olig1哨查，Sox10和S100b）和Bona vide b細(xì)胞標(biāo)記物（CD79a，CD79b剧辐，ighm的細(xì)胞的異質(zhì)分組）解恰。subcluster 7 后的降維分析使我們確定了五個(gè)clusters锋八，如下所示：cluster 1 (34.7%) 和 2 (11.41%) 表達(dá)高水平的 Olig1 和 Pdgfra 并對應(yīng)于少突膠質(zhì)細(xì)胞，cluster 3 (8.48%) 對應(yīng)于 Epcam+神經(jīng)上皮和由 Map2+ 神經(jīng)元組成的cluster 4 (6.02%)护盈。最后挟纱，除了 Cd79a 和 Cd79b（編碼 B 細(xì)胞受體）外，cluster 0（39.3%）的特征還在于與漿細(xì)胞相關(guān)的推定標(biāo)志物的高表達(dá)水平腐宋，包括表面標(biāo)志物（Sdc1 或 Cd138紊服、Slamf7）和漿細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子（Prdm1、Xbp1胸竞、Irf4）欺嗤。這些細(xì)胞還表達(dá)與調(diào)節(jié)功能相關(guān)的基因，包括 Il10 和 Cd274卫枝，因此被標(biāo)記為 Cd138+ 漿細(xì)胞煎饼。此外，在初始對照中檢測到低水平的 Cd138+ 漿細(xì)胞（該cluster中約 8% 的細(xì)胞）校赤，但在 25dpi（61.6%）和 45dpi（88%）的infected過程中增加吆玖。在獨(dú)立的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步證實(shí)了慢性infected期間 Cd138+ 漿細(xì)胞的富集马篮，反映了 scRNAseq 檢測到的比例沾乘。值得注意的是，Cd138+ 血漿在 CVO（背側(cè)第三腦室）和底丘腦區(qū)域周圍的幼稚大腦中占據(jù)離散的壁龕浑测，但在 25dpi 時(shí)優(yōu)先在外囊翅阵、胼胝體和側(cè)腦室或軟腦膜、扣帶回皮層迁央、側(cè)腦室中檢測到心室和背側(cè)第三腦室在 45dpi掷匠。結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果，這些數(shù)據(jù)表明該群體在 CVO 和近端區(qū)域的潛在擴(kuò)張岖圈。此外槐雾，Il10 的預(yù)測表達(dá)，一種顯示在具有調(diào)節(jié)表型的 B 細(xì)胞中表達(dá)的抗炎細(xì)胞因子幅狮，是通過 ELISA 對來自infected小鼠的離體刺激腦內(nèi) B 細(xì)胞進(jìn)行了測試和證實(shí)，證實(shí)了計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)并表明了調(diào)節(jié)表型株灸〕缟悖總之，這些數(shù)據(jù)顯示在慢性 T. brucei infected期間慌烧，小鼠大腦中 CVO 和軟腦膜中存在具有調(diào)節(jié)表型的 Cd138+ 漿細(xì)胞.

Cd138+ plasma cell supernatant suppresses microglia polarisation towards an inflammatory phenotype

scRNAseq 數(shù)據(jù)表明逐抑， T. brucei infected小鼠前腦中的小膠質(zhì)細(xì)胞同時(shí)表達(dá) Il10ra 和 Il10rb（它們共同形成功能性 IL-10 受體，并且當(dāng)離體刺激時(shí)屹蚊，大腦中的 Cd138+ 漿細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生 IL-10厕氨。因此进每，假設(shè)漿細(xì)胞衍生的 IL-10 可能在調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的促炎反應(yīng)中發(fā)揮作用。在 CVO 周圍的計(jì)算機(jī)空間配體-受體相互作用分析中命斧，確定了infected期間上調(diào)的幾種重要配體-受體相互作用田晚，包括 Clec1b-Klrb1c，參與調(diào)節(jié) NK 細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞溶解活性和 Lpl-Lrp2国葬，它們參與 ApoE 介導(dǎo)的神經(jīng)元中膽固醇攝入贤徒。此外，還發(fā)現(xiàn) Il10 和 Il10ra 在 CVO 和軟腦膜中的強(qiáng)共表達(dá)汇四，與預(yù)測 Cd138+ 漿細(xì)胞在 45dpi 時(shí)的定位接奈，這已使用單分子熒光原位雜交 (smFISH) 進(jìn)行了獨(dú)立驗(yàn)證。 Il10 在腦內(nèi) Cd138+ 漿細(xì)胞中的表達(dá)和 Il10ra 在穩(wěn)態(tài) Cx3cr1+ 小膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)通孽。接下來序宦，假設(shè)來自受刺激的 Cd138+ 漿細(xì)胞的上清液也可能阻止小膠質(zhì)細(xì)胞極化向促炎狀態(tài)。正如預(yù)期的那樣背苦，暴露于大腸桿菌 LPS 24 小時(shí)的 BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞表達(dá)高水平的促炎細(xì)胞因子 Il1b 和 Tnfa熬词，當(dāng) BV2 細(xì)胞暴露于 Cd138+ 漿細(xì)胞的上清液時(shí)嘶伟，這種細(xì)胞因子被消除。此外，用抗 IL-10 的阻斷抗體預(yù)處理 Cd138+ 漿細(xì)胞上清液可恢復(fù) BV2 小膠質(zhì)細(xì)胞中 Il1b 和 Tnfa 的表達(dá)瓢捉，強(qiáng)烈表明 IL-10 是一種關(guān)鍵的漿細(xì)胞衍生的抗炎調(diào)節(jié)劑∽狡總之捷兰，這些數(shù)據(jù)表明 Cd138+ 漿細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞之間的功能相互作用至少部分由 IL-10 信號傳導(dǎo)介導(dǎo).

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Cx3cr1+ microglia express the B cell pro-survival factor B cell activation factor (BAFF) signalling

在確定小膠質(zhì)細(xì)胞、T 細(xì)胞和漿細(xì)胞與慢性 T. brucei infected有關(guān)后固阁，接下來決定根據(jù)典型配體-受體對的表達(dá)水平評估相關(guān)的細(xì)胞-細(xì)胞相互作用壤躲。其中，觀察到漿細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞之間復(fù)雜的分子通訊網(wǎng)絡(luò)备燃。在來自 Cx3cr1+ 1碉克、Cx3cr1+ 2 和 Arg1+ BAM（Vcam1、Spp1 和 Agt）的小膠質(zhì)細(xì)胞中冗余檢測到一組配體并齐，而第二個(gè)配體子集顯示出更多的細(xì)胞限制性表達(dá)譜漏麦。例如，促存活因子 Tnfsf13b（編碼 B 細(xì)胞存活因子况褪，BAFF）在infected后被穩(wěn)態(tài) Cx3cr1+ 小膠質(zhì)細(xì)胞大量上調(diào)撕贞，而其同源受體 Tnfrsf17（或 B 細(xì)胞成熟抗原，BCMA）的表達(dá)高度在infected動(dòng)物的 Cd138+ 漿細(xì)胞中表達(dá)测垛。此外捏膨，infected小鼠的小膠質(zhì)細(xì)胞中 Tnfsf13b 的表達(dá)更高，這表明這種 B 細(xì)胞促生存因子是在infected后誘導(dǎo)的。基于共表達(dá)的空間配體-受體相互作用分析表明号涯，促生存因子基因 Tnfsf13b 及其受體基因 Tnfrsf17 的共表達(dá)僅限于 CVO 和軟腦膜目胡，如Il10-Il10ra 配體-受體對。這兩個(gè)基因的表達(dá)模式由 smFISH 分析獨(dú)立證實(shí)链快，并顯示表達(dá) Tnfrsf17 的漿細(xì)胞與表達(dá) Tnfsf13b 的小膠質(zhì)細(xì)胞非常接近誉己，特別是在 T. brucei infected小鼠大腦的側(cè)腦室附近。通過流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析了infected后小膠質(zhì)細(xì)胞中 BAFF 的表達(dá)久又，證實(shí)了計(jì)算機(jī)預(yù)測巫延。總之地消，數(shù)據(jù)表明小膠質(zhì)細(xì)胞和 Cd138+ 漿細(xì)胞之間存在串?dāng)_炉峰。在這種情況下，Cx3cr1+ 小膠質(zhì)細(xì)胞通過 BAFF 促進(jìn) Cd138+ 漿細(xì)胞存活脉执，進(jìn)而 Cd138+ 血漿產(chǎn)生 IL-10 以抑制 T. brucei infected期間小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)疼阔。

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Discussion

為了解決有關(guān) CNS 對未解決的慢性 T. brucei infected的先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的基本問題，本研究有三個(gè)主要目標(biāo)：i) 使用單細(xì)胞表征膠質(zhì)細(xì)胞和募集的免疫細(xì)胞對 CNS 的時(shí)間轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 轉(zhuǎn)錄組學(xué)半夷，ii) 使用 10X Visium 空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)從 scRNAseq 數(shù)據(jù)集中了解候選細(xì)胞類型的空間分布婆廊，以及 iii) 基于假定的配體-受體相互作用模擬慢性infected期間 CNS 中發(fā)生的細(xì)胞-細(xì)胞相互作用 細(xì)胞和空間水平。 我綜合圖譜為未來分析 T. brucei對慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)infected的先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)提供了新穎而重要的見解

數(shù)據(jù)描述了與慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)infected相關(guān)的關(guān)鍵細(xì)胞類型和細(xì)胞間相互作用巫橄。我們證明了小膠質(zhì)細(xì)胞在 CNS 中驅(qū)動(dòng)炎癥和抗parasite反應(yīng)淘邻，并且還提供了對邊界相關(guān)巨噬細(xì)胞 (BAM) 轉(zhuǎn)錄特征的見解。這些反應(yīng)是異質(zhì)的湘换，小膠質(zhì)細(xì)胞和 Cd14+ 單核細(xì)胞表現(xiàn)出強(qiáng)烈的促炎特征宾舅。它們的轉(zhuǎn)錄程序與預(yù)期在發(fā)病期間響應(yīng)致病性挑戰(zhàn)而觸發(fā)的促炎反應(yīng)一致，包括細(xì)胞因子（即 Il1b彩倚、Tnf）筹我、趨化因子（即 Ccl5、Cxcl10）的產(chǎn)生和分子的上調(diào)與抗原加工和呈遞有關(guān)帆离∈呷铮基于infected過程中的差異基因表達(dá)分析，我們提出了一個(gè)模型哥谷，其中穩(wěn)態(tài) Cx3cr1+ 小膠質(zhì)細(xì)胞在infected期間經(jīng)歷廣泛的轉(zhuǎn)錄重塑岸夯，導(dǎo)致獲得與infected相關(guān)的表型，這與臨床癥狀的發(fā)作相吻合们妥。這包括在檢測到臨床癥狀的infected點(diǎn)上調(diào)涉及其他神經(jīng)退行性疾病的基因程序猜扮，例如 Apoe、Trem2 和 Cd22王悍。在 IAMs 狀態(tài)中確定的轉(zhuǎn)錄特征讓先前在神經(jīng)退行性疾病中報(bào)道的那些，因此很容易推測這代表了一個(gè)核心的“病理”轉(zhuǎn)錄模塊餐曼，它在小膠質(zhì)細(xì)胞中被觸發(fā)以響應(yīng)insults压储，而不管這種情況的性質(zhì)如何insults鲜漩。這些相似性為慢性腦炎癥背后的機(jī)制提供了新的見解。

Method(關(guān)注一下單細(xì)胞空間聯(lián)合)

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